李釔朋，閆文靜，章帆，舒渝茜，何治*

(1 三峽大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002；2 三峽大學(xué)健康醫(yī)學(xué)院，宜昌443002)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中以缺血性腦卒中為主，約占腦卒中的85%[1]。缺血性腦卒中一般由主要的大腦動脈嚴(yán)重狹窄或栓塞所致，特定大腦區(qū)域血流不足，在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)不可逆的組織損傷，并伴有腦水腫的快速發(fā)展，嚴(yán)重威脅患者身體健康[2]。

目前，治療缺血性卒中的方法是溶栓治療，由于重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator, r-tPA）的治療窗口較窄（大約為缺血后3～4.5 h），且r-tPA 與腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷相關(guān)，導(dǎo)致其應(yīng)用受限[3,4]。因此開發(fā)新的治療方法對于減少腦缺血所帶來的神經(jīng)損傷至關(guān)重要。

反式激活應(yīng)答DNA 結(jié)合蛋白43（transactive response DNA binding protein 43, TDP-43）是一種參與轉(zhuǎn)錄抑制和選擇性剪接DNA 和RNA 的結(jié)合蛋白。TDP-43 在許多神經(jīng)退行性疾病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的TDP-43 作為神經(jīng)退行性疾病的病理學(xué)標(biāo)記蛋白異常聚集和定位，可能成為治療缺血性卒中的潛在靶點(diǎn)[5]。本文將對TDP-43 的蛋白結(jié)構(gòu)、分布以及生理功能進(jìn)行概述，并綜述其TDP-在腦缺血發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 TDP-43 的結(jié)構(gòu)、分布與功能

TDP-43是一種由定位于人1號染色體Chrlp36.2上的TARDBP 基因編碼的DNA/RNA 結(jié)合蛋白，在進(jìn)化上高度保守，包含414 個(gè)氨基酸，相對分子量約為43kDa[6]。TDP-43 蛋白在結(jié)構(gòu)上屬于核內(nèi)不均一核糖核蛋白細(xì)胞核因子家族，由一個(gè)N 末端、兩個(gè)RNA 結(jié)合基序（RNA recognition motif, RRM）以及一個(gè)富含甘氨酸的C 端序列構(gòu)成。其N 端對維持TDP-43 的正常構(gòu)象和生物活性具有重要作用[7]，由1 個(gè)核定位信號（nuclear localization signal, NLS）、3個(gè)Caspase-3 識別位點(diǎn)以及一個(gè)核輸出信號（nuclear export signal, NES）構(gòu)成[8]。其中NES 和NLS 的突變是導(dǎo)致TDP-43 從胞核異常定位到胞質(zhì)的主要原因。在應(yīng)激條件下，TDP-43 蛋白還可被Caspase-3 切割為相對分子量為25kDa 和35kDa 大小的含C 末端的TDP-43 蛋白片段（C-terminal TDP-43 fragments,CTFs）。前者的異位表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TDP-43 包涵體形成，產(chǎn)生細(xì)胞毒性[9]。RRM 區(qū)域主要介導(dǎo)TDP-43與RNA 或者DNA 的結(jié)合[10]。TDP-43 蛋白C 端為甘氨酸富集區(qū)也被稱為類朊蛋白結(jié)構(gòu)域, 介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，而且該序列易于形成聚集體并可導(dǎo)致細(xì)胞毒性[11]。

TDP-43 蛋白在生理?xiàng)l件下廣泛分布于人體和嚙齒類動物的胎盤、脊髓、脾、睪丸、卵巢、胰腺、肺以及腦的細(xì)胞核中，在病理?xiàng)l件下形成不溶性泛素包合物，使TDP-43 從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的重新分布[12, 13]。

TDP-43 是一種具有多功能的核酸結(jié)合蛋白，能夠通過多種途徑調(diào)控RNA 的代謝、轉(zhuǎn)錄、剪接和翻譯[14,15]。例如，研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43 可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能，在肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）、阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease, AD）、腦缺血等神經(jīng)退行性疾病中扮演重要角色[16]。

2 TDP-43 在腦缺血中的作用

有研究表明，過表達(dá)TDP-43 的轉(zhuǎn)基因小鼠在短暫性腦缺血后，其梗塞的面積與正常小鼠相比更大、神經(jīng)元死亡數(shù)量也顯著增加[17]。TDP-43 還參與缺血性腦卒中病理生理過程的系列反應(yīng)，包括炎癥、細(xì)胞凋亡、血腦屏障功能障礙、自噬、線粒體功能障礙、以及氧化應(yīng)激等[17-19]。

2.1 TDP-43 在腦缺血發(fā)生后表達(dá)水平的改變

正常情況下TDP-43 主要分布在細(xì)胞核中，在病理?xiàng)l件下它可在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，以執(zhí)行多種細(xì)胞功能[20]。在疾病或者應(yīng)激狀態(tài)下，病理性的TDP-43 可由基因突變以及磷酸化、泛素化和N末端截短等修飾過程所導(dǎo)致，如在應(yīng)激條件下，胞質(zhì)TDP-43 與一些蛋白質(zhì)和RNAs 形成應(yīng)激顆粒，由細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)再分布和聚集體，細(xì)胞質(zhì)中TDP-43聚集體的持續(xù)積累，導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)游離的TDP-43 減少，進(jìn)而反應(yīng)性地促進(jìn)TDP-43 生成加劇，而細(xì)胞質(zhì)中TDP-43 的增加又干擾了細(xì)胞器的正常功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。

在大鼠大腦中動脈缺血90 min 再灌注1 d 后，缺血核心區(qū)以及半暗帶全長的TDP-43 含量下降，但是分子量為25kDa 的TDP-43 的C 末端片段含量均升高。急性缺血性腦卒中后TDP-43 的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，可在胞質(zhì)中檢測到全長的TDP-43 以及其25kDa 片段，但該片段不能在胞核中檢測到[21]。Kanazawa[21]等還發(fā)現(xiàn)，在急性缺血性腦卒中后，胞質(zhì)TDP-43 再分布的神經(jīng)元發(fā)生特異性泛素化，且呈現(xiàn)高比例細(xì)胞凋亡。在王錦[22]等研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠缺血再灌注3 d 后， TDP-43 的表達(dá)急劇上升，大腦皮質(zhì)、海馬以及紋狀體區(qū)域均出現(xiàn)聚集的顆粒樣包涵體，其中皮質(zhì)區(qū)域最明顯，并且向細(xì)胞核外遷移，部分細(xì)胞的核周細(xì)胞質(zhì)中也出現(xiàn)陽性反應(yīng)物。

以上提示, 腦缺血的發(fā)生會誘導(dǎo)TDP-43 表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)病理性TDP-43 聚集以及細(xì)胞質(zhì)再分布，這種表達(dá)變化會進(jìn)一步加重缺血性腦損傷。

2.2 TDP-43 參與腦缺血后炎癥反應(yīng)

過度的炎癥和免疫反應(yīng)是腦梗塞后缺血性腦損傷的病理生理基礎(chǔ)[23]，腦缺血后各種炎性因子、趨化因子以及轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生，會引起神經(jīng)元不可逆的損傷[24,25]。腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞激活，促進(jìn)細(xì)胞碎片的清除及神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，修復(fù)受損的組織，但是小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活而釋放的炎癥物質(zhì)會抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)，造成神經(jīng)元的損傷[26]。

有研究表明，TDP-43 過表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)激后導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β 等促炎因子增多[27]。小鼠腦缺血再灌注損傷模型中TDP-43 的上調(diào)增強(qiáng)了核因子κB 蛋白（nuclear factor kappa-B,NF-κB）介導(dǎo)的炎癥和神經(jīng)元損傷，而在給予NF-κB抑制劑后能有效改善TDP-43 所導(dǎo)致的神經(jīng)元炎性損傷[17]。這提示TDP-43 過表達(dá)可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，損傷神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)一步加重缺血性腦損傷。

2.3 TDP-43 介導(dǎo)線粒體功能障礙

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場所，它通過氧化磷酸化供給細(xì)胞能量[28]。卒中后神經(jīng)元因缺血缺氧損傷線粒體，進(jìn)而干擾磷酸化過程和三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）的供應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元可塑性降低[29]，并且線粒體功能障礙還與腦缺血中氧化應(yīng)激、凋亡等的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)[30]。TDP-43 的突變、過表達(dá)以及在線粒體中的異常積累會導(dǎo)致線粒體形態(tài)異常、功能障礙以及融合分裂動力學(xué)異常，從而損害細(xì)胞能量供應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[31]。

Wang 等[32]研究發(fā)現(xiàn)在TDP-43 轉(zhuǎn)基因小鼠中，細(xì)胞質(zhì)中TDP-43 的異常定位導(dǎo)致其在線粒體的蓄積并引發(fā)線粒體功能障礙，而在使用一種TDP-43 線粒體定位抑制酶后，胞質(zhì)中TDP-43 的異常聚集被清除，線粒體功能得以恢復(fù)，并且改善了轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知缺陷和運(yùn)動協(xié)調(diào)。同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)，糖氧剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予人參皂苷Rg1 后，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ的活性增強(qiáng)，并提高了ATP 的水平。提示人參皂苷可能通過促進(jìn)線粒體氧化磷酸化來改善線粒體功能，減輕OGD/R 之后星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷[33]。

由此可以推斷，細(xì)胞質(zhì)中TDP-43 的異常表達(dá)可引起線粒體功能障礙，減少能量供給，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞受損，加重腦缺血后腦損傷。

2.4 TDP-43 調(diào)節(jié)自噬

自噬是一種代謝機(jī)制，指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因調(diào)控下通過溶酶體囊泡結(jié)構(gòu)降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，這一過程能夠避免錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累[34]。有研究證實(shí)，受損的線粒體、蛋白質(zhì)、以及過氧化物酶體和病原體可以通過自噬選擇性降解，從而保護(hù)細(xì)胞出現(xiàn)代謝應(yīng)激防止細(xì)胞氧化損傷，而自噬對維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要[35,36]。

有研究表明，TDP-43 可通過增加自噬相關(guān)蛋白7、雷帕霉素靶蛋白相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白和動力蛋白激活蛋白的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)自噬。并且當(dāng)TDP-43 濃度降低后，這些自噬相關(guān)蛋白mRNA 的濃度也明顯降低[19,37]。

在腦缺血損傷后，自噬對神經(jīng)元起著雙重作用[38]。一方面，3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）可抑制自噬通路的激活，加劇神經(jīng)元的凋亡和壞死，增加大鼠缺血缺氧所致的腦梗塞體積和神經(jīng)功能損傷；另一方面在腦缺血前激活自噬通路可以增加蛋白激酶B（protein kinase B, PK）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein, CREB）的磷酸化，從而顯著減少神經(jīng)元死亡和腦損傷[39]。然而在自噬阻斷劑3-MA 的干預(yù)下，突變型TDP-43 及TDP43-CTFs25、TDP43-CTFs35的表達(dá)水平均增高，從反面證實(shí)了突變型TDP-43 及其C 末端截短片段可通過自噬通路降解。因此，抑制缺血后自噬可以增加TDP-43 及其C 末端截短片段TDP43-CTFs25、TDP43-CTFs35 聚集物的加劇累積，增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)激并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[40]。

2.5 TDP-43 促進(jìn)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，在缺血時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是I/R 損傷最常見的形式之一[41]，可誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有研究表明，細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致組織血流量減少，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生形態(tài)、生化和行為變化等[42-44]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）為MAPK 家族蛋白的重要一員，介導(dǎo)對外界應(yīng)激信號做出反應(yīng)的基本生物過程，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖和分化的作用，可以在各種應(yīng)激刺激下激活，并通過作用于下游靶點(diǎn)，如轉(zhuǎn)錄因子以及抗凋亡蛋白B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）并介導(dǎo)其多種功能[45]。

有研究表明當(dāng)JNK 通路被激活時(shí)，其下游凋亡相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)受到調(diào)控，引發(fā)細(xì)胞的凋亡[46]。磷酸化的JNK（P-hosphorylation-c-Jun n-terminal kinase, p-JNK）作為JNK 的活性形式，有研究表明腦缺血后p-JNK 的表達(dá)增強(qiáng)，表明腦缺血能夠通過JNK 信號通路激活細(xì)胞凋亡途徑并介導(dǎo)神經(jīng)元的損傷，引發(fā)神經(jīng)退變的過程[30]。在神經(jīng)元細(xì)胞中上調(diào)Ubiquilin-2 蛋白可以激活JNK 和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）增強(qiáng)NF-κB 活化使TDP-43 聚集[47]。另有報(bào)道，TDP-43 的過表達(dá)可以抑制JNK 和p38 的激活[48]。腦缺血后激活p-JNK 和磷酸化p38（P-hosphorylation-p38 MAPK, p-p38 MAPK）通路，使TDP-43 表達(dá)升高，而TDP-43 的過表達(dá)又反作用于p-JNK 和p-p38，降低其表達(dá)水平，使之呈現(xiàn)一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)，最終加劇神經(jīng)細(xì)胞死亡與神經(jīng)退行性病變的發(fā)生[30]。

由此提示，TDP-43 可通過JNK 信號通路，加劇細(xì)胞凋亡，引起神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)退行性病變的發(fā)生。

2.6 血腦屏障功能障礙

血腦屏障是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和緊密連接蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)元、周細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞等通過相互作用形成的一種動態(tài)屏障[49]。有研究表明，I/R 后血腦屏障被破壞，導(dǎo)致大量大分子、血細(xì)胞等進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)進(jìn)一步加重腦損傷引起神經(jīng)功能損害[50]。

Yes 相關(guān)蛋白（YES-associated protein, YAP）作為Hippo 信號通路的轉(zhuǎn)錄激活因子可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成，調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的生成與完整性[51-53]。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白，包括密封蛋白和閉合蛋白，是調(diào)節(jié)血腦屏障完整性和通透性的主要結(jié)構(gòu)[54,55]。有研究表明，在小鼠MACO 模型和體外原代腦內(nèi)皮細(xì)胞OGD/R 實(shí)驗(yàn)中，沉默全長的TDP-43 或者過表達(dá)TDP43-CTFs35可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中磷酸化的YAP（Phosphorylation YES-associated protein, p-YAP）與緊密連接蛋白含量降低，進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移[56]。由此可以推斷，TDP-43 和TDP43-CTFs35 通過Hippo-YAP 信號通路來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)腦內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白和p-YAP 的水平降低，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移導(dǎo)致血腦屏障功能障礙，阻礙腦缺血后神經(jīng)元修復(fù)[56,57]。

3 TDP-43 在腦缺血相關(guān)疾病中的作用

TDP-43 除了通過介導(dǎo)炎癥、細(xì)胞凋亡、血腦屏障功能障礙、自噬、線粒體功能障礙、以及氧化應(yīng)激等過程對缺血性腦卒中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用外，還血管性癡呆、腦缺血后繼發(fā)性脊髓損傷等腦缺血相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。

3.1 血管性癡呆

血管性癡呆是因大腦血流受阻而致腦細(xì)胞缺氧或缺少營養(yǎng)物質(zhì)供給，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的一種疾病。缺血性腦卒中患者往往累及大腦微動脈和微循環(huán)，引起血管管壁增厚和管腔狹窄，甚至血管栓塞，血流阻力大，組織供血、供氧不足，導(dǎo)致神經(jīng)元受損，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，促進(jìn)血管性癡呆的發(fā)展[58]。

Thammisetty[59]等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)閉塞小鼠單側(cè)頸總動脈引起慢性腦缺血（chronic cerebral hypoperfusion, CCH）會誘導(dǎo)TDP-43 的胞質(zhì)定位異常和不溶性磷酸化TDP-43 聚集物的形成，活化小膠質(zhì)細(xì)胞，激活炎癥反應(yīng)，使細(xì)胞代謝紊亂，神經(jīng)元受損，進(jìn)而發(fā)展成為認(rèn)知缺陷和運(yùn)動障礙。提示TDP-43 可以加重血管性癡呆并與血管性癡呆的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

3.2 腦缺血繼發(fā)性脊髓損傷

脊髓損傷是通過直接損傷脊髓實(shí)質(zhì)和相關(guān)的脊髓神經(jīng)造成感覺、運(yùn)動功能障礙和肌張力異常等[60]。腦缺血后，由于皮質(zhì)、海馬及紋狀體神經(jīng)元受損，其向脊髓傳遞信號發(fā)生異常變化，致使脊髓中膠質(zhì)細(xì)胞激活、炎性因子表達(dá)水平升高等繼發(fā)性神經(jīng)炎性反應(yīng)，可直接或間接地?fù)p傷前角運(yùn)動神經(jīng)元，加上前角運(yùn)動神經(jīng)元受上級神經(jīng)直接調(diào)控的異常影響，進(jìn)一步加深了神經(jīng)元的損傷[16]。

孫瀟[16]等人發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血后脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元中出現(xiàn)TDP-43 含量增加且出現(xiàn)從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)異位的現(xiàn)象，三七皂苷Rg1 可以緩解腦缺血所致的脊髓繼發(fā)性神經(jīng)退變和降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對腦缺血所引起的脊髓損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，腦缺血的發(fā)生會導(dǎo)致TDP-43 表達(dá)以及結(jié)構(gòu)和定位的變化，可能參與腦缺血損傷的病理生理過程, 包括氧化應(yīng)激、血腦屏障功能障礙、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、自噬和炎癥等。有研究表明，通過降低TDP-43 的表達(dá)可以有效緩解腦缺血所致的神經(jīng)損傷。關(guān)于具體哪種藥物可以降低TDP-43的表達(dá)研究相對較少，目前已有的報(bào)道僅有人參皂苷Rg1 和三七皂苷Rg1[16,30]。因此，TDP-43 作為一個(gè)潛在的靶點(diǎn), 為缺血性中風(fēng)的治療提供了新可能性，也為臨床新藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。后續(xù)的研究重點(diǎn)應(yīng)該集中于是否能將TDP-43 作為治療腦缺血的新靶點(diǎn)，尋找可以降低TDP-43 表達(dá)水平的具體物質(zhì)。另一方面，也可以探討將TDP-43 作為標(biāo)志物，開發(fā)新的關(guān)于腦缺血相關(guān)疾病的檢測手段。