劉應(yīng)通 李道俊

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤科，湖北宜昌 443003

2020年全球肺癌發(fā)病率約為11.4%，病死率為18.0%，已成為惡性腫瘤致死的首要原因[1]。在肺癌的分型中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的85%[2]。對于肺癌的診斷，病理學(xué)相關(guān)檢查仍是金標(biāo)準(zhǔn)；然而，腫瘤活檢是侵入性操作，患者因獲取組織存在高風(fēng)險(xiǎn)，無法獲得腫瘤組織。此外，腫瘤具有時(shí)間及空間的異質(zhì)性，在某一部位及某一時(shí)間段獲取的腫瘤組織上的信息并不能完全表征腫瘤的信息，故而腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性對指導(dǎo)臨床決策帶來了挑戰(zhàn)。基于此，液體活檢目前正受到關(guān)注，因?yàn)樗哂蟹乔秩胄?、快速、?shí)時(shí)應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，其一系列的研究正在進(jìn)行中。液體活檢指通過對血液樣品等非固體生物組織的采集，檢測生物標(biāo)志物，完善腫瘤分子分型、為治療方案的制訂提供相關(guān)信息。目前，液體活檢的生物標(biāo)志物主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumour cells，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs，主要是外泌體）、循環(huán)無細(xì)胞RNA（cfRNA）。其中，CTC是液體活檢的重要組成部分[3]。CTC的概念由澳大利亞病理學(xué)家Ashworth在1869年第一次提出[4]，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實(shí)時(shí)療效監(jiān)測手段。與傳統(tǒng)的影像學(xué)、內(nèi)窺鏡檢查以及病理學(xué)診斷相比，可敏感地監(jiān)測疾病的變化，迅速地評(píng)價(jià)某一治療方案的效果。通過血液循環(huán)擴(kuò)散腫瘤細(xì)胞是癌癥轉(zhuǎn)移重要的中間步驟，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞或癌細(xì)胞團(tuán)具備分離并遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤、通過周圍組織遷移并進(jìn)入淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)的能力時(shí)，腫瘤的轉(zhuǎn)移性就變得明顯，這些細(xì)胞即是CTC[5-6]。CTC上行轉(zhuǎn)錄組學(xué)及相關(guān)標(biāo)記物的測定，可以提供轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的早期預(yù)警及療效監(jiān)測，CTC測定能夠監(jiān)測癌癥進(jìn)展、復(fù)發(fā)及其治療反應(yīng)等。本文對臨床中常見的NSCLC突變基因及免疫標(biāo)志物在CTC中的表達(dá)及研究進(jìn)行綜述。

1 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）

對于具有驅(qū)動(dòng)基因陽性的晚期NSCLC患者而言，目前靶向治療為一線首選治療，在靶向治療之前，需通過基因檢測明確靶向位點(diǎn)突變，EGFR為NSCLC中最常見的突變靶點(diǎn)，約占NSCLC患者的33.3%[7]。EGFR檢測方法眾多，有檢測EGFR蛋白表達(dá)水平的免疫組織化學(xué)法，還有檢測EGFR基因突變的DNA直接測序法、聚合酶鏈反應(yīng)等，而檢測樣本國內(nèi)外目前推薦組織樣本，認(rèn)為其檢測的敏感度和特異度比其他類型的樣本高，是EGFR檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。對于無法獲取組織樣本或樣本量不夠的晚期NSCLC患者，CTC上行EGFR分析也成為了一種選擇。對CTC行單細(xì)胞全基因組測序目前已有相關(guān)研究完成，其中第一個(gè)全基因組分析發(fā)表于2012年，并發(fā)現(xiàn)在單個(gè)CTC中檢測到的單核苷酸變異（single nucleotide variants，SNV）具有高度異質(zhì)性[8]，與藥物靶標(biāo)（如EGFR）、耐藥性（PIK3CA）和表型轉(zhuǎn)變（TP53、RB1）相關(guān)的重要突變都可以在CTC中檢測到，從而揭示CTC基因組分析的重要臨床價(jià)值。對于CTC中的EGFR檢測，近年來也得到了進(jìn)一步的研究。有研究[9]通過下一代測序?qū)?7個(gè)富含CTC的患者行EGFR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在檢查樣本中發(fā)現(xiàn)了EGFR突變，并且包含了所有目前臨床中常見的突變類型，通過進(jìn)一步將CTC上的EGFR檢測分析與組織EGFR分析對比，發(fā)現(xiàn)CTC與組織中的EGFR突變率具有一致性，這一點(diǎn)在EGFR 19外顯子缺失突變中更為顯著。Turetta等[10]也通過ddPCR的方法檢測了CTC中EGFR突變情況，發(fā)現(xiàn)在85%的患者CTC中有著與組織基因檢測的一致性，并發(fā)現(xiàn)在組織檢測EGFR野生型的一部分患者也可以從CTC中檢出EGFR突變。盡管表皮生長因子受體的酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）為NSCLC患者帶來了巨大的臨床獲益，但其在治療過程中仍然會(huì)產(chǎn)生耐藥，T790M突變是EGFR-TKI耐藥的常見機(jī)制，因此對于EGFR-TKI耐藥的患者T790M的檢測變得至關(guān)重要，Sundaresan等[11]通過對40例EGFRTKI治療進(jìn)展的EGFR突變的患者再次活檢組織的T790M基因型檢測及CTC的檢測進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在腫瘤活檢組織、CTC樣本和ctDNA樣本中成功獲得了T790M基因型，使用每種基因分型測定法在47%～50%的患者中檢測到耐藥相關(guān)突變，其一致性范圍為57%～74%。雖然基于CTC和ctDNA的基因分型在20%～30%的病例中存在差異，但對于多數(shù)患者，這兩種檢測方法的互補(bǔ)性使所有患者的基因分型、精準(zhǔn)治療成為可能。

2 間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）

ALK基因突變是NSCLC患者中常見的另一個(gè)突變靶點(diǎn)，其突變率在1%～7%，并且有ALK基因突變的患者較少伴隨EGFR及KRAS基因的突變[12-15]。根據(jù)NCCN指南，對于ALK陽性的晚期NSCLC患者，一線推薦使用分子靶向藥物克唑替尼等ALK酪氨酸激酶抑制劑治療。對于ALK基因重排的檢測，目前最常用的是免疫熒光雜交技術(shù)（FISH），這種方法同樣具有異質(zhì)性，小活檢標(biāo)本與切除標(biāo)本ALK基因重排的一致性并不一致。Ilie等[16]最先對CTC上ALK基因重排進(jìn)行了分析，他們通過免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)研究的46例患者中有5例肺腺癌患者ALK陽性，后續(xù)行FISH分析證實(shí)了具有ALK基因重排，在這5例患者中均檢測出了CTC，并且CTC-ALK呈陽性，在CTC中分析ALK基因重排的可行性，在后續(xù)的Tan等[17]的研究中也得到了證實(shí)。但是，F(xiàn)ISH檢測ALK基因重排與CTC-ALK檢測重排并非具有完全一致性，少數(shù)經(jīng)FISH檢測為ALK陰性的患者，其外周血CTC中ALK基因檢測具有突變[18]。CTC行ALK基因測序可以提供一種獨(dú)特的方法來評(píng)估患者突變情況，為部分無法獲取組織的患者提供了另一種基因檢測方法，可能有助于發(fā)現(xiàn)用藥療效及異質(zhì)性耐藥的機(jī)制。

3 程序性死亡受體配體-1（programmed death receptor ligand-1，PD-L1）

免疫檢查點(diǎn)抑制劑為晚期NSCLC患者帶來了獲益，尤其是對于PD-L1高表達(dá)即腫瘤細(xì)胞陽性比例分?jǐn)?shù)（tumor proportion score，TPS）≥ 50% 的患者，免疫檢查點(diǎn)抑制劑可顯著延長患者無疾病進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS），且治療過程中總體不良反應(yīng)發(fā)生率更低[19-20]，基于此，對于PD-L1高表達(dá)，驅(qū)動(dòng)基因陰性的晚期NSCLC患者，因此將免疫檢查點(diǎn)抑制劑納入了一線治療。并且發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)水平可作為免疫治療療效的預(yù)測因素，對于PD-L1的檢測，往往通過免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行，對患者的組織樣本量要求較高，并且不便于多次取樣檢測、動(dòng)態(tài)評(píng)估，而CTC-PD-L1的檢測便可克服此項(xiàng)困難。通過既往的研究，CTCPD-L1的表達(dá)分析具有可行性，Chen等[21]通過收集51例NSCLC患者外周血行CTC檢測并對CTC進(jìn)行PD-L1分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有28例（67%）患者的CTC中可見PD-L1表達(dá)，這項(xiàng)研究同時(shí)對患者的組織通過22C3抗體行PD-L1免疫組織化學(xué)染色，通過與CTC-PD-L1對比，兩者之間具有80%的一致性。然而這項(xiàng)研究并未對CTC-PD-L1進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測，并且納入的患者基線特征并不統(tǒng)一。Guibert等[22]納入了96例晚期NSCLC患者，并在納武利尤單抗治療前和進(jìn)展時(shí)收集血液樣本，在CTC上動(dòng)態(tài)評(píng)估PD-L1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在基線時(shí)，便在大部分患者的CTC中檢測出了PD-L1的表達(dá)，通過后續(xù)使用納武利尤單抗治療進(jìn)展之后行CTC-PD-L1分析，發(fā)現(xiàn)治療前CTC高負(fù)荷與預(yù)后不良相關(guān)，但PD-L1在CTC上的表達(dá)沒有顯著的預(yù)后影響。與Chen等[21]的研究一樣，這項(xiàng)研究也進(jìn)行了組織PD-L1的檢測，不同于Chen等的研究，其CTC-PD-L1與組織PD-L1之間的一致性僅為45.4%，兩者之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在前幾項(xiàng)的研究中，行CTC檢測均使用的是患者的外周靜脈血，Dong等[23]則采取患者的外周動(dòng)脈血及肺靜脈血行CTC及CTC-PD-L1分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺靜脈血中CTC的檢測陽性率顯著高于外周靜脈血，并且肺靜脈抽血的方法可能會(huì)提高PD-L1在CTC中的檢測效率。綜上所述，CTC-PD-L1檢測具有可行性，但是其檢測結(jié)果與組織學(xué)PD-L1檢測結(jié)果之間的一致性仍待商榷，并且目前CTC及PD-L1的檢測方法并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，所以CTC-PD-L1為免疫治療的預(yù)后指標(biāo)仍需大型的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步佐證。

4 腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）

TMB可能是免疫治療（ICS）療效的另一個(gè)預(yù)測因素，CheckMate 026試驗(yàn)在一線NSCLC治療中比較了PD-L1≥5%的患者納武利尤單抗組與化療組療效及安全性分析，在基于TMB的探索性亞組分析中，與化療相比，在TMB高的腫瘤中，納武利尤單抗報(bào)告了更高的客觀緩解率（objective response rate，ORR）和更長的 PFS[24]。同樣，TMB被用作PFS的前瞻性生物標(biāo)志物，作為CheckMate 227研究中的兩個(gè)共同主要終點(diǎn)之一，該研究將納武利尤單抗和伊匹木單抗的組合與鉑類化療進(jìn)行了比較。在基于組織活檢的TMB高的患者組中（tTMB，定義為每兆堿基≥10個(gè)突變），其PFS及ORR較化療組相比具有顯著獲益[25]。目前尚不清楚在CTC中行TMB的檢測是否與ICI的臨床結(jié)果相關(guān)。但是，既往的研究已經(jīng)評(píng)估來了血液TMB（bTMB）在晚期NSCLC中的預(yù)測價(jià)值的研究。據(jù)報(bào)道，由NGS確定的bTMB與使用全外顯子組測序的tTMB相關(guān)[26-27]。在對POPLAR和OAK臨床研究的回顧性探索性分析中，證明了具有高bTMB（≥16 Mut/Mb）的患者與更好的結(jié)果預(yù)后相關(guān)[28]。目前給予血液的TMB檢測已有多項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在開展，但CTC中的TMB檢測需要進(jìn)一步研究，CTC或?qū)⒊蔀門MB研究的新焦點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冊试S對腫瘤表型進(jìn)行結(jié)構(gòu)評(píng)估和分子表征。

5 總結(jié)

CTC的發(fā)現(xiàn)極大地改變了傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)模式，其標(biāo)本采集方便、可動(dòng)態(tài)檢測極大地方便了臨床，目前CTC可用于早期疾病檢測、預(yù)后、復(fù)發(fā)監(jiān)測和個(gè)性化癌癥治療。CTC單細(xì)胞測序及免疫標(biāo)志物的測定可以獲得癌癥患者CTC全基因組拷貝數(shù)變化規(guī)律及免疫標(biāo)志物的轉(zhuǎn)歸情況，為我們鑒定癌種亞型，進(jìn)一步揭示腫瘤轉(zhuǎn)移和克隆起源的分子機(jī)制。此外，CTC的單細(xì)胞測序能夠識(shí)別癌基因中的點(diǎn)突變，揭示接受癌癥治療的患者基因突變的動(dòng)態(tài)變化，并預(yù)測耐藥性和表型轉(zhuǎn)化，最終提供真正個(gè)性化的醫(yī)療方法。液體活檢和無創(chuàng)分析無疑將繼續(xù)在NSCLC患者的整體評(píng)估和治療中發(fā)揮重要作用。但CTC行單細(xì)胞基因測序即免疫標(biāo)志物檢測與臨床現(xiàn)在常用的組織檢測結(jié)果并不完全一致，兩者誰更能代表腫瘤的特性目前并無統(tǒng)一的定論。需要進(jìn)一步的大樣本研究，CTC上動(dòng)態(tài)監(jiān)測基因靶向位點(diǎn)突變情況及免疫標(biāo)志物的變化有望成為NSCLC診斷和治療中不可或缺的常規(guī)評(píng)估方法。