呂子豪，周明旺*，王曉萍，吉星，李盛華

（1 中國融通醫(yī)療健康集團(tuán)有限公司淄博一四八醫(yī)院，淄博 255399；2 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；3 甘肅省中醫(yī)院，蘭州 730050）

關(guān)節(jié)軟骨由于缺少血管、神經(jīng)及淋巴系統(tǒng)[1]，且軟骨內(nèi)沒有巨噬細(xì)胞，損傷后壞死和凋亡的殘余物無法清除，抑制組織再生，因而輕微的軟骨磨損都會(huì)造成不可逆的傷害。關(guān)節(jié)脫位和半脫位、剝脫性骨軟骨炎與慢性退行性改變都會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷，這種損傷可單獨(dú)發(fā)生，也可能伴隨肢體畸形、半月板、韌帶損傷和骨缺損等[2]，因此關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)成為骨關(guān)節(jié)損傷及退行性病變中所面臨的一個(gè)巨大的難題?？寡姿帯㈥P(guān)節(jié)內(nèi)注射及矯形支具的使用僅能控制現(xiàn)有的癥狀，很難達(dá)到良好的療效。

傳統(tǒng)的軟骨修復(fù)手段有軟骨鉆孔術(shù)[3-4]、微骨折術(shù)[5-6]、骨膜移植、自體骨或同種異體骨移植[7-9]等，新興的工程軟骨組織[10]、水凝膠復(fù)合物輔助修復(fù)[11-12]等組織工程技術(shù)也逐步被應(yīng)用于軟骨修復(fù)治療之中。隨著干細(xì)胞研究的快速發(fā)展，脂肪組織、骨髓和臍帶等分離的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell,MSCs）在軟骨修復(fù)中顯示出更為廣闊的前景。

軟骨細(xì)胞無法產(chǎn)生足夠的功能性基質(zhì)以修復(fù)受損軟骨是骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）的顯著特征之一[13]。以胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells, ESC）、神經(jīng)祖細(xì)胞、MSCs 和造血干細(xì)胞等[14]為研究對(duì)象的再生醫(yī)學(xué)通過細(xì)胞療法、組織工程和基因療法修復(fù)人體功能失調(diào)、受損或缺失的細(xì)胞、組織和器官，以重現(xiàn)機(jī)體正常功能[15]。其中，MSCs 憑借其高增殖能力、軟骨分化能力和免疫抑制活性在OA 軟骨損傷的再生中發(fā)揮了重要作用[16]。目前，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的研究中，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的療法在軟骨修復(fù)方面已具有一定療效，干細(xì)胞與骨組織工程技術(shù)相結(jié)合也逐步應(yīng)用于臨床，例如3D 打印骨組織工程支架的技術(shù)通過負(fù)載干細(xì)胞起到對(duì)骨組織結(jié)構(gòu)修復(fù)及誘導(dǎo)干細(xì)胞的定向分化和增殖[17]。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨修復(fù)作用

MSCs 作為具有中胚層和神經(jīng)嵴起源的多能基質(zhì)細(xì)胞，可分化成多個(gè)細(xì)胞譜系并發(fā)揮旁分泌作用[18]，給包括骨骼疾病在內(nèi)的各醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了許多希望。成骨細(xì)胞、體外的軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞等通過骨髓、脂肪組織、肌肉、臍帶等的MCSs分化而來[19]，進(jìn)而修復(fù)或重建受損骨骼組織。在軟骨修復(fù)中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）、脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs）[20]等都顯示出了修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的潛力，但它們又有著各自的優(yōu)勢(shì)。

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

BMSCs 是組織工程軟骨構(gòu)建的理想種子細(xì)胞之一[21]，它取材方便、易于培養(yǎng)，具有分化為軟骨細(xì)胞的潛力，并通過分泌生物活性因子以防止軟骨的降解。BMSCs 通過多種方式參與軟骨的修復(fù)，一種載有BMSCs 的3D 生物打印多層支架通過促進(jìn)膠原蛋白II 和抑制股骨滑車骨軟骨缺損中的白細(xì)胞介素1β 來促進(jìn)軟骨形成[22]，并顯著改善大鼠受傷腿的地面支撐力、爪抓地力和步行步態(tài)參數(shù)等。TGF-β1或/和CDMP1 誘導(dǎo)BMSCs 表達(dá)膠原蛋白II、聚集蛋白聚糖和Sox9[23]，能增強(qiáng)細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡，并減輕兔喉軟骨缺損，降低特異性軟骨基質(zhì)標(biāo)志物水平。一種負(fù)載BMSCs 的新型動(dòng)態(tài)納米復(fù)合微凝膠組件，可臨床注射，其組織粘附性、微孔性及受控藥物釋放更加優(yōu)越，可為軟骨修復(fù)提供更優(yōu)的微環(huán)境[24]。有學(xué)者[25]發(fā)現(xiàn)使用熱敏甘油磷酸酯（GP）研發(fā)與聚賴氨酸改性殼聚糖聚合物（SF/PCS）共混的大分子絲素蛋——TGF-β1-SF/PCS 可注射水凝膠與BMSCs 有著良好的生物相容性，在軟骨修復(fù)的前景中較好。

除了BMSCs 有促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨再生的潛力[26]，其衍生的外泌體（BMSC-Exos）也可以對(duì)軟骨的再生起到促進(jìn)作用。BMSC-Exos 通過人臍帶沃頓氏膠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 表型的極化，抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)軟骨再生，減弱IL-1β 對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用[27]。不僅如此，BMSC-Exos 還可減輕軟骨損傷，減少骨贅形成和滑膜巨噬細(xì)胞浸潤，抑制M1巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生并促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞生成[28]。M2巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生精氨酸酶-1（arginase-1, ARG-1）和促軟骨形成細(xì)胞因子（如IL-10、IL-1RA 和TGFβ），BMSC-Exos 通過促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞的形成進(jìn)而加速軟骨修復(fù)進(jìn)程[29]。

由上可知，BMSCs 在軟骨修復(fù)中多通過生物工程組織架或者生物載體化合物等方式發(fā)揮其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用，比較突出的優(yōu)點(diǎn)是可臨床注射及受控藥物釋放性優(yōu)越，為藥物結(jié)合干細(xì)胞治療軟骨缺損提供了較為可靠的載體。研究者需進(jìn)一步明確其作為藥物載體的藥效釋放曲線，以及機(jī)體的免疫排異反應(yīng)情況。此外，由于制備BMSCs 的材料和工藝較為復(fù)雜，臨床應(yīng)用仍受到一定限制。

1.2 脂肪干細(xì)胞

雖然缺氧狀態(tài)下BMSCs 顯示出致密的軟骨形成顆粒和更高的軟骨形成潛力[30]，但在OA 的治療中，ADSCs 相比于BMSCs 更容易獲得[31]，它來源更廣泛、獲取更便捷、免疫原性較低，可以產(chǎn)生最佳數(shù)量的軟骨細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損[32]，因而廣泛用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐中。

ADSCs 往往通過生物結(jié)合技術(shù)發(fā)揮對(duì)軟骨修復(fù)的作用。ADSCs 不僅可改善膝關(guān)節(jié)和距骨骨軟骨局灶性缺損的軟骨再生修復(fù)[33]，還能作為顱面軟骨缺損或畸形修復(fù)的種子細(xì)胞[34]。ADSCs 與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)通過組織工程構(gòu)建軟骨復(fù)合物，成功修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損[35]。Ma 等[36]通過將ADSCs 加入含TGF-β3 的培養(yǎng)基中與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)ADSCs 的軟骨分化作用，表明ADSCs 和軟骨細(xì)胞與TGF-β3 的顆粒共培養(yǎng)可以構(gòu)建大量軟骨。ADSCs 衍生的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle,EVs）與殼寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）結(jié)合可逆轉(zhuǎn)IL-1β 對(duì)軟骨細(xì)胞活力和遷移的抑制，降低細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)，并改善OA 癥狀[37]。ADSCs 還可通過釋放多種旁分泌因子和EVs 來維持自我更新和增強(qiáng)多分化潛能，從而修復(fù)受損的軟骨[38]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，有雙皮質(zhì)素（doublecortex,DCX）表達(dá)的ADSCs 可增加軟骨組織中生長(zhǎng)分化因子5（growth and differentiation factor, GDF5）和母體蛋白2 的表達(dá)，顯著增加軟骨的修復(fù)，可用于治療局部軟骨損傷的軟骨組織中[39]。

由此可見，ADSCs 不僅通過釋放相關(guān)因子改善軟骨的修復(fù)，還可以作為種子細(xì)胞在軟骨修復(fù)中起到作用。相比于BMSCs，ADSCs 在獲取性及免疫原性方面更為優(yōu)越，可一定程度上解決制備可修復(fù)軟骨的干細(xì)胞材料和工藝較為復(fù)雜的問題，減少機(jī)體可能發(fā)生的排異反應(yīng)。

1.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞系（hUCMSCs）與人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells, hUCB-MSCs）具有比其他干細(xì)胞更高的增殖率、更好的穩(wěn)定性和更大的成軟骨潛力[40]，它在人體[41]和動(dòng)物體內(nèi)[42]都表現(xiàn)出了低免疫原性[43]及高增殖率[44]，更重要的是由于其來源于臍帶，采集過程無創(chuàng)，干細(xì)胞供應(yīng)也更為充足[45]。

在一項(xiàng)針對(duì)兔軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)中[46]，hUCBMSCs 不僅和兔骨髓干細(xì)胞（rBMMSCs）有著相對(duì)一致的治療方向，而且在軟骨缺損修復(fù)、組織學(xué)分析及生物力學(xué)測(cè)試中更優(yōu)于rBMMSCs的作用，對(duì)兔軟骨修復(fù)起到了更好的效果。利用UCMSCs 治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠（CIA）的實(shí)驗(yàn)表明，與未治療的CIA 大鼠相比，UCMSCs 治療CIA 大鼠的軟組織僅輕微腫脹，關(guān)節(jié)軟骨破壞較少，滑膜增生亦不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少，且UCMSCs 還通過降低破骨細(xì)胞前體的基因表達(dá)來減少CIA 大鼠的破骨細(xì)胞生成，從而使軟骨缺損自發(fā)修復(fù)不受抑制[47]。由于hUCB-MSC 在關(guān)節(jié)軟骨中的治療優(yōu)勢(shì)，新興干細(xì)胞療法中將其以復(fù)合物的形式投入使用，一種同種異體hUCB-MSC與透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合成的Cartistem干細(xì)胞藥物，用于OA 受損部位的軟骨修復(fù)療效明顯[48]。針對(duì)老年患者，hUCB-MSC 和4%透明質(zhì)酸鹽復(fù)合物（UCB-MSC-HA）的使用在軟骨修復(fù)等級(jí)及疼痛功能改善程度等方面優(yōu)于微骨折術(shù)[49]。碘乙酸單鈉（MIA）通過Caspase 3 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，hUC-MSCs 不僅可以幫助經(jīng)MIA 處理的軟骨細(xì)胞減少細(xì)胞凋亡，還可以促進(jìn)透明軟骨再生及損傷的修復(fù)，進(jìn)而起到關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)與修復(fù)作用[50]。hUCMSCs 與生物工程結(jié)合也逐步被應(yīng)用，利用沃頓膠（WJ）和硫酸軟骨素（CS）復(fù)合支架的三維多孔結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)負(fù)載hUCMSCs 在小鼠軟骨修復(fù)中也展現(xiàn)出了抑制免疫排斥和誘導(dǎo)宿主免疫耐受的能力，且修復(fù)后的組織與周圍正常組織融合良好，創(chuàng)面光滑完整[51]。

與BMSCs 的外泌體類似，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞小細(xì)胞外囊泡（hUCMSC-sEVs）同hUCMSCs 都可以顯著影響炎癥環(huán)境中的軟骨細(xì)胞活性和基質(zhì)重塑過程，經(jīng)過劃痕試驗(yàn)表明hUCMSC-sEVs 增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞的遷移，且與hUCMSCs 相比更有效地增加軟骨細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，修復(fù)的關(guān)節(jié)面也更為光 滑[52]。

作為新興干細(xì)胞療法中的一員，hU-MSCs 因其增殖性和穩(wěn)定性更強(qiáng)，且其采集過程無創(chuàng)、簡(jiǎn)便而在治療中被更多的選擇。hUCMSCs 不僅可以促進(jìn)軟骨的再生，還影響破骨作用，在軟骨修復(fù)等級(jí)及疼痛功能改善方面也優(yōu)于普通手術(shù)治療。

2 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞（ESC）來源于囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有無限增殖和胚層分化的潛力，一直是組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)[53]，hESC 衍生的軟骨細(xì)胞與膜結(jié)合產(chǎn)生的BMP-2 等分泌蛋白可以促進(jìn)BMSCs 誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨形成，并且經(jīng)該結(jié)合物處理后的軟骨缺損部位在生物力學(xué)方面表現(xiàn)出了優(yōu)于僅膜處理的軟骨缺損部位，瞬時(shí)彈性模量也更高，產(chǎn)生的修復(fù)組織更類似于天然軟骨，可長(zhǎng)期修復(fù)缺損的豬透明軟骨的功能。Gardner 等[54]發(fā)現(xiàn)hESC 衍生的關(guān)節(jié)軟骨除修復(fù)大鼠滑車關(guān)節(jié)軟骨外，單個(gè)軟骨植入物還有可能促進(jìn)新軟骨下骨的生成。來自hESC的軟骨形成細(xì)胞在小鼠皮下植入后保留了穩(wěn)定的軟骨形成表型[55]，即使植入的細(xì)胞和小鼠宿主細(xì)胞在區(qū)域上有界限，但在基底和側(cè)面與宿主組織結(jié)合良好。其中一部分植入物經(jīng)歷了類似于軟骨內(nèi)骨化的重塑過程，這也表明了單一軟骨植入物不僅可以修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，還可能促進(jìn)新軟骨下骨的生成[54]。在植入裸鼠髕骨溝的骨軟骨缺損處時(shí)，與軟骨形成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了軟骨修復(fù)[56]。源自人ESC的軟骨細(xì)胞對(duì)損傷的軟骨進(jìn)行修復(fù)后，I 型膠原蛋白染色情況與天然軟骨類似，且與僅植入纖維蛋白的對(duì)照組相比，軟骨形成細(xì)胞的修復(fù)得到了顯著改善[57]。這些研究表明了缺損的軟骨在植入hESC 衍生的軟骨細(xì)胞后，通過增強(qiáng)的軟骨形成起到修復(fù)缺損軟骨的作用。

盡管如此，從hESC 中獲得功能性軟骨細(xì)胞[58]仍較為困難，并且其牽扯到的倫理問題也很突出，免疫排斥反應(yīng)也較強(qiáng)，若要應(yīng)用于人體，必須進(jìn)行軟骨關(guān)節(jié)炎癥程度的評(píng)估和其他全身性疾病的篩查或排除[53]，這使得ESC 在臨床上的應(yīng)用受到了較大限制。

3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細(xì)胞重編程為多能性干細(xì)胞，與原代軟骨細(xì)胞的間接共培養(yǎng)可以直接誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的形成[59]。Guzzo 等人[60]研究發(fā)現(xiàn)iPSC 可增強(qiáng)軟骨形成能力，且較其他細(xì)胞相比更為優(yōu)越。iPSC相比于ESC，來源限制就相對(duì)小很多，并且iPSC 可以克服形成骨骺或肥大軟骨的問題[58]。iPSC 傾向于產(chǎn)生具有胚胎特征的細(xì)胞，這將為獲得具有類似軟骨自我修復(fù)活性的細(xì)胞提供機(jī)會(huì)[61]。iPSC 來源的人骨骼干細(xì)胞（hSSC）會(huì)向軟骨偏向分化[62]，為軟骨的修復(fù)提供支持。免疫原性方面，iPSC 具有一種免疫原性特性，而這種特性在干細(xì)胞進(jìn)行軟骨修復(fù)時(shí)發(fā)揮一定的作用[63]，且iPSC 與其他干細(xì)胞相比具有更有效的免疫調(diào)節(jié)作用，從hiPSC 獲得的軟骨祖細(xì)胞也表現(xiàn)出MSCs 的免疫表型特征[64]。通過iPSC（或ESC）的單層培養(yǎng)物首先分化為中內(nèi)胚層，然后進(jìn)一步分化為軟骨形成培養(yǎng)物，這是最接近自然發(fā)育的誘導(dǎo)人類軟骨分化的方法[65]。

雖然iPSC 沒有ESC 的倫理限制和免疫原性影響，但不可忽視的一點(diǎn)就是其臨床應(yīng)用成本高昂，而且很難制備無遺傳修飾的iPSCs，不僅如此，iPSCs臨床應(yīng)用的安全性也有待研究。這些問題限制了iPSCs的發(fā)展，但同時(shí)也為我們的研究指明了方向。

4 小結(jié)與展望

軟骨缺損的治療和修復(fù)作為世界性醫(yī)學(xué)難題，一直困擾著我們，如何對(duì)軟骨進(jìn)行精準(zhǔn)修復(fù)還未有十分明確的方案，應(yīng)用干細(xì)胞治療關(guān)節(jié)軟骨缺損更是學(xué)者們研究的焦點(diǎn)。BMSCs 取材方便、易于培養(yǎng)；ADSCs 與BMSCs 相比來源更廣泛、獲取便捷、免疫原性較低；hUCMSCs 與BMSCs 相比有更高的增殖率、更好的穩(wěn)定性；ESC 因受限于倫理問題，獲得性較差，加上免疫排斥反應(yīng)，限制其在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用；iPSC 克服了BMSCs 骨骺形成及肥大軟骨生成問題，但其臨床成本過于高昂。除此之外，滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（SF-MSCs）[66]、外周血來源的祖細(xì)胞[67]也屬于干細(xì)胞治療軟骨缺損的一個(gè)范疇。如何為關(guān)節(jié)軟骨缺損的醫(yī)療修復(fù)提供廉價(jià)、便捷、優(yōu)效的方案，克服干細(xì)胞來源問題，擺脫干細(xì)胞應(yīng)用于疾病治療時(shí)遇到的技術(shù)瓶頸，避免干細(xì)胞在應(yīng)用過程中產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)，以及結(jié)合生物組織工程學(xué)后怎樣保證干細(xì)胞穩(wěn)定性的問題，細(xì)胞應(yīng)用于人體的生物安全性問題，都是需要我們做進(jìn)一步研究及討論的難點(diǎn)。

我們應(yīng)該結(jié)合再生醫(yī)學(xué)、生物工程學(xué)、組織工程等多個(gè)學(xué)科進(jìn)行干細(xì)胞的應(yīng)用研究，從生理層面、病理層面及對(duì)軟骨修復(fù)的效率等多方面開展人體及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，為干細(xì)胞在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用提供更好的理論技術(shù)支持。盡管干細(xì)胞的高分化能力給予軟骨修復(fù)一定程度的幫助，但因其準(zhǔn)確性不佳、價(jià)格昂貴，仍無法廣泛投入臨床實(shí)踐應(yīng)用中。軟骨修復(fù)輔助蛋白因子受潛在的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性的限制，高劑量的蛋白質(zhì)可能帶來不利于機(jī)體的副作用，水凝膠復(fù)合物就此應(yīng)運(yùn)而生。干細(xì)胞通過結(jié)合水凝膠復(fù)合物，從而在軟骨修復(fù)等疾病中克服細(xì)胞自身生理特性的局限與蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性的限制，這項(xiàng)技術(shù)給了我們一定的啟發(fā)，隨著組織工程技術(shù)[68]、細(xì)胞膜片技術(shù)[66]、3D 打印工程支架技術(shù)[69]等多種技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞結(jié)合上述幾項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于軟骨修復(fù)可以避免干細(xì)胞不同種類本身所帶來的局限性，提高軟骨修復(fù)效率，降低損傷性和排異性，通過選擇最優(yōu)種類干細(xì)胞結(jié)合相關(guān)生物組織工程學(xué)技術(shù)而實(shí)現(xiàn)利用性最大化。

目前，我國實(shí)施“健康中國戰(zhàn)略”，干細(xì)胞技術(shù)與再生醫(yī)學(xué)結(jié)合應(yīng)用是落實(shí)該戰(zhàn)略部署的一個(gè)重要武器之一，應(yīng)用于軟骨損傷的修復(fù)治療前景無限，但研究對(duì)象多為動(dòng)物，在人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面還較為空白，是我們進(jìn)一步研究的方向和重點(diǎn)。