李小杰 譚冬 杜玉民 袁宇

河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（河北保定071000）

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由于神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)畸形或受到創(chuàng)傷性、感染性或代謝紊亂的影響時，大腦的局部或全腦會出現(xiàn)異常的同步神經(jīng)元放電，就會導(dǎo)致癲癇發(fā)作；以反復(fù)發(fā)作和不可預(yù)知的發(fā)作為其特點(diǎn)［1］。腦微透析技術(shù)的產(chǎn)生使其可以用來測量癲癇發(fā)作前、中和后興奮性和抑制性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)濃度的變化，并與電生理數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，促進(jìn)了癲癇研究的突破［2］。隨著腦微透析技術(shù)的不斷發(fā)展，包括分段流、快速液相色譜（LC）和激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳（CE-LIF）等方法的應(yīng)用，使微透析的時間分辨率明顯提高到1 分鐘以上，可用于測量癲癇發(fā)作相關(guān)的瞬時自發(fā)神經(jīng)化學(xué)變化。已開發(fā)出比傳統(tǒng)探針小得多的微型取樣探針，具有更大的空間分辨率，它們可以針對癲癇研究中重要的特定腦區(qū)進(jìn)行監(jiān)測。將微透析取樣與光遺傳學(xué)和光刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放相結(jié)合，也對研究癲癇發(fā)作起到了一定效果。本文就目前改進(jìn)時間分辨率的腦微透析技術(shù)、微型化取樣探針、光遺傳學(xué)結(jié)合腦微透析技術(shù)作一綜述。

1 腦微透析技術(shù)概述

腦神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在各種神經(jīng)過程中發(fā)揮著非常重要的作用，包括腦神經(jīng)元之間的神經(jīng)信號傳播、神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持以及促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的生長和修復(fù)［3］。因此，神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的失調(diào)可能導(dǎo)致多種腦部疾病，例如癲癇、帕金森病、阿爾茨海默病、腦水腫和腦缺氧等［4］。由于腦神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要性，腦神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)檢測開始廣泛研究，以便于更好地了解腦神經(jīng)傳遞和生理功能。腦微透析技術(shù)因此應(yīng)運(yùn)而生。腦微透析技術(shù)是一種可以對腦細(xì)胞外間質(zhì)液進(jìn)行采樣的有創(chuàng)性技術(shù)，它能夠連續(xù)檢測腦細(xì)胞外間質(zhì)液的化學(xué)成分。腦微透析裝置由探針、導(dǎo)管、微量灌流泵、樣品收集器和分析儀組成；探針由流入管、流出管和中空纖維管構(gòu)成，根據(jù)腦立體定位圖譜，可借助腦立體定位儀植入；腦微透析床旁分析儀可以將采樣流體（也稱為微透析液）每小時分析一次，其工作原理基于酶促反應(yīng)［5］。我們可以用來檢測癲癇發(fā)生時大腦中如NF-κB 和IL-6 等蛋白含量的變化［6］，亦能夠觀察如使用左乙拉西坦和奧卡西平等抗癲癇時引起的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)改變［7-8］。然而，由于分析的數(shù)據(jù)具有滯后性，其時間分辨率不高［9］。因此，需要有效和及時地測量微透析液來預(yù)測癲癇的發(fā)生和變化。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，新興的研究將腦微透析技術(shù)改進(jìn)，有效地提高了其時間分辨率和檢測范圍，使癲癇的研究更加精確和清晰。

2 改進(jìn)時間分辨率的腦微透析技術(shù)

傳統(tǒng)的腦微透析技術(shù)上只能夠在5～10 min的間隔里對腦細(xì)胞外間質(zhì)液進(jìn)行采樣分析。限制時間分辨率的關(guān)鍵取決于所用分析方法的靈敏度，即必須在一定時間內(nèi)收集足夠的樣品才能有足夠的材料進(jìn)行分析［9］。使用能夠提高靈敏度的方法，如激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE-LIF）和快速液相色譜技術(shù)（FLC）等，可以提供更好的時間分辨率［10］。

2.1 激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE-LIF）在監(jiān)測3-巰基丙酸（3-MPA）誘發(fā)癲癇的神經(jīng)化學(xué)變化的研究顯示出了較高時間分辨率的潛在效用［10］。利用CE-LIF 技術(shù)可以在“快”（60 s）和“慢”（5 min）時間尺度上測量谷氨酸和GABA 的變化［10］。CRICK 等人利用CE-LIF 技術(shù)分析3-巰基丙酸（3-MPA）癲癇大鼠模型腦部快速1 分鐘微透析采樣的氨基酸/神經(jīng)遞質(zhì)數(shù)據(jù)，觀察到一個獨(dú)特的趨勢，谷氨酸顯示出了雙相活性。在5～25 min 內(nèi)，谷氨酸明顯增加，40～65 min 再次增加。在實(shí)驗(yàn)的最后30 分鐘，谷氨酸也持續(xù)增加。60 s 取樣結(jié)果表明，3-MPA 引起的谷氨酸變化呈雙峰型，而在“慢”5 min 取樣的時間尺度下這種雙峰變化并不明顯［10］。 癲癇持續(xù)狀態(tài)通過利用激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE-LIF）的腦微透析采樣獲得了相對較高的時間分辨率的結(jié)果，這在將來可以為難以預(yù)知的癲癇發(fā)作和自發(fā)性癲癇的發(fā)作提供新的見解。

上述研究結(jié)果表明，時間分辨率的提高可以更好地揭示癲癇發(fā)作背后的化學(xué)變化。在不久的將來，隨著技術(shù)的進(jìn)步，我們可以更清晰地研究導(dǎo)致癲癇發(fā)作的神經(jīng)化學(xué)變化，甚至更高分時間辨率的神經(jīng)化學(xué)變化（如每一秒的變化），借此可以揭示更多關(guān)于神經(jīng)化學(xué)模式的信息。

2.2 快速液相色譜技術(shù)（FLC）由于自發(fā)性癲癇的發(fā)作是隨機(jī)的［11］，因此利用連續(xù)的高時間分辨率的方法會對監(jiān)測自發(fā)性癲癇的發(fā)作起到很大作用。最近，一些實(shí)驗(yàn)小組報(bào)告了與微透析相結(jié)合的快速液相色譜技術(shù)（FLC）的發(fā)展，這種技術(shù)可以連續(xù)、在線操作對一些抗癲癇藥物進(jìn)行長達(dá)1 分鐘時間甚至更長時間的連續(xù)檢測［12-13］?？焖僖合嗌V技術(shù)（FLC）對高效液相色譜的透析液流通路進(jìn)行了細(xì)致地優(yōu)化并且用到了高靈敏度的電化學(xué)或光電化學(xué)檢測器，并且在透析液中加入了穩(wěn)定試劑，這種新技術(shù)已用于監(jiān)測大鼠紋狀體中甲基苯丙胺在自由活動的動物體內(nèi)代謝過程中的多巴胺及血清素的變化［14］。由于時間分辨率的提高，可以更加精確研究局部甲基苯丙胺的代謝產(chǎn)物變化以及受藥物影響的多巴胺水平。

這種技術(shù)的一個重要特點(diǎn)是它們可以進(jìn)行連續(xù)操作和檢測，因此有可能檢測到未預(yù)測或自發(fā)性的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的瞬時變化。例如，利用快速液相色譜技術(shù)（FLC）連續(xù)測量自由活動小鼠腦微透析液一項(xiàng)研究顯示，該技術(shù)可以在7 min 內(nèi)同時分析小鼠微透析液中的單胺、其前體和代謝物以及乙酰膽堿（ACh）、膽堿（Ch）和γ-氨基丁酸（GABA）等物質(zhì)的變化，并能夠測定特定大腦區(qū)域的基礎(chǔ)神經(jīng)遞質(zhì)水平，從而檢測疾病相關(guān)和藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)化學(xué)改變［15］。同時快速液相色譜技術(shù)（FLC）也可以用來測量5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（SERT）和性別差異介導(dǎo)刺激的5-羥色胺的水平［16］。因此，利用快速液相色譜技術(shù)（FLC）可以對癲癇的發(fā)作進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，能夠捕捉到其發(fā)作相關(guān)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的連續(xù)變化及影響這些物質(zhì)水平因素的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

2.3 微量液滴快速毛細(xì)管電泳技術(shù)（DFCE）目前微量液滴快速毛細(xì)管電泳技術(shù)（DFCE）可以使時間分辨率達(dá)到幾秒鐘以內(nèi)［17］。如此高的時間分辨率有助于更好地描述導(dǎo)致癲癇發(fā)作的神經(jīng)化學(xué)動力學(xué)。但要達(dá)到足夠高的靈敏度，則必須面對在幾秒鐘的時間間隔內(nèi)收集樣本的技術(shù)挑戰(zhàn)，如果微透析灌注速率為1 μL/min，則該幾秒種間隔的收集的樣本量相當(dāng)于納升的體積［18］。收集這種小樣本的一種方法是采用分段流體取樣，其中樣本與不混溶的流體穿插，以形成小樣本陣列進(jìn)行分析［19-20］。

微量液滴快速毛細(xì)管電泳技術(shù)（DFCE）技術(shù)的出現(xiàn)顯著提高了微透析的時間分辨率。該技術(shù)通過利用一個含有不相容載體相（全氟萘烷/PFD）的微型聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上的三通通道將透析液分段成納升栓［21］。微透析液通過單個樣品栓（即納升栓）的熒光測量的時間明顯小于非樣品栓測量的時間［21］，從而達(dá)到提高時間分辨率的目的。

為了進(jìn)一步推進(jìn)時間分辨率的界限，電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)與微量液滴快速毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)用，可以在5 秒的時間分辨率內(nèi)對體內(nèi)的乙酰膽堿進(jìn)行監(jiān)測［22］。此外，將2 nL 體內(nèi)的微透析液組分在納升塞中收集并利用這種聯(lián)合技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)化學(xué)監(jiān)測時，時間分辨率可以達(dá)到2 s［23］。因此，微量液滴快速毛細(xì)管電泳技術(shù)將會是一種理想的方法，可以將微透析取樣的時間分辨率提高到亞分鐘的時間尺度，以測量隨機(jī)自發(fā)性癲癇發(fā)作期間的神經(jīng)化學(xué)變化。

3 微型化取樣探針

為了在癲癇發(fā)作期間利用微透析進(jìn)行神經(jīng)化學(xué)測量，我們必須要監(jiān)測特定的大腦區(qū)域，如海馬區(qū)和核重聚體［24］。傳統(tǒng)的微透析探針由于體積較大，無法單獨(dú)針對這些腦區(qū)。大尺寸的探針也會導(dǎo)致腦組織損傷，在這種損傷的情況下也可能導(dǎo)致測量結(jié)果與自發(fā)性癲癇的發(fā)作產(chǎn)生的結(jié)果相混淆［25］。最新的研究進(jìn)展是使探針微型化。這意味著我們需要從中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的較小區(qū)域中獲得化學(xué)信息，而不影響中樞神經(jīng)的神經(jīng)化學(xué)恢復(fù)。這種小損傷并能獲取化學(xué)信息的方式可以通過推挽灌流取樣探針得到。這種微型化探針采用較低流量的流速采樣，使組織損傷最小，體外回收率相對較高［18］。微型化探針能夠測量活體小鼠大腦神經(jīng)核團(tuán)中的神經(jīng)遞質(zhì)變化，具有較高的空間分辨率［26］。此外，這種微型化探針比常規(guī)微透析探針產(chǎn)生的組織損傷更低［18］。這類探針在行為學(xué)研究中的效用在動物實(shí)驗(yàn)里得到了證明，在利用微型化取樣探針在研究大鼠恐懼等行為發(fā)生時，可以記錄到大鼠海馬和基底外側(cè)杏仁核中細(xì)胞外鋅的水平升高［27］。因此，將微型化探針與高時間分辨率監(jiān)測技術(shù)相結(jié)合對神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的研究很有潛力［28］。

硅晶體推挽灌流探針的產(chǎn)生促使探針進(jìn)一步小型化，更加適用于癲癇的研究［29］。這種微型化探針包含兩個20 微米的通道，其出入端是注射或收集液體（緩沖液/透析液）的端口，通過活體麻醉大鼠腦取樣，我們可以看到這種低流量推挽取樣探針的效用：該技術(shù)聯(lián)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)進(jìn)行分析，硅晶體推挽灌流探針以50 nL/min 的速度在活鼠紋狀體取樣，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)能夠從推挽灌流液中檢測出17 種神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物［29］。硅晶體推挽灌流探針還可以將透析薄膜嵌入硅晶體探針其中，這樣就可以直接從這種類似大小的探針中進(jìn)行微透析取樣［30］。這種微型化制造的微透析探針在對麻醉動物的苯丙胺給藥的動態(tài)體內(nèi)化學(xué)變化的監(jiān)測上與傳統(tǒng)的微透析探針具有相同級別的表現(xiàn)，其在20 min 內(nèi)檢測到的14 種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)與傳統(tǒng)微透析探針檢測到的結(jié)果一致，由于這種探針的橫截面積比傳統(tǒng)的微透析探針小79%，這使得它們可以用于小型的動物模型和較小的大腦區(qū)域［30］。因此我們可以利用這些微型探針對較小的大腦區(qū)域如下丘腦和腦核重聚體進(jìn)行高空間分辨率的測量，通過微透析取樣來測量癲癇引起的神經(jīng)化學(xué)變化，將會是研究癲癇的一種理想方法。

4 光遺傳學(xué)結(jié)合腦微透析技術(shù)

光遺傳學(xué)是另一種可以用于癲癇研究的技術(shù)。光遺傳學(xué)技術(shù)可以使用光來控制或監(jiān)測神經(jīng)元活動，這些神經(jīng)元已經(jīng)被基因修飾可以表達(dá)光敏離子通道蛋白［31］，可以用于癲癇模型的研究。在癲癇模型的研究中，光遺傳學(xué)技術(shù)已成為抑制過度活躍神經(jīng)元的重要工具，同時也可以刺激其他神經(jīng)元可控地操縱癲癇發(fā)作［32］。無論是對興奮性主要細(xì)胞的光遺傳學(xué)抑制，還是對海馬神經(jīng)元中GABA（γ-氨基丁酸）能細(xì)胞亞群的激活，都可以在光照下迅速阻止癲癇的發(fā)作［33］；此外，光遺傳學(xué)技術(shù)通過刺激谷氨酸能神經(jīng)元亦能夠在存在完整的GABA 能傳遞的情況下觸發(fā)癲癇樣活動［34］。這可以為誘導(dǎo)和減輕癲癇發(fā)作提供一種可控的方法。

光遺傳學(xué)技術(shù)與腦微透析取樣結(jié)合神經(jīng)化學(xué)監(jiān)測的一些挑戰(zhàn)包括神經(jīng)化學(xué)技術(shù)的專業(yè)知識、能夠?qū)崿F(xiàn)高采樣及分辨率的分析方法，并利用光遺傳學(xué)技術(shù)控制來確定激光或熱能對非靶向內(nèi)源性離子通道或生物化學(xué)物質(zhì)的影響［35］。這兩種技術(shù)的結(jié)合將會使人們能夠更徹底地了解潛在的神經(jīng)回路及其對神經(jīng)行為的影響，比如癲癇。聯(lián)合微透析的光遺傳學(xué)探針可以用于癲癇研究中光遺傳學(xué)神經(jīng)元刺激期間的神經(jīng)化學(xué)監(jiān)測，能夠測量受控癲癇發(fā)作期間、之前和之后的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的變化［36］。這可以顯示出神經(jīng)化學(xué)生物標(biāo)志物與癲癇發(fā)作和復(fù)雜行為狀態(tài)的相關(guān)性，進(jìn)而更好地對癲癇的發(fā)作進(jìn)行研究［36］。然而，光遺傳學(xué)技術(shù)與微透析取樣相結(jié)合的研究范圍相當(dāng)有限，因?yàn)槟壳八荒芘c電生理學(xué)和光刺激期間觀察到的行為變化相結(jié)合［35］。因此光遺傳學(xué)技術(shù)與微透析技術(shù)結(jié)合需要進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。

5 展望

腦微透析技術(shù)對于癲癇的發(fā)作機(jī)制及預(yù)測的研究仍在不斷完善和更新，隨著更高時間分辨率技術(shù)的出現(xiàn)以及微型化探針的改進(jìn)，將更好地對癲癇的發(fā)作進(jìn)行預(yù)測。同時利用光遺傳學(xué)技術(shù)控制神經(jīng)元的興奮性產(chǎn)生可控的癲癇模型，并與腦微透析技術(shù)相結(jié)合，可以用于研究神經(jīng)化學(xué)生物標(biāo)志物與癲癇發(fā)作和復(fù)雜行為狀態(tài)的相關(guān)性，從而進(jìn)一步研究癲癇背后的機(jī)制，并為癲癇的治療做出更好地調(diào)整。

【Author contributions】YUAN Yu：Conceptualization，Writing-Revewing and Editing.LI Xiaojie：Writing-Original draft preparation.TAN Dong：Writing-Revewing and Editing.DU Yumin：Writing-Revewing and Editing.All authors read and aplproved the final manuscript.