郝劍 韓磊

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1檢驗科，2胃腸外科（河北張家口075000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國第三常見的惡性腫瘤［1］。早期CRC 患者經(jīng)有效治療后5年生存率可以超過90%，但約1/4 的患者在初診時已發(fā)生局部或遠處轉(zhuǎn)移，其5年生存率僅為約12%［2］。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是目前公認的能夠有效提高CRC 治療療效的策略，目前臨床常用的實驗室診斷檢測主要有糞便潛血檢測和血液標(biāo)志物檢測，但二者敏感性和特異性不足［3］；影像學(xué)檢查可以有效評估病變范圍和腫瘤分期，但對早期病變的診斷價值有限［4］；內(nèi)鏡聯(lián)合組織活檢是目前早期診斷CRC 的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在操作繁瑣、患者依從性差、侵入性強等缺點［5］。因此，臨床實踐中迫切需要一種微創(chuàng)或無創(chuàng)、靈敏且準(zhǔn)確的早期診斷方法。液體活檢技術(shù)因其無創(chuàng)、全面、實時、可重復(fù)監(jiān)測等特點而備受推崇。外泌體miRNA 是目前液體活檢的主要項目之一，其在腫瘤的早期診斷、療效評估和預(yù)后評估方面具有潛在的臨床應(yīng)用價值［6］。一項研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性早期CRC 患者血清中多個miRNAs 的含量明顯高于健康組，提示其可作為潛在的CRC 早期診斷標(biāo)志物［7］。既往研究報道m(xù)iR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 與CRC 的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［8-11］，但關(guān)于4 種miRNA 的表達水平及其對CRC 患者的診斷價值的研究相對較少。因此，本項研究旨在評估上述4 種外泌體miRNA 在CRC 患者外周血中的表達情況，并評估其對CRC 的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年3月至2022年5月本院收治的123 例結(jié)直腸癌患者（結(jié)直腸癌組）及117 例結(jié)直腸腺瘤患者（結(jié)直腸腺瘤組）作為研究對象，并納入150例健康對照者作為對照（健康對照組）。受試者入組后收集其年齡、性別、吸煙、腫瘤部位、腫瘤大小等相關(guān)信息。結(jié)直腸癌組納入標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）手術(shù)病理確診；（2）未接受放療、化療或其他腫瘤相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：肝、腎和其他器官功能障礙的患者。結(jié)直腸腺瘤（colorectal adenoma，CA）患者納入標(biāo)準(zhǔn)包括：通過腸鏡病理學(xué)確診。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：無腫瘤病史，無其他腸道疾病，無肝、腎或其他器官功能障礙。健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：腸鏡檢查腸道內(nèi)未發(fā)現(xiàn)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：腫瘤病史和心臟、肝臟、腎臟或其他器官功能障礙。本研究經(jīng)患者之情同意并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批號：HBBFYXY202203024。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑ABI7900 實時熒光定量PCR 儀購自美國Thermo-Fisher 公司，GH8935K Nano sight 納米粒度儀購自英國Nano-sight 公司，外泌體提取試劑盒Exo-Quick-TM（貨號：ND25792-6）、SYBR Premix ExTaq 試劑盒（貨號：N5643MJ）購自美國CST 公司，Prime-Script RT reagent 試劑盒（貨號：ND6527J）購自購自北京百奧生物科技公司，CD9 抗體（貨號：75882）、CD63 抗體（貨號：45368）、Calnexin 抗體（貨號：6387941）均購自美國CST公司。

1.2.2 血清外泌體提取與鑒定收集受試者5 mL外周靜脈血置于不含抗凝劑的試管中，室溫下3 000g離心15 min，根據(jù)ExoQuickTM試劑盒說明書進行后續(xù)操作，渦旋后的血清和外泌體試劑混合物在4 ℃下沉淀30 min，1 500g離心30 min，棄上清液，再次1 500g離心5 min 得到沉淀，重懸于200 μL 磷酸鹽緩沖液中，使用0.22 μm 無菌過濾器過濾，制備所需大小和濃度的外泌體。利用納米粒子追蹤分析技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡檢測外泌體標(biāo)記蛋白CD9、CD63、TSG101、Calnexin 的表達，對血清外泌體進行鑒定。

1.2.3 qRT-PCR 檢測血清外泌體miRNA采用TRizol 法從血清外泌體中提取總RNA。Nano Drop用于檢測RNA 的濃度。逆轉(zhuǎn)錄體系包括：總RNA 12 μL、2.5 U/μL PolyA 聚合酶1 μL、Mix 1 μL、5×Reaction Buffer 5 μL 和ddH2O 6 μL。以U6 為內(nèi)參，檢測miR-15b、miR-16、miR-21、miR-31 的相對表達量。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；然后是95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，共40 個循環(huán)。2-ΔΔCt方法用于計算相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法通過SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。符合整正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。采用受試者工作特征曲線（ROC）預(yù)測診斷價值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征本研究新診斷結(jié)直腸癌患者123例，其中男59 例，女64 例，年齡（51.60 ± 11.41）歲，見表2。同期共入組117 例經(jīng)視頻結(jié)腸鏡檢查確診為結(jié)直腸腺瘤的患者，其中男59 例，女58 例，年齡（51.55 ± 10.17）歲。納入我院健康對照者150 例為健康對照組，其中男76 例，女74 例，年齡（52.30 ±11.25）歲。

表2 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征Tab.2 Clinicopathological features of patients with colorectal cancer 例

2.2 各組中miR-15b、miR-16、miR-21、miR-31 相對表達水平與健康對照組相比，結(jié)直腸癌組miR-15b、miR-21、miR-16 及miR-31 表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與結(jié)直腸腺瘤組比較，結(jié)直腸癌組miR-15b、miR-21、miR-31 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 相對表達量Tab.3 Relative expression levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in each group ±s

表3 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 相對表達量Tab.3 Relative expression levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in each group ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與結(jié)直腸腺瘤組比較，#P ＜0.05

組別結(jié)直腸癌組（n= 123）腸腺瘤組（n= 117）健康對照組（n= 150）F 值P 值miR-15b 11.94± 3.81*#2.45± 0.02 1.21± 0.08 40.16 0.009 miR-16 2.83± 0.33*1.27± 0.12 0.79± 0.33 36.54 0.015 miR-21 8.59± 1.61*#2.14± 0.22 1.27± 0.07 18.36＜0.001 miR-31 7.16± 1.17*#1.68± 0.37 1.22± 0.15 39.12＜0.001

2.3 miR-15b、miR-21、miR-31 水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理相關(guān)性Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31 水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.778），見表4。結(jié)直腸癌伴淋巴結(jié)浸潤患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31水平高于結(jié)直腸癌不伴淋巴結(jié)浸潤患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.06），見表5。結(jié)直腸癌低分化腺癌患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31 水平高于結(jié)直腸癌中-高分化患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組之間miR-16 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.12），見表6。

表4 不同分期結(jié)直腸癌患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.4 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different stages of colorectal cancer ±s

表4 不同分期結(jié)直腸癌患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.4 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different stages of colorectal cancer ±s

組別Ⅲ-Ⅳ期（n=78）Ⅰ-Ⅱ期（n=45）t值P值miR-15b 14.54±0.68 9.04±0.72 12.31 0.006 miR-16 2.26±0.08 1.90±0.12 18.35 0.778 miR-21 10.78±0.09 7.94±0.44 22.11 0.026 miR-31 7.56±0.87 6.16±1.22 13.54＜0.001

表5 結(jié)直腸癌伴或不伴淋巴結(jié)浸潤患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.5 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with colorectal cancer with or without lymph node infiltration ±s

表5 結(jié)直腸癌伴或不伴淋巴結(jié)浸潤患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.5 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with colorectal cancer with or without lymph node infiltration ±s

組別淋巴結(jié)浸潤（n = 83）無淋巴結(jié)浸潤（n = 44）t 值P 值miR-15b 13.69 ± 1.22 7.28 ± 1.32 22.78＜0.001 miR-16 3.06 ± 0.15 2.99 ± 0.22 19.35 0.06 miR-21 11.01 ± 0.02 8.22 ± 0.29 10.25＜0.001 miR-31 8.18 ± 0.37 5.98 ± 1.32 8.91＜0.001

表6 結(jié)直腸癌不同分化程度患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.6 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different degrees of colorectal cancer differentiation ±s

表6 結(jié)直腸癌不同分化程度患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比較Tab.6 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different degrees of colorectal cancer differentiation ±s

組別中-高分化腺癌（n = 49）低分化腺癌（n = 78）t 值P 值miR-15b 14.09 ± 0.88 6.12 ± 2.19 12.18＜0.001 miR-16 2.66 ± 1.18 2.12 ± 1.56 6.22 0.12 miR-21 10.89 ± 0.17 7.99 ± 0.83 19.51＜0.001 miR-31 9.01 ± 0.13 6.10 ± 1.66 18.22 0.029

2.4 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 對結(jié)直腸癌患者的診斷價值采用ROC 曲線評估m(xù)iR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 在結(jié)直腸癌中的診斷價值。miR-15b 的AUC 為0.86（0.82～0.91），miR-16、miR-21、miR-31 的AUC 分別為0.58（0.51～0.65）、0.75（0.69～0.81）、0.75（0.68～0.82），4 種miRNA 中評價效力最高的指標(biāo)是miR-15b，敏感度和特異度分別為81.33%和91.80%，（P＜0.05）；評價效力最差指標(biāo)為miR-16，敏感度和特異度分別為42.68%和52.33%（P＜0.05）。進一步采用logistic 分析對miR-15b、miR-21和miR-31組合panel診斷價值進行評估，結(jié)果顯示三者組合panel 具有更好的敏感度和特異度：91.95%和97.62%（P＜0.01）。見圖1。

圖1 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 及組合panel 對結(jié)直腸癌患者的診斷價值Fig.1 Diagnostic value of miR-15b，miR-16，miR-21，miR-31 and combined panel in patients with colorectal cancer

3 討論

在我國CRC 發(fā)病率和病死率一直居高不下，且由于早期診斷方法缺乏敏感性和特異性，其總體趨勢依然呈上升趨勢［12］。miRNA 是由19～24 個核苷酸組成的小型非編碼RNA 分子，其通過與靶基因mRNA 的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合來觸發(fā)mRNA 的降解，從而抑制蛋白質(zhì)翻譯以調(diào)節(jié)基因表達，miRNAs的異常表達與許多腫瘤等疾病密切相關(guān)，已證實miRNAs 具有致癌或抑癌活性［13］。外泌體miRNA作為腫瘤基質(zhì)與腫瘤細胞之間信號交流的重要媒介，幾乎參與了腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的所有生物學(xué)過程［14］。與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物相比，外泌體來源的miRNA 具有較高的敏感性和特異性，檢測腫瘤來源外泌體中miRNA 的類型和含量，對腫瘤臨床診斷和治療具有重要意義。一項研究分析了746 例CRC 患者和476 例健康受試者，結(jié)果顯示miR-21 診斷CRC 的敏感度和特異度分別為72%和85%，證實其具有作為CRC 診斷標(biāo)志物的良好潛力［15］。

本研究結(jié)果顯示，miR-15b 是CRC 診斷的潛在生物標(biāo)志物，且miR-15b、miR-21 和miR-31 組合panel 具有更好的診斷價值，這與之前的研究結(jié)果相符。miR-15b 屬于miR-15 家族，其位于3q25.33 染色體區(qū)域。研究表明，miR-15b 在許多腫瘤中異常表達，例如miR-15b 在舌癌、宮頸癌和胰腺癌細胞中上調(diào)，并充當(dāng)癌基因［16］。miR-15b 的異常表達可用于各種腫瘤的診斷，也可作為復(fù)發(fā)檢測的重要生物標(biāo)志物。一項研究表明，miR-15b在肝癌復(fù)發(fā)患者中的表達顯著增加，miR-15b 可能與MTSS1 結(jié)合以調(diào)節(jié)細胞周期，而MTSS1 是一種多功能蛋白，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，MTSS1 的下調(diào)可作為肺鱗狀細胞癌早期輔助治療階段進展的標(biāo)志物［17］。miR-15b 通過靶向下調(diào)MTSS1 表達促進CRC 細胞增殖，抑制miR-15b 可上調(diào)MTSS1 表達，從而抑制癌細胞增殖［18］。一項薈萃分析發(fā)現(xiàn)，血液中的miR-21 水平可用于檢測CRC，其具有良好的敏感性和特異性：血液miR-21的診斷效率高于糞便miR-21，血清標(biāo)本中miR-21的檢測優(yōu)于血漿標(biāo)本［19］。許多研究表明，miR-31作為一種致癌物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)腫瘤的生長、凋亡、轉(zhuǎn)移和化療耐藥，miR-31 的表達增加與CRC 腫瘤的進展有關(guān)，提示血清miR-31 可用于CRC 的診斷［20］。此外miRNA panel 作為不同miRNA 的組合，可以提高其檢測效率。一項包括1 558 例CRC患者和1 085 例健康受試者的薈萃分析結(jié)果顯示，循環(huán)外泌體的miR-1246 和miR-23a 組合panel 診斷CRC 的敏感度和特異度分別高達95%和92%［21］。

總之，本研究評估了4 種血清外泌體miRNA：miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 的臨床價值，并且我們發(fā)現(xiàn)4 種miRNA 在結(jié)直腸癌患者外周血中異常表達，且其中的miR-15b、miR-21 和miR-31 表達水平與臨床TNM 分期、淋巴結(jié)浸潤呈正相關(guān)，與分化程度呈負相關(guān)；此外相較于單一miRNAs 檢測，miR-15b、miR-21 和miR-31 的組合panel 可以更好地區(qū)分健康對照組和結(jié)腸癌患者，其敏感度和特異度分別為95.06%和94.44%，這對于提高結(jié)直腸癌臨床診斷效率具有潛在的參考價值。但本研究仍然存在局限性，相對較小的單中心樣本量限制了該研究的應(yīng)用價值，后續(xù)將進一步進行完善。

【Author contributions】HAN Lei designed the study,HAO Jian conducted experiments and wrote the manuscript,and HAN Lei revised the manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.