【摘要】" 目的" 通過觀察不同濃度的香煙煙霧提取物（cigarette smoking extract，CSE）對正常及肺纖維化大鼠肺成纖維細胞的影響，探討香煙煙霧與肺纖維化的可能關(guān)系。方法" 體外培養(yǎng)的正常及博萊霉素造模的肺纖維化大鼠的肺成纖維細胞，分別以不同濃度（25％、50％、100％）的CSE作用12h和24h。噻唑藍還原法（MTT法）檢測吸光值；流式細胞儀法觀察細胞壞死與凋亡情況及細胞周期S期（DNA合成期）和G1期（DNA合成前期）的比值。結(jié)果" 高濃度（100％）的CSE主要引起兩種大鼠肺成纖維細胞的壞死。較低濃度（25％、50％）的CSE對正常大鼠肺成纖維細胞無明顯影響（Pgt;0.05）。較低濃度（25％、50％）的CSE作用于造模大鼠肺成纖維細胞12h及24h后，吸光值較對照組顯著增高（Plt;0.05），且與時間和濃度有相關(guān)性（Plt;0.05）。進一步檢測細胞周期顯示S期/G1期的比值增高（Plt;0.05）。結(jié)論" 高濃度的CSE會引起肺成纖維細胞的壞死。一定濃度范圍內(nèi)的CSE對纖維化大鼠肺成纖維細胞能通過促進細胞進入S期而具有促進增殖作用，且與時間和濃度呈正相關(guān)性，而對正常大鼠肺成纖維細胞無明顯影響。提示香煙煙霧可以促進肺纖維化。

【關(guān)鍵詞】" 香煙煙霧；肺成纖維細胞；肺纖維化

中圖分類號" R563;R-332" " 文獻標(biāo)識碼" A" " 文章編號" 1671-0223（2023）24--04

香煙煙霧是有眾多化學(xué)成分的復(fù)雜混合物，超過6000種成分，會對肺臟和全身產(chǎn)生有害影響。吸煙已被公認與多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，吸煙是肺癌的主要病因，也是慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等疾病的主要危險因素。如今，吸煙還被認為與某些間質(zhì)性肺病及肺纖維化有關(guān)[1]，但尚不清楚吸煙引起間質(zhì)性肺病的發(fā)病機制，對吸煙與肺纖維化關(guān)系的研究也很少。為此本研究利用體外培養(yǎng)的正常大鼠及肺纖維化大鼠的肺成纖維細胞，觀察不同濃度香煙煙霧提取物（cigarette smoking extract，CSE）對兩種細胞的影響，探討香煙煙霧在肺纖維化中所起的作用。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

1.1.1" 主要試劑" 博來霉素購自天津太河制藥有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國GIBCO公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；兔抗大鼠波動蛋白、纖維粘連蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司、第二抗體為羊抗兔IgG購自美國Jackson公司；化學(xué)試劑購自美國Sigma公司。

1.1.2" 儀器" 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國FORMA公司3112A型）；超凈工作臺、低溫冰箱（日本SANYO公司）；流式細胞儀（美國BD公司FACScan型）；倒置顯微鏡、高速離心機、細胞培養(yǎng)皿及細胞培養(yǎng)瓶（丹麥NUUC公司）。

1.1.3" 香煙" 為南京卷煙廠生產(chǎn)的南京牌高級過濾嘴香煙。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 動物造模" 選取SPF級雄性SD大鼠（由南京市鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供）20只，體重180±20g，隨機分為對照組、造模組，每組10只。對照組：氣管內(nèi)一次性注入等滲鹽水2ml/kg；造模組：在氣管內(nèi)一次性注射博來霉素5mg/kg。兩組老鼠均于造模后28天通過腹主動脈放血法處死，無菌條件下取出肺組織。所有大鼠右肺上葉留作組織病理切片，中性甲醛固定的右肺上葉，石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅（HE）染色評價肺組織病理變化，評定造模效果。其余肺組織留作肺成纖維細胞原代培養(yǎng)。

1.2.2" 大鼠肺成纖維細胞鑒定" 將傳代的肺成纖維細胞接種于置有多聚賴氨酸涂布的蓋玻片的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細胞鋪滿蓋玻片時，取出蓋玻片。用4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗3次。按免疫組化SABC法檢測肺成纖維細胞波動蛋白、纖維粘連蛋白、α-SMA的表達。

1.2.3" CSE的制備" 將香煙置于三通管一端，用50ml注射器通過三通管的另一端抽吸，滿50ml后將煙霧通過三通管第三端注入裝有100mlRPMI-1640無血清培養(yǎng)基的玻璃瓶內(nèi)，輕輕振蕩，使煙霧完全溶解。如此抽吸二管共100ml香煙煙霧。在超凈臺內(nèi)經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過后作為濃度為100%的CSE原液。并配成25%、50%的CSE溶液備用。

1.2.4" 噻唑藍還原法（MTT法）細胞增值檢測" 根據(jù)實驗設(shè)計分組，對照組分為：①正常細胞12h組；②正常細胞24h組。造模組分為：①造模細胞12h組；②造模細胞24h組。每組設(shè)0%CSE組、25%CSE組、50%CSE組、100%CSE組，每組6個復(fù)孔。上述試驗條件經(jīng)過多次預(yù)試驗篩選確定。將對數(shù)生長期的肺成纖維細胞以1×105/ml的密度接種于96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24h后加入無血清培養(yǎng)液同步化，吸去上清?？瞻讓φ占毎尤霟o血清培養(yǎng)液，其他細胞加入相應(yīng)的CSE，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)相應(yīng)時間（12h或24h）后，每孔加10μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去MTT，每孔加入150 μl二甲基亞砜，充分振蕩溶解。以測量波長570nm，參考波長630nm檢測各孔吸光值。

1.2.5" 流式細胞儀法測定細胞凋亡及壞死率" 將對數(shù)生長期的肺成纖維細胞以1×105/ml的密度接種于6孔板，每孔1ml，培養(yǎng)24h后加入無血清培養(yǎng)液使細胞同步化，吸去上清后加入等體積100%CSE或無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h后收集細胞，按ANNEXIN-V-FITC凋亡檢測試劑盒說明處理細胞后上機檢測。

1.2.6" 流式細胞儀法檢測細胞周期" 同樣方法處理及收集細胞后，將收集的細胞懸浮于4℃預(yù)冷的PBS中，緩慢加入70%預(yù)冷乙醇懸浮固定細胞，4℃過夜。檢測前用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，每一樣本中加100 td RNase，37℃中孵育15分鐘，再加200td碘化丙啶，室溫下避光5分鐘后上機檢測。

1.3" 數(shù)據(jù)分析處理方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用“±s”表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，方差分析后的兩兩比較以LSD檢驗；計數(shù)資料計算百分率，組間率的比較用χ2檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)果

3.1" 造模效果

對照組大鼠肺組織呈粉紅色，有彈性，表面光滑。肺纖維化造模組大鼠肺組織顏色灰暗，硬度增加，表面不平，體積較正常組小。鏡下正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)無破壞，肺泡腔大小均勻、完整，腔內(nèi)無滲出。肺纖維化造模組大鼠肺組織見肺泡腔變小，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔顯著增厚，炎癥細胞浸潤，成纖維細胞增多，膠原增生，符合纖維化肺組織鏡下改變。

3.2" 細胞鑒定結(jié)果

免疫組化染色陽性信號均為棕黃色顆粒，定位于胞漿?？梢妼φ战M肺組織成纖維細胞呈纖維粘連蛋白、波動蛋白陽性，肺纖維化造模組細胞除纖維粘連蛋白、波動蛋白陽性外，α-SMA染色明顯增強并持續(xù)表達，分為：正常組陰性對照、正常細胞組、造模組陰性對照、造模細胞組。見圖1。

3.3" 不同濃度CSE對體外培養(yǎng)大鼠肺成纖維細胞的影響

方差分析后的兩兩比較結(jié)果顯示，25%、50%CSE作用于正常大鼠肺成纖維細胞12h和24h后測定的吸光度值與0%CSE組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。而25%、50%的CSE作用于造模組大鼠肺成纖維細胞用12h及24h后測定的吸光度與對照組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。100%CES作用于正常大鼠及造模大鼠肺成纖維細胞12h及24h后吸光度與對照組相比均顯著降低（P=0.001，P=0.008）。提示一定濃度的CSE對纖維化大鼠肺成纖維細胞具有促進增殖的作用，而且在一定范圍內(nèi)與時間和濃度呈正相關(guān)，但對正常大鼠肺成纖維細胞則無此種影響；高濃度CSE則對所有肺成纖維細胞均有明顯抑制生長的作用。見表1。

3.4" 高濃度的CSE對大鼠肺成纖維細胞凋亡及壞死的影響

使用100%CSE作用于正常及肺纖維化造模大鼠肺成纖維細胞12h后，分別測定細胞的凋亡率和壞死率。四組大鼠凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），四組大鼠壞死率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），提示高濃度CSE抑制肺成纖維細胞增長是通過導(dǎo)致肺成纖維細胞壞死實現(xiàn)的，見表2。

3.5" CSE對造模大鼠肺成纖維細胞細胞周期的影響

用25%CSE作用于造模大鼠肺成纖維細胞12h及24h后測定細胞周期。結(jié)果顯示：細胞周期S期/G1期的比值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。提示一定濃度的CSE促進肺成纖維細胞增殖主要通過促進細胞由G1期（DNA合成前期）進入S期（DNA合成期）導(dǎo)致。見表3。

4" 討論

肺纖維化的發(fā)病機理，目前尚不完全明確。一般認為其發(fā)病機制包括肺泡上皮的損傷，成纖維細胞灶的形成以及細胞外基質(zhì)的過度沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化的形成[2]。早在70年代，就有實驗用狗證實了香煙能夠引起肺纖維化[3]。之后，也有很多關(guān)于吸煙與肺纖維化的研究。但這些研究主要關(guān)注吸煙通過各種機制引起肺泡上皮損傷[4]，關(guān)于吸煙對肺成纖維細胞影響的研究不多。

而最新的觀點認為，成纖維細胞灶主要由表達α-SMA的肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）構(gòu)成，可能是MFB凋亡受抑制或持續(xù)增殖所致[5]。經(jīng)氣管注入博萊霉素是復(fù)制肺纖維化動物模型的經(jīng)典方法并得到不斷的研究和改進[6-7]。同時借鑒Zhang等[8]用博萊霉素復(fù)制大鼠肺纖維化模型后，觀察到了大量高度表達α-SMA的細胞形成的結(jié)論。本實驗用氣管內(nèi)注射博來霉素的的方法復(fù)制大鼠肺纖維化模型。通過病理學(xué)證實了誘導(dǎo)大鼠肺纖維化成功。且隨后進一步細胞免疫組化顯示，造模組大鼠肺成纖維細胞與正常大鼠肺成纖維細胞相比，α-SMA染色明顯增強并持續(xù)表達，和Zhang等[8]的結(jié)果相似，說明博來霉素誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細胞向MFB轉(zhuǎn)分化，體外培養(yǎng)的博來霉素造模的大鼠肺成纖維細胞具有MFB表型特點。運用體外培養(yǎng)的這兩種有不同表型特點的大鼠肺成纖維細胞，觀察不同濃度CSE對它們的影響，探討香煙煙霧與肺纖維化的關(guān)系。

研究顯示，在體外，高濃度的香煙煙霧提取物對肺泡上皮細胞有毒性作用，能夠引起細胞壞死[9]。本實驗進一步證實了高濃度香煙煙霧同樣能引起肺成纖維細胞壞死。100％的CSE對兩種大鼠肺成纖維細胞生長均有顯著抑制作用，且進一步的流式細胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)這種抑制作用主要通過引起細胞壞死而并不是細胞凋亡實現(xiàn)的。

國外的研究同時還提示低濃度CSE可抑制肺成纖維細胞的修復(fù)和增殖，誘導(dǎo)凋亡。而更低濃度的CSE雖引起了肺成纖維細胞DNA破壞，但并未引起細胞凋亡，且當(dāng)去除CSE暴露后細胞得到修復(fù)并能重啟增殖[10]。本實驗參考和改進國外試驗方法，通過一系列預(yù)試驗，配制了合適的低濃度的CSE，結(jié)果顯示，合適的實驗濃度CSE對正常大鼠肺成纖維細胞沒有明顯造成促進或抑制生長的作用。且該濃度的CSE能被用來進一步用于肺成纖維細胞生長影響的研究。

國內(nèi)外較多研究香煙和博萊霉素對豚鼠肺纖維化的影響時發(fā)現(xiàn)，接受博萊霉素和香煙煙霧聯(lián)合處理的豚鼠較單用博萊霉素誘導(dǎo)的豚鼠，具有更廣泛的纖維化損傷和更明顯的α-SMA表達[11-12]。本實驗顯示，合適濃度的CSE對纖維化大鼠肺成纖維細胞具有促進增殖的作用，而且在一定范圍內(nèi)與時間和濃度有相關(guān)性。通過進一步的細胞周期檢測顯示，這種促進增殖的作用主要表現(xiàn)為促進大鼠肺成纖維細胞由G1期（DNA合成前期）進入S期（DNA合成期）。

合適濃度的CSE對兩種不同表型特點的大鼠肺成纖維細胞有不同作用的原因，可能是由于MFB與普通的成纖維細胞相比，具有強大的合成分泌功能，能產(chǎn)生多種細胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、血小板源性生長因子（PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等[13]。

國內(nèi)外的研究證實[14]，用氧化的胱氨酸、半胱氨酸作用于肺成纖維細胞后發(fā)現(xiàn)，細胞外的氧化應(yīng)激反應(yīng)能通過TGF-β1的上游調(diào)控而引起肺成纖維細胞增殖；在香煙煙霧處理的豚鼠肺泡灌洗液中IL-4等炎癥因子明顯增高；從牛分離得到的肌成纖維細胞進行體外培養(yǎng)，觀察到PDGF、bFGF對肌成纖維細胞具有促進增殖的作用，且在有IL-4共同作用下，這種增殖作用增加了2倍以上。綜合以上研究推測，合適濃度的CSE可能正是通過香煙煙霧中的多種氧化物質(zhì)和造模細胞產(chǎn)生的TGF-β1，促進纖維化大鼠肺成纖維細胞增殖。以此推斷，吸煙行為下，香煙煙霧也可能通過誘導(dǎo)和促進纖維化大鼠肺成纖維細胞分泌IL-4、PDGF-BB、bFGF等多種細胞因子，并通過這些細胞因子的聯(lián)合作用而引起肺成纖維細胞增殖。

本實驗通過制備合適濃度的CSE，作用于正常大鼠和肺纖維化大鼠的肺成纖維細胞，觀察兩種肺成纖維細胞生長情況。結(jié)果顯示：一定濃度的香煙煙霧提取物對正常大鼠肺成纖維細胞無明顯影響，而能促進肺纖維化大鼠肺成纖維細胞增殖，且在一定范圍內(nèi)與時間和濃度呈正相關(guān)。這個結(jié)果可能可以提示，吸煙者長期大量吸入香煙煙霧可以通過引起肌成纖維細胞增殖而促進肺纖維化，引起間質(zhì)性肺病。但由于該實驗僅僅是動物及細胞實驗，對于吸煙引起肺纖維化的發(fā)病機制仍需要進一步研究。

5" 參考文獻

[1] 吳蘇佶，謝敏.肺纖維化合并肺氣腫綜合征發(fā)病機理與研究進展[J].四川醫(yī)學(xué)，2019，40（3）：310-314.

[2] 李虎明，縱加強，陳旭昕等.重復(fù)煙霧吸入建立肺損傷大鼠模型及肺纖維化評估[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2022，43（8）：862-866，900.

[3] Hammond EC，Auerbach O，Kirman D，et al.Effects of cigarette smoking on dogs[J].Arch Environ health，1970，21：740-753.

[4] 顧超，陶峰，曹林峰等.Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡在COPD患者肺損傷中的作用及機制研究[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2022，32（8）：693-698.

[5] 朱媚，蔣小崗.肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的研究新進展[J].中國藥理學(xué)通報，2023，39（1）：1-4.

[6] 燕苗苗，趙亞昆，王搏等.博來霉素誘導(dǎo)大鼠與小鼠肺纖維化模型的評價[J].中國實驗動物學(xué)報，2023，31（2）：179-186.

[7] 陳廣瑞，李儉，梁笛等.肺纖維化大鼠模型造模方法的優(yōu)化[J].中國實驗動物學(xué)報，2023，31（2）：201-207.

[8] Zhang HY，Gharaee-Kermani M，Zhang K，et al.Lung fibroblast alpha-smooth muscle actin expression and contractile phenotype in bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Am J Pathol，1996，148（2）：527-537.

[9] 宿利清，王立紅，賀嵐等.miR-155對人胚肺成纖維細胞HELF增殖、凋亡和膠原蛋白合成的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2020，55（1）：139-143.

[10] S Carnevali，S Petruzzelli，Biancamaria L，et al.Cigarette smoke extract induces oxidative stress and apoptosis in human lung fibroblasts[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2003，284：L955-L963.

[11] Cisneros L，Jose，Miguel G，et al.Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2003，285：L949-L956.

[12] 李娜，李科君，杜利清.肺纖維化中肌成纖維細胞活化機制的研究進展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2019，39（9）：1341-1345.

[13] 萬勇，黃鶯，孫潔明.成纖維細胞在博來霉素致肺纖維化中高表達IL-2、β-catenin、TGF-β1和IL-10[J].華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，39（6）：766-770.

[14] 華曉敏，王昌明.ERK5對人肺成纖維細胞自噬、凋亡和增殖的調(diào)控[J].重慶醫(yī)學(xué)，2021，50（14）：2362-2365，2370.

[2023-07-18收稿]