生弘杰，盧素文，鄭暄昂，賈海鋒，房經(jīng)貴

基于廣泛靶向代謝組學的葡萄種子代謝物鑒定與比較分析

生弘杰2，盧素文1，鄭暄昂1，賈海鋒1，房經(jīng)貴1

1南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，南京 210014

【】葡萄種子因富含多種代謝產(chǎn)物而具有較高生物活性。全面鑒定葡萄種子中代謝物組分，比較分析不同品種間代謝物差異，探討葡萄種子代謝物與果皮顏色和品種起源之間的關(guān)系，為深入開發(fā)和利用葡萄種子提供參考依據(jù)。【】以紫紅色歐美種葡萄‘巨峰’、淺紅色歐亞種葡萄‘魏可’和黃綠色歐亞種葡萄‘黃意大利’成熟期種子為材料，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）進行廣泛靶向代謝組學分析，采用多元統(tǒng)計學等方法鑒定和比較代謝物?！尽看x組學數(shù)據(jù)質(zhì)量好，組內(nèi)樣品重復(fù)性較好，組間樣品存在差異。3個葡萄品種種子中共檢測到514個代謝物，包括氨基酸、脂類等6類初生代謝物和原花青素、白藜蘆醇等20類次生代謝物。不同品種間代謝物種類相似，但含量差異顯著。大多數(shù)代謝物的相對含量在深色品種‘巨峰’種子中較高，在淺色品種‘魏可’種子中次之，在無色品種‘黃意大利’種子中較低，表明葡萄種子代謝物含量可能與果皮顏色呈正相關(guān)?！嚎伞汀S意大利’種子代謝物的相對含量較為相近，而均與‘巨峰’種子代謝物的相對含量差異較大，表明葡萄種子代謝物含量可能與品種起源有關(guān)。不同葡萄品種間的差異代謝物主要涉及苯丙烷生物合成、花青素合成和脂類代謝等途徑。差異代謝物中酚類物質(zhì)較多，且差異倍數(shù)最大的代謝物以類黃酮為主。葡萄種子中酚類和脂類物質(zhì)種類非常豐富，除了單體黃烷-3-醇及其聚合物外，黃酮和黃酮醇等酚類物質(zhì)的相對含量也較高；白藜蘆醇在3個品種間沒有顯著差異；溶血磷脂酰膽堿等甘油磷脂含量較高，亞麻酸含量較低，不同品種間脂類物質(zhì)的相對含量差異較小?！尽坎煌咸哑贩N種子中代謝物種類類似，但含量與果皮顏色和品種起源有關(guān)。酚類和脂類物質(zhì)是葡萄種子代謝物的重要組分，可作為食品等加工行業(yè)的良好來源。

葡萄；種子；代謝組學；代謝物；酚類；脂類

0 引言

【研究意義】葡萄是世界性重要果樹之一，具有鮮食、釀酒、制汁等多種用途，在果樹產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。種子作為葡萄加工生產(chǎn)的副產(chǎn)物，富含多種生物活性物質(zhì)，包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素、原花青素和白藜蘆醇等，因而具有極高的營養(yǎng)和保健價值[1]。葡萄種子中多酚類天然抗氧化物的種類和含量比果皮和果肉更豐富，這些多酚類化合物不僅影響葡萄酒的外觀和口感，還會影響其營養(yǎng)保健功效[2-3]。已有大量研究證實，葡萄種子提取物，尤其是原花青素在提高人體免疫力和預(yù)防心血管疾病等方面效果顯著[4-5]。因此，系統(tǒng)分析葡萄種子中代謝產(chǎn)物，為深入開發(fā)和利用葡萄種子提供指導(dǎo)，將會增加葡萄產(chǎn)業(yè)的附加值，提高社會和經(jīng)濟效益?！厩叭搜芯窟M展】前人對葡萄種子中多酚尤其是原花青素和單寧的研究相對較多。Liang等[6]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）方法在17個葡萄品種91份種質(zhì)的種子中鑒定到11個多酚化合物，其中最豐富的是單體黃烷-3-醇，其次是二聚黃烷-3-醇和三聚黃烷-3-醇，占總多酚的96%以上。非生物脅迫誘導(dǎo)葡萄漿果種子中的次級代謝物積累[7-8]；然而，GOUOT等[9]認為短期高溫處理抑制果實和種子發(fā)育，導(dǎo)致種子單寧含量顯著降低。葡萄種子中原花青素的積累獨立于果皮，種子中原花青素積累主要發(fā)生在坐果后，而果皮中原花青素積累發(fā)生在坐果后1—2周，均在轉(zhuǎn)色期達到最高水平；原花青素亞基組成在種子和果皮中存在差異，果皮中單寧聚合物的平均聚合程度高于種子[10]。PRIEUR等[11]從葡萄種子中分離得到5個單寧組分，所有組分均由兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯單元組成，平均聚合度為2.3—15.1。葡萄果實中氮化物含量影響酒精發(fā)酵和葡萄酒品質(zhì)。葡萄果肉和種子中硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、總氮含量隨果實發(fā)育逐漸升高，直至成熟時期趨于穩(wěn)定；且種子中氮化物含量高于果肉，種子中總氮含量約占整個漿果總氮含量的50%[12]。盡管目前對葡萄種子中多酚等物質(zhì)已有了解，但是從代謝組學的角度全面鑒定葡萄種子化合物特征的研究卻鮮見報道。廣泛靶向代謝組學具有高通量、超靈敏、廣覆蓋和高精度的特點，通過建立數(shù)據(jù)庫、MRM檢測和數(shù)據(jù)分析進行代謝物組分鑒定和相對含量分析[13-14]。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于枸杞[15]、甘薯[16]、茶[17]等園藝作物中。例如，閆樂樂等[18]利用廣泛靶向代謝組學解析桃蚜危害對桃樹次生代謝產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)酚酸等代謝物的變化可能與桃蚜抗性有關(guān)。ZOU等[19]利用廣泛靶向代謝組學技術(shù)，發(fā)現(xiàn)碳水化合物、有機酸、氨基酸、酚類物質(zhì)組成和豐度變化可能與枇杷果實風味有關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】筆者課題組前期利用廣泛靶向代謝組學技術(shù)，發(fā)現(xiàn)類黃酮代謝在不同著色類型的葡萄果皮和果肉中存在較大差異，花青素與其他分支類黃酮化合物的相對含量呈正相關(guān)[20]。本研究通過廣泛靶向代謝組學技術(shù)，全面鑒定葡萄種子代謝物種類，并系統(tǒng)分析不同品種間種子代謝物差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選取3個不同果皮顏色和品種起源的葡萄品種，采用基于液質(zhì)聯(lián)用的廣泛靶向代謝組學技術(shù)，鑒定和比較分析成熟期種子中代謝物組分和相對含量，為葡萄種子開發(fā)和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 代謝物提取

利用研磨儀（MM400，Retsch）將真空冷凍干燥后的樣品研磨至粉末狀，稱取100 mg粉末，溶解于1.0 mL 70%甲醇提取液中，4℃浸提過夜，期間渦旋多次，以提高提取率。提取液經(jīng)10 000×離心10 min后，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（Tan-dem mass spectrometry，MS/MS）。液相色譜條件：C18色譜柱（waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm×100 mm）。流動相水相為超純水（含0.04%乙酸），有機相為乙腈（含0.04%乙酸）。洗脫梯度0 min為水/乙腈（95﹕5，V/V），11.0 min為5﹕95，12.0 min為5﹕95，12.1 min為95﹕5，15.0 min為95﹕5。流速0.4 mL?min-1；柱溫40℃；進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度500℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣（curtain gas，CUR）25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（colision-activated dissociation，CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿（QQQ）中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去族電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）進行掃描檢測[12]。

JFS：巨峰；WKS：魏可；YDS：黃意大利。標尺為1 cm。下同

1.4 代謝物定性與定量分析

定性分析：利用軟件Analyst 1.6.1采集數(shù)據(jù)，基于代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫及代謝組平臺標準物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進行物質(zhì)定性，分析時去除同位素信號，含K+、Na+、NH4+的重復(fù)信號及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。

定量分析：利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析完成。MRM模式中，四級桿首先篩選目標物質(zhì)的前體離子（母離子），排除掉其他分子量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標離子干擾，使定量更為精確，重復(fù)性更好。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正。

1.5 差異代謝物篩選

采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型第1主成分變量重要性值投影值（VIP≥1）、差異倍數(shù)值（FC≥2或≤0.5）以及t檢驗的值（-value≤0.5）來篩選差異代謝物。

1.6 數(shù)據(jù)處理和多元統(tǒng)計分析

采用SIMCA-P+14.1軟件進行主成分分析（PCA）；將代謝物含量數(shù)據(jù)采用極差法進行歸一化處理后，利用R軟件進行聚類分析（HCA）；采用SPSS軟件進行單因素方差分析（ANOVA）；采用Excel 2016軟件繪制相關(guān)圖表；采用KEGG進行代謝通路富集分析。

隨著我國對外開放不斷擴大，“走出去”的中國國有企業(yè)已經(jīng)成為促進中國與國際社會溝通合作的重要渠道，中國品牌成為國際社會認識中國、了解中國的重要窗口。打造世界一流品牌，塑造國企海外良好形象，是中國國家形象和企業(yè)發(fā)展的重要組成部分。在國際社會有效塑造中國國企品牌的知名度和美譽度，是國有企業(yè)海外形象塑造工程的一個長期課題。

2 結(jié)果

2.1 代謝組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

2.1.1 樣品質(zhì)控分析 利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。葡萄種子混樣質(zhì)控樣品的總離子流圖重疊展示如圖2所示，代謝物檢測總離子流曲線重疊性較高，保留時間和峰強度較一致，同一樣品不同時間檢測時的信號均較穩(wěn)定，色譜峰基線平穩(wěn)且色譜峰被有效分離，可見該儀器穩(wěn)定性高，數(shù)據(jù)重復(fù)性和可靠性強。

圖2 葡萄種子樣品質(zhì)譜檢測總離子流重疊圖（TIC）

2.1.2 數(shù)據(jù)整體分析 用皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析組間和組內(nèi)樣本間相關(guān)性（圖3-A），不同樣本間相關(guān)系數(shù)均在0.88以上，同時組內(nèi)樣品相對組間樣品的相關(guān)系數(shù)較高，說明獲得的代謝物可靠，不同樣本間代謝物相關(guān)性較強。

將代謝物數(shù)據(jù)進行歸一化處理后，對所有樣品進行聚類分析。結(jié)果顯示，‘魏可’和‘黃意大利’聚在一起，說明兩個品種中代謝物積累模式更相似。不同品種間代謝物相對含量有較明顯的差異（圖3-B）。

為了解組間和組內(nèi)樣品之間的變異度，對樣品進行PCA分析（圖3-C），第一主成分PC1和第二主成分PC2的貢獻率分別為43.35%和24.44%，兩個主成分能基本反映葡萄種子的主要特征信息。組內(nèi)樣本間變異度均較小，說明組內(nèi)重復(fù)性好；組間樣本代謝物呈分離趨勢，說明不同品種種子代謝物具有明顯差異?！嚎伞╓KS）與‘黃意大利’（YDS）距離較近，均與‘巨峰’（JFS）距離較遠，表明‘魏可’和‘黃意大利’種子間代謝物差異較小。質(zhì)控樣品mix也被一起分組，表明試驗條件穩(wěn)定、可重復(fù)。

圖3 樣品間相關(guān)性分析（A）、聚類分析（B）、PCA分析（C）和OPLS-DA模型圖（D）

根據(jù)OPLS-DA模型分析代謝組數(shù)據(jù)，用R2X、R2Y和Q2作為評價模型的預(yù)測參數(shù)，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測能力。如圖3-D所示，這3個指標均接近于1，表示模型穩(wěn)定可靠，且Q2＞0.9，表示該模型非常出色，可根據(jù)VIP值篩選差異代謝物。

2.2 葡萄種子代謝物種類鑒定與比較分析

基于UPLC-MS/MS檢測平臺、代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫以及多元統(tǒng)計分析相結(jié)合的方法，在葡萄種子中共檢測到514個代謝物，其中‘巨峰’491個，‘魏可’494個，‘黃意大利’487個。這些代謝物分為27類，包括6類初生代謝物、20類次生代謝物（包括11類多酚物質(zhì)）以及其他物質(zhì)。初生代謝物中氨基酸種類最多，達79種，占27.62%；其次依次是脂類、有機酸、核苷酸、糖類和醇類。次生代謝物中類黃酮物質(zhì)種類最多，高達112種（黃酮38種、黃酮醇30種、黃烷酮15種、兒茶素11種、花青素8種、異黃酮6種、原花青素4種），占54.90%；其次是酚酸類化合物，包括羥基肉桂酰衍生物、苯甲酸、奎寧酸和香豆素，共44種；維生素和酚胺類物質(zhì)（11—13種）也較豐富，吲哚、生物堿、色胺、膽堿、吡啶、煙酸和萜類物質(zhì)種類較少，僅2—5種；此外還有24種其他物質(zhì)無法歸類?！薹濉嚎伞汀S意大利’種子中代謝物種類相似，但個別有差異。例如，‘魏可’種子中能檢測到8種花青素，‘巨峰’中檢測到6種，而‘黃意大利’中僅檢測到5種（表1）。

2.3 葡萄種子差異代謝物鑒定與比較分析

2.3.1 差異代謝物整體分析

2.3.1.1 火山圖分析 對不同葡萄品種種子間代謝物相對含量進行比較分析，根據(jù)VIP≥1，且<0.05篩選組間差異代謝物，并進行變化差異倍數(shù)分析。通過火山圖查看代謝物在兩個樣品中表達水平的差異，以及差異的統(tǒng)計學顯著性（圖4）。結(jié)果顯示，‘巨峰’和‘黃意大利’之間（JFS vs YDS）差異代謝物數(shù)目最多，有189個，包括上調(diào)代謝物70個和下調(diào)代謝物119個；其次是‘巨峰’和‘魏可’（JFS vs WKS），有170個，包括上調(diào)代謝物71個和下調(diào)代謝物99個；‘魏可’和‘黃意大利’之間（WKS vs YDS）差異代謝物數(shù)目最少，有121個，包括上調(diào)代謝物40個和下調(diào)代謝物81個。3個比較組中差異代謝物均以下調(diào)為主，JFS vs YDS、JFS vs WKS和WKS vs YDS中下調(diào)代謝物分別占62.96%、58.24%和66.94%。差異不顯著的代謝物均有300多個。

表1 葡萄種子代謝物種類及數(shù)目

2.3.1.2 聚類熱圖分析 對差異代謝物峰面積數(shù)據(jù)歸一化處理后進行聚類熱圖分析，觀察代謝物變化規(guī)律。如圖5所示，3個比較組中差異代謝物被分為2大類，大部分差異代謝物在‘巨峰’中高積累，其次是‘魏可’，在‘意大利’中含量最低；并且‘魏可’和‘黃意大利’種子間差異代謝物相對較少。

火山圖中的每一個點表示一種代謝物，橫坐標表示某代謝物在兩樣品中定量差異倍數(shù)的對數(shù)值；縱坐標表示VIP值。紅色、綠色和灰色的點分別代表上調(diào)、下調(diào)和差異不顯著的代謝物

x軸表示樣品，y軸表示差異代謝物。代謝物濃度的變化由色標表示

2.3.1.3 韋恩圖分析 差異代謝物韋恩圖分析（圖6）結(jié)果顯示，3個比較組之間共有差異代謝物32個，JFS vs WKS、WKS vs YDS 和JFS vs YDS分別各有28個、28個和46個特異的差異代謝物。其中，JFS vs WKS與JFS vs YDS共有差異代謝物最多（112個），JFS vs WKS與WKS vs YDS、WKS vs YDS與JFS vs YDS共有差異代謝物分別為62個和63個，進一步表明‘魏可’與‘黃意大利’之間的代謝物含量較為相近，且均與‘巨峰’差異較大。對32個共有差異代謝物進行分類，其中差異個數(shù)最多的化合物是羥基肉桂酰衍生物，有7個；其次是氨基酸類、核苷酸類和有機酸類，均有4個；花青素和黃酮分別有2個和3個，黃酮醇等其他類物質(zhì)各有1個。有3個共有差異代謝物在3個比較組中均呈現(xiàn)出積累上調(diào)（up），有15個共有差異代謝物在3個比較組中均呈現(xiàn)出積累下調(diào)（down）（表2），表明這些差異代謝物的積累可能與果皮顏色存在一定的關(guān)系。

2.3.1.4 KEGG代謝通路富集分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析，結(jié)果顯示JFS vs WKS、WKS vs YDS 和JFS vs YDS三個比較組差異代謝物分別被注釋到147、173和209條代謝途徑上，其中被KEGG注釋到的代謝途徑（ko01100）尤其是植物次生代謝途徑（ko01060）下的代謝物數(shù)目最多。差異代謝途徑主要分布在氨基酸代謝（C1）、類黃酮代謝（C2）、有機酸代謝（C3）、生物堿合成（C4）、脂肪酸代謝（C5）和糖代謝（C6）等通路中。其中，苯丙烷合成和花青素合成途徑在JFS vs WKS、JFS vs YDS和WKS vs YDS中均顯著富集（圖7）。

圖6 差異代謝物Venn圖

x軸為差異代謝物的富集因子，y軸為KEGG通路。富集因子表示通路中富集的差異代謝物數(shù)量與總代謝物數(shù)量之比。每個通路中富集的差異代謝物的數(shù)量顯示在相應(yīng)的柱上

2.3.2 差異代謝物種類比較分析 對差異代謝物的種類進行比較分析，結(jié)果顯示3個比較組的差異代謝物種類分布類似，主要是氨基酸、脂類、有機酸、核苷酸、黃酮、黃酮醇和羥基肉桂酰衍生物類物質(zhì)，其中多酚類物質(zhì)（包括類黃酮和酚酸類）分別占JFS vs WKS、WKS vs YDS和JFS vs YDS所有差異代謝物的38.82%、38.84%和34.92%。大多數(shù)差異代謝物在3個比較組中均表現(xiàn)下調(diào)。例如，JFS vs WKS、WKS vs YDS、JFS vs YDS三個比較組中差異脂類物質(zhì)分別有61.11%、88.89%、77.78%表現(xiàn)下調(diào)，差異羥基肉桂酰類衍生物分別有85.71%、88.89%、84.62%表現(xiàn)下調(diào)。香豆素、膽堿和吡啶的相對含量在3個品種中均沒有顯著差異（表3）。

2.3.3 差異代謝物相對含量比較分析 分別列舉3個比較組中變化倍數(shù)最大的前10個上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物（圖8）。3個比較組中差異倍數(shù)最大的代謝物均有較多屬于類黃酮（JFS vs WKS有10個，JFS vs YDS有12個，WKS vs YDS有9個），包括花青素類的天竺葵色素苷、黃酮類的麥黃酮已糖苷、黃酮醇類的甲基槲皮素以及黃烷酮類的7-氧甲基圣草酚；其次為核苷酸類和有機酸類物質(zhì)。此外，JFS vs WKS和JFS vs YDS共有9個差異倍數(shù)最大的代謝物，包括天竺葵色素苷、菠菜素、氧甲基柚皮素-戊糖苷等。例如，在JFS vs WKS和JFS vs YDS比較組中，黃酮碳糖苷類6--己糖苷-芹菜素-阿魏酰己糖苷均顯著下調(diào)，Log2變化倍數(shù)達17.19；而花青素類天竺葵色素苷均顯著上調(diào)，Log2變化倍數(shù)達16.3倍。此外，JFS vs WKS比較組中前10個上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物Log2變化倍數(shù)均達到10倍以上。

表3 葡萄種子間差異代謝物種類及數(shù)目

2.4 葡萄種子中重要代謝物種類和相對含量分析

2.4.1 多酚類物質(zhì) 葡萄種子是多酚的重要來源，種子提取物以及衍生產(chǎn)品（如葡萄酒）的保健價值主要歸因于其多酚化合物[5]。利用廣泛靶向代謝組學技術(shù)，本研究鑒定到156種多酚類物質(zhì)，包括112種類黃酮和44種酚酸類物質(zhì)。利用熱圖展示3個品種間所有差異代謝物的差異倍數(shù)，結(jié)果顯示大部分代謝物在品種間差異倍數(shù)較小，且在比較組中呈現(xiàn)出積累下調(diào)；芍藥花青素-己糖苷、天竺葵色素苷等代謝物在品種間差異倍數(shù)較大；2種原花青素和4種兒茶素衍生物類物質(zhì)在品種間存在顯著性差異，但差異倍數(shù)均較小（圖9）。表4列舉了每個類別中相對含量較高的前3種物質(zhì)以及一些在不同品種間差異倍數(shù)較大的多酚類物質(zhì)。結(jié)果顯示，矢車菊素糖苷、原兒茶醛、原花青素B2、木犀草苷、染料木苷、三葉豆甙、橙皮素 5--葡萄糖苷、2,5-二羥基苯甲酸-己糖苷、奎寧酸、松柏醛等物質(zhì)在3個品種中均含量較高。此外，還有部分多酚類物質(zhì)僅在某個品種中被檢測到，例如天竺葵素-3--葡萄糖苷僅在‘魏可’中相對含量較高，在‘巨峰’和‘黃意大利’中幾乎檢測不到；花青素苷和金圣草黃素7--蕓香糖苷僅存在于‘巨峰’和‘魏可’種子中，而7-氧甲基圣草酚僅存在于‘黃意大利’種子中。

白藜蘆醇（3,5,4'-三羥基二苯乙烯）是一種非黃酮類多酚化合物，是葡萄種子重要的活性物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)和保健價值。代謝組學結(jié)果顯示，白藜蘆醇在‘巨峰’‘魏可’和‘黃意大利’中的相對含量分別是8.71×105、6.19×105、和5.17×105，3個品種間沒有顯著差異（表4）。

表4 葡萄種子中重要多酚類物質(zhì)

續(xù)表4 Continued table 4

“—”表示沒有顯著性差異。下同 “—” represents no significant difference. The same as below

代謝物濃度的變化由色標表示 Changes in metabolite concentration is indicated by color scales

2.4.2 脂類物質(zhì) 葡萄種子中含有豐富的脂肪酸類物質(zhì)，含油量與玉米胚芽和大豆的含油量相近，必需脂肪酸亞油酸含量非常高，被認定是一種營養(yǎng)價值豐富的優(yōu)質(zhì)食用油[21]。本研究鑒定到65種脂類物質(zhì)，包括33種甘油磷脂、15種甘油酯和17種脂質(zhì)-脂肪酸。對葡萄種子中脂類物質(zhì)相對含量進行比較分析，表4列舉了每個類別中相對含量較高的前3種物質(zhì)。結(jié)果顯示，溶血磷脂酰膽堿、單酰甘油酯和十八碳三烯酸等物質(zhì)在3個品種中的含量均較高，亞麻酸含量較低（104左右）。一些脂類物質(zhì)的相對含量在不同品種間存在顯著差異，但差異倍數(shù)均較?。ū?）。

3 討論

3.1 葡萄種子代謝物含量與果皮顏色和品種起源有關(guān)

葡萄種子中代謝物種類豐富[1,3]。本研究采用基于UPLC-MS/MS檢測平臺、自建數(shù)據(jù)庫以及多元統(tǒng)計分析相結(jié)合的手段，研究不同葡萄品種成熟期種子中代謝物組分和含量的差異，方法可靠性高，準確性好，穩(wěn)定性強，可以將不同品種葡萄種子代謝物組分進行有效區(qū)分。相關(guān)性分析、聚類分析、PCA分析和OPLS-DA分析結(jié)果均表明，組內(nèi)樣品重復(fù)性較好，組間樣品存在差異。3個葡萄品種種子中共檢測到代謝物27類514種，其中初生代謝物以氨基酸為主，次生代謝物以多酚類物質(zhì)為主。不同葡萄品種種子中代謝物組成相似，但含量差異顯著，形成葡萄品種差異化和種質(zhì)資源多樣化的特點。

差異代謝物分析結(jié)果顯示，3個葡萄品種種子中差異代謝物主要是氨基酸、脂類、黃酮醇和羥基肉桂酰衍生物等物質(zhì)，其中酚類物質(zhì)占比較高。大多數(shù)代謝物的相對含量在深色品種‘巨峰’種子中積累較高，在淺色品種‘魏可’種子中次之，在無色品種‘黃意大利’種子中積累較低。這表明，葡萄種子代謝物含量可能與果皮顏色呈正相關(guān)。次生代謝物是以初生代謝物為前體合成的，本研究不僅發(fā)現(xiàn)‘巨峰’‘魏可’和‘黃意大利’兩兩比較組中大多數(shù)酚類等次生代謝物含量表現(xiàn)下調(diào)，還發(fā)現(xiàn)脂類等初生代謝物含量表現(xiàn)下調(diào)。GUENDEZ等[22]報道12個白葡萄品種和15個紅葡萄品種種子中沒食子酸的平均含量分別為0.036和0.052 mg?g-1FW。這些結(jié)果表明，深色葡萄品種中代謝途徑可能相對更活躍。另外，‘魏可’和‘黃意大利’種子代謝物含量較為相近，而均與‘巨峰’差異較大。由于‘巨峰’為歐美品種，而‘魏可’和‘黃意大利’均為歐亞品種，因而葡萄種子代謝物含量可能與品種起源有關(guān)。

3.2 酚類和脂類物質(zhì)是葡萄種子代謝物的重要組分

代謝通路富集分析結(jié)果顯示，差異代謝物主要以次生代謝途徑為主，且苯丙烷合成途徑和類黃酮代謝途徑在3個比較組中均顯著富集。差異代謝物和變化倍數(shù)最大的差異代謝物分析結(jié)果進一步證實，不同品種間差異代謝物均以酚類為主。這表明，酚類化合物是影響葡萄種子代謝物的重要組分。葡萄種子中含有豐富的多酚類物質(zhì)，尤其是單體黃烷-3-醇和低聚原花青素[2-4]。原花青素經(jīng)氧化后，使大多數(shù)葡萄種皮呈深棕色。Liang等[6]在17個葡萄種91份種質(zhì)的種子中鑒定到11個多酚化合物，包括2個沒食子衍生物、3個黃烷-3-醇單體、3個黃酮醇、白藜蘆醇、原花青素B1和B2，以及17種二聚和三聚黃烷-3-醇，這些化合物在種間和種內(nèi)都有較大差異，單體黃烷-3-醇及其聚合物是種子中最豐富的多酚。本研究采用廣泛靶向代謝組學的方法，在葡萄種子中鑒定到156種多酚類物質(zhì)，數(shù)量上遠遠增加。研究發(fā)現(xiàn)‘赤霞珠’‘黑比諾’‘霞多麗’等葡萄種子中原花青素B2含量高于原花青素B1[23-24]。LIANG等[6]檢測發(fā)現(xiàn)葡萄種子中主要的二聚體類型是原花青素B1，占總二聚黃烷-3-醇的25%，原花青素B2占總二聚黃烷-3-醇的比例不超過3.5%。本研究共檢測到4種原花青素，但沒有檢測到原花青素B1；原花青素B2在3個品種中含量均較高。這些結(jié)果的差異可能與分析方法、栽培生長條件、漿果生理條件和采樣時期等因素有關(guān)，也可能是由于不同品種間的遺傳差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，葡萄種子中除了單體黃烷-3-醇和聚合物原花青素外，黃酮和黃酮醇等酚類物質(zhì)的含量也均較高。部分酚類物質(zhì)僅在某個品種中特異性積累，這些特異代謝物可作為葡萄品種鑒定的依據(jù)。

單寧包括縮合單寧（多聚物）和可水解單寧?？s合單寧是黃烷醇衍生物，由于分子量太大（一般1 000 Da以上）導(dǎo)致廣泛靶向代謝組學技術(shù)無法檢測到。然而，該技術(shù)能檢測到的單寧代謝通路的小分子物質(zhì)包括莽草酸、1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟?、沒食子酸、鞣花酸、1--沒食子?；?--葡萄糖、1,2,6-三--沒食子?；?--葡萄糖、1,2,3,6-四--沒食子?；?--葡萄糖等。本研究共檢測到11種兒茶素及其衍生物，與前人研究結(jié)果一致[6,22]，同時發(fā)現(xiàn)原兒茶醛等沒食子酸衍生物在3個品種中的相對含量均較高。鞣花酸屬于其他類物質(zhì)，且僅在‘巨峰’和‘黃意大利’品種間存在顯著性差異（數(shù)據(jù)未提供）。

白藜蘆醇具有較強的抗癌和抗炎生物活性。對植物而言，白藜蘆醇是一種重要的植保素，可增強植株抗病性[25]，關(guān)于葡萄種子中白藜蘆醇的作用目前尚沒有明確闡述。多項研究表明，白藜蘆醇在不同品種不同組織中含量差異較大，總體而言，白藜蘆醇主要存在于葉片、果皮和種子中，且砧木品種高于其他栽培品種[26]。LIANG等[6]發(fā)現(xiàn)91份葡萄種質(zhì)的種子中白藜蘆醇含量從0—0.010 mg?g-1FW。LI等[27]測定了120個葡萄種質(zhì)果皮和種子中白藜蘆醇含量，發(fā)現(xiàn)除少數(shù)品種含量較高外，大部分品種的果皮和種子中白藜蘆醇含量小于2 μg?g-1FW，本研究也發(fā)現(xiàn)3個品種種子中白藜蘆醇相對含量均不高。LIANG等[6]發(fā)現(xiàn)每一種酚類物質(zhì)含量與總酚含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，但是白藜蘆醇與其他酚類物質(zhì)含量之間相關(guān)性較低。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)3個品種種子中酚類物質(zhì)的相對含量存在較大差異，但是白藜蘆醇的相對含量卻沒有明顯差異。包括白藜蘆醇在內(nèi)的芪類化合物是植物苯丙氨酸代謝途徑的下游產(chǎn)物，合成過程受到苯丙氨酸裂解酶、芪合酶（STS）等多種酶的調(diào)控，其中STS是芪類化合物合成的限速酶，其表達受多種逆境脅迫誘導(dǎo)[28]。這些結(jié)果是否與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平有關(guān)還需要進一步的驗證。

脂類物質(zhì)是植物細胞的組成部分，具有重要的生物學功能。盡管這些化合物在葡萄漿果中起著重要作用，但對葡萄脂質(zhì)組成的認識尚且有限。前人研究表明，葡萄種子含有較高比例的不飽和脂肪酸（約60%），其中亞油酸在種子脂肪酸組成中占主導(dǎo)地位[29]。亞油酸含量高，亞麻酸含量低，-谷甾醇為主要甾醇[30]。不同葡萄品種間含油量差異較大，各基因型飽和脂肪酸值均低于單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸值；各品種脂肪酸中以亞油酸（C18:2）為主，其次為油酸（C18:1）和棕櫚酸（C16:0）[31-32]。與前人研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)葡萄種子中甘油磷脂含量較高，亞麻酸含量較低，甘油磷脂、甘油酯和脂肪酸的種類也非常豐富。

4 結(jié)論

通過對不同果皮顏色的葡萄品種成熟期種子代謝產(chǎn)物的鑒定和比較分析，發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種種子中代謝物組分類似，但含量與果皮顏色和品種起源有關(guān)。本研究中3個品種表現(xiàn)為，果皮顏色越深，葡萄種子中代謝物含量越高；同一起源的品種間代謝物含量相似。酚類和脂類物質(zhì)是葡萄種子代謝物的重要組分，由于其生物活性顯著，葡萄籽可作為食品、制藥和化妝品的良好來源。由于種子代謝物組分受多種因素綜合影響，果皮顏色形成機理復(fù)雜多樣，調(diào)查樣本需進一步擴大，為葡萄種子代謝物差異化分析，開發(fā)和利用葡萄種子提供更多參考。

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Identification and Comparative Analysis of Metabolites in Grape Seed Based on Widely Targeted Metabolomics

SHENG HongJie2, LU SuWen1, ZHENG XuanAng1, JIA HaiFeng1, FANG JingGui1

1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Institute of Food Safety and Nutrition, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014

【】Grape seeds have high bioactivity because they are rich in many metabolites. The objective of this study was to comprehensively identify the metabolite components in grape seeds, to compare and to analyze the differences of metabolites among different varieties, and to explore the relationship between metabolites in grape seeds and skin color and variety origin, so as to provide a reference basis for further development and utilization of grape seeds. 【】The mature seeds of purple-skinned Kyoho (:×, JFS), pink-skinned Wink (, WKS), and yellow-skinned Italia (, YDS) were used for widely targeted metabolomics analysis by UPLC-MS/MS. The metabolites were identified and compared by multivariate statistical methods. 【】The quality of metabolomics data was good, and the data of samples within groups was repetitive and the differences in the data of samples among groups were existed. A total of 514 metabolites were identified in the seeds of three grape varieties, including 6 primary metabolites, such as amino acids and lipids, and 20 secondary metabolites, such as proanthocyanidins and resveratrol. Among different varieties, the metabolite components were similar but the metabolite contents were significantly different. The relative contents of most metabolites were high in the dark variety Kyoho, followed by the light variety Wink, but low in the colorless variety Italy, indicating that the metabolite contents in grape seeds might be positively correlated with the skin color. The relative contents of metabolites in the seeds of Wink and Italia were similar, while they were greatly different from those of Kyoho, indicating that the metabolite contents in grape seeds might be related to the variety origin. The differential metabolites among different varieties were mainly involved in phenylpropane biosynthesis, anthocyanin synthesis, lipid metabolism, etc. pathway. There were many phenolic compounds in the differential metabolites and the metabolites with the large difference were mainly flavonoids. Grape seeds were rich in phenols and lipids. In addition to monomeric flavane-3-ols and their polymers, the relative contents of other phenolic compounds such as flavones and flavonols were also high. There was no significant difference in the relative contents of resveratrol among the three varieties. The relative contents of glyceryl phosphatide such as lysophosphatidylcholine were high, while those of linolenic acid were low. There was little difference in the relative contents of lipids among different varieties. 【】The metabolite components in grape seeds of different varieties were similar, while the metabolite contents were related to the skin color and the variety origin. Phenols and lipids were important components of metabolites in grape seeds and could be used as good sources for food and other processing industries.

grape (); seed; metabolomics; metabolite; phenol; lipid

2022-05-20；

2022-08-17

國家自然科學基金（31901991）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX(21)3023）

生弘杰，E-mail：hjsheng@jaas.ac.cn。通信作者盧素文，E-mail：lusuwen@njau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）