鄭海燕，方慶全，王玉環(huán)*

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003）

胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢查因其取材方法簡單、方便、快捷、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢(shì)已成為病理檢查的常規(guī)方法[1]。傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)涂片常因其細(xì)胞量少、細(xì)胞退變、結(jié)構(gòu)不清、或細(xì)胞與雜質(zhì)混雜重疊等原因，導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)診斷困難。液基細(xì)胞學(xué)檢查雖然改善了傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)的制片質(zhì)量，但此檢查方法處理的細(xì)胞樣本不易獲得細(xì)胞排列方式和背景對(duì)照細(xì)胞，導(dǎo)致難以鑒別可疑癌和高分化癌細(xì)胞、反應(yīng)性間皮細(xì)胞和間皮瘤等[2]，如果將胸腹水標(biāo)本加以處理制成細(xì)胞蠟塊，就可以很好地保持組織細(xì)胞的完整性，細(xì)胞蠟塊中細(xì)胞排列保留了與實(shí)體組織類似的結(jié)構(gòu)，并且細(xì)胞蠟塊能進(jìn)行后續(xù)特殊染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、原位雜交、PCR 等分子生物學(xué)檢測(cè)，將大大提高胸腹水脫落細(xì)胞病理學(xué)診斷的準(zhǔn)確性，為靶向治療提供可靠的依據(jù)[3]。本研究探討3 種不同固定方法對(duì)胸腹水沉淀物制作細(xì)胞蠟塊效果的影響，以期獲得較佳的胸腹水細(xì)胞蠟塊制作方法，提高診斷的準(zhǔn)確率，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 材料

收集2022 年6 月至12 月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科細(xì)胞學(xué)涂片確診見腫瘤細(xì)胞的胸腹水標(biāo)本48 例，其中胸水標(biāo)本42 例，腹水標(biāo)本6 例；男21例，女27 例；年齡25 ～84 歲。

2 方法

將送檢的新鮮胸腹水標(biāo)本靜置0.5 ～1 h，棄去多余上清液，混勻剩余液體后均分成A 組、B 組、C組，3000 r/min 離心5 min，棄上清。A 組加入5 倍以上體積的4%中性甲醛固定液固定4 h，棄上清后直接取出沉淀物，用包埋紙包裹后放入脫水盒常規(guī)脫水、包埋、切片、染色；B 組加液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液固定4 h，棄上清后直接取出沉淀物，用包埋紙包裹后放入脫水盒常規(guī)脫水、包埋、切片、染色；C 組加入5 倍以上體積的4%中性甲醛固定液，混勻，固定5 min，3000 r/min 離心5 min，棄上清，加入75%乙醇，1 min 后吸棄75%乙醇，加入適量的95%乙醇，室溫下靜置塑形2 h，倒去上清液，用包埋紙包裹后放入10%中性甲醛，進(jìn)入脫水程序，如果沉淀物較大者，用取材刀沿縱軸每間隔3 mm 平行切開，取其切面作為包埋面（D 組），包埋紙包裹后放入脫水盒常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、染色。

選取肺腺癌細(xì)胞蠟塊切片進(jìn)行HRP Multimer 法免疫組織化學(xué)染色，所用一抗包括抗細(xì)胞角蛋白7（CK7）、新天冬氨酸蛋白酶 A（napsin A）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF-1）均購自福州邁新公司。采用瑞士羅氏公司Ventana Benchmark XT 或Ventana Benchmark ULTRA 全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀染色。免疫組織化學(xué)切片的陽性信號(hào)均呈棕黃色顆粒狀。CK7 陽性定位于胞質(zhì)和胞膜，napsinA 陽性定位于胞質(zhì)，TTF-1 陽性定位于細(xì)胞核。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)分析組間差異，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 甲醛液固定后聯(lián)合95%乙醇塑形細(xì)胞蠟塊制作成功高

C 組細(xì)胞蠟塊制作成功率為100%（48/48），顯著高于A 組的72.9%（35/48，χ2=15.04,P＜0.01），也顯著高于B 組的60.4%（29/48，χ2=23.69,P＜0.01）。

2 甲醛液固定后聯(lián)合95%乙醇塑形細(xì)胞蠟塊肉眼觀質(zhì)量優(yōu)

A、B 組固定后獲得的沉淀物較松散，易破碎（圖1A、B）；C 組固定后獲得的沉淀物聚集成塊、富有彈性、結(jié)構(gòu)完整、可見細(xì)胞層次（圖1C）；沉淀物較大者，沿縱軸每間隔3 mm 平行切開，取其切面作為包埋面，可更大限度的保存標(biāo)本（圖1D）。

圖1 不同固定方式制成的細(xì)胞蠟塊肉眼觀。A，4%中性甲醛固定組；B，液基細(xì)胞學(xué)保存液固定組；C，甲醛固定后乙醇塑形組；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物較大沿縱軸平行切開組Fig. 1 Macroscopic view of cell wax blocks made by different fixation methods. A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, ethanol molding after formaldehyde fixation, large precipitate parallel incision along the longitudinal axis group

3 甲醛液固定后聯(lián)合95%乙醇塑形細(xì)胞蠟塊切片HE 染色結(jié)果較佳

A 組細(xì)胞量偏少，HE 染色較鮮艷，細(xì)胞輪廓較清晰，細(xì)胞排列較清楚（圖2A）；B 組細(xì)胞量少，HE 染色偏紅，細(xì)胞排列方式基本可見，細(xì)胞核保存欠佳，部分核有固縮現(xiàn)象（圖2B）；C 組細(xì)胞量大，HE 染色鮮艷，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞排列清楚可見，腫瘤細(xì)胞的核仁比較明顯（圖2C）；D 組可以最大面積的暴露組織切面，獲得更多的目的細(xì)胞，細(xì)胞量大，HE 染色鮮艷，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞排列清楚可見，腫瘤細(xì)胞的核仁比較明顯（圖2D）。

圖2 細(xì)胞蠟塊切片HE 染色鏡下形態(tài)。A，4%中性甲醛固定組（箭示核不規(guī)則的腫瘤細(xì)胞）；B，液基細(xì)胞學(xué)保存液固定組（箭示印戒樣腫瘤細(xì)胞）；C，甲醛固定后乙醇塑形組（箭示染色質(zhì)增粗的腫瘤細(xì)胞）；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物較大沿縱軸平行切開組（箭示核大而不規(guī)則的腫瘤細(xì)胞）；比例尺，100 μmFig. 2 Morphology of cell wax block section under HE staining. A, 4% neutral formaldehyde fixation group (arrow indicating a tumor cell with irregular nucleus); B, liquid-based cytology preservation solution fixation group (arrow indicating a signet ring cell-like tumor cell); C, formaldehyde fixed and ethanol molding group (arrow indicating a tumor cell with coarse chromatin); D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group (arrow indicating a tumor cell with large and irregular nucleus); scale bar, 100 μm

4 甲醛液固定后聯(lián)合95%乙醇塑形免疫組織化學(xué)標(biāo)記效果較好

A、B、C、D 4 組細(xì)胞蠟塊切片的CK7 免疫組織化學(xué)表達(dá)效果均較好，陽性標(biāo)記清晰易判，背景干凈（圖3A—D）；A、C、D 3 組細(xì)胞蠟塊切片的napsin A免疫組織化學(xué)表達(dá)效果均較好，陽性標(biāo)記清晰易判，背景干凈（圖4A、C、D），B 組細(xì)胞蠟塊切片napsinA 免疫組織化學(xué)表達(dá)效果欠佳，陽性標(biāo)記稍減弱（圖4B）；A、B、C、D 4 組細(xì)胞蠟塊的TTF-1 免疫組織化學(xué)表達(dá)效果均較好，陽性標(biāo)記清晰易判，背景干凈（圖5A—D）。

圖3 細(xì)胞蠟塊（胸水肺腺癌細(xì)胞）CK7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，4%中性甲醛固定組；B，液基細(xì)胞學(xué)保存液固定組；C，甲醛固定后乙醇塑形組；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物較大沿縱軸平行切開組；箭示陽性表達(dá)；比例尺，100 μmFig. 3 Immunohistochemical examination of CK7 in cell wax block (lung adenocarcinoma cells in pleural effusion). A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group; arrows indicate positive expression; scale bar, 100 μm

圖5 細(xì)胞蠟塊（胸水肺腺癌細(xì)胞）TTF-1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，4%中性甲醛固定組；B，液基細(xì)胞學(xué)保存液固定組；C，甲醛固定后乙醇塑形組；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物較大沿縱軸平行切開組；箭示陽性表達(dá)；比例尺，100 μmFig. 5 Immunohistochemical examination of TTF-1 in cell wax block (lung adenocarcinoma cells in pleural effusion). A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group; arrows indicate positive expression; scale bar, 100 μm

討 論

目前胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢查的幾種方法各有其優(yōu)劣勢(shì)。常規(guī)離心涂片法是病理科常規(guī)開展的項(xiàng)目，操作簡單，出報(bào)告快，但與技術(shù)員的技術(shù)水平密切相關(guān)，細(xì)胞沉淀取樣不當(dāng)、涂片厚薄不均等均會(huì)影響病理診斷結(jié)果，如果發(fā)現(xiàn)可疑腫瘤細(xì)胞，難以進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)導(dǎo)致不能完成定性診斷；液基細(xì)胞學(xué)制片法在樣本細(xì)胞量比較少時(shí)可以得到較高質(zhì)量涂片，但儀器與耗材成本較高，不適合基層小型醫(yī)院開展[4]；細(xì)胞蠟塊技術(shù)[5,6]將松散的細(xì)胞、組織碎片用石蠟包埋制成蠟塊，具有保存細(xì)胞新鮮、抗原保留完整、可長期保存、可反復(fù)連續(xù)切片、能進(jìn)行特殊染色、免疫組織化學(xué)、分子檢測(cè)等，可提高診斷的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)比較了3 種不同固定方法制作胸腹水細(xì)胞蠟塊的效果。A 組采用單純的10%中性緩沖甲醛液作為交聯(lián)劑，可以與蛋白質(zhì)相互交聯(lián)而發(fā)生沉淀，從而較好地保持細(xì)胞的完整性，穿透性較好，使細(xì)胞收縮小，對(duì)大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，但存在細(xì)胞不易凝結(jié)成塊的缺點(diǎn)，所以細(xì)胞丟失嚴(yán)重，沉淀物不易成型，易破碎,存在一定的制作失敗率，有一定比例的漏診率。B 組采用液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液作為固定劑[7]，是一種以乙醇為基礎(chǔ)的紅色固定劑，其主要成分可以溶解紅細(xì)胞并沉淀蛋白，并含有脂肪酸，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)此方法固定后細(xì)胞不易取樣包埋，存在較高的制作失敗率，而且所得的細(xì)胞蠟塊HE 染色伊紅深染偏紅，部分細(xì)胞空泡化，部分核有固縮現(xiàn)象，免疫組織化學(xué)標(biāo)記效果欠佳，分析原因是固定液中的脂肪酸被醇類變性，影響蛋白質(zhì)形成超聚集體，不利于包埋等操作，并且影響后續(xù)的染色，因此，B 組方法存在一定的漏診率與誤診率。C 組采用10%中性甲醛固定后再用乙醇進(jìn)行塑形，然后制成細(xì)胞蠟塊，不僅制作細(xì)胞蠟塊成功率高，而且細(xì)胞蠟塊切片HE 染色與免疫組織化學(xué)檢測(cè)效果均很好。

作者通過比對(duì)95%乙醇塑形0.5 h、1 h、2 h 的效果發(fā)現(xiàn)：95%乙醇分別塑形0.5 h、1 h 后，多數(shù)沉淀物存在半固態(tài)現(xiàn)象，沉淀物無法完全取出，試管壁會(huì)有部分沉淀物殘留；95%乙醇塑形2 h 后，沉淀物呈固態(tài)，可完整取出，試管壁無殘留，HE 及免疫組化染色結(jié)果良好，獲得的細(xì)胞數(shù)量較塑形0.5 h 與1 h明顯增加。因此，采用95%乙醇塑形2h 后制作細(xì)胞蠟塊的方法較佳[1]，制作成功率高。10%中性緩沖甲醛液作為交聯(lián)劑，可以與蛋白質(zhì)交聯(lián)沉淀，可以較好保持細(xì)胞的完整性，穿透性好，細(xì)胞收縮小，對(duì)大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好。95%乙醇為脂溶性有機(jī)溶劑，可幫助細(xì)胞沉淀凝固成塊，便于塑形，獲得的組織塊完整，實(shí)驗(yàn)得出此聯(lián)合固定法得到的細(xì)胞蠟塊HE 染色鮮艷，能清楚地展現(xiàn)完整的細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)標(biāo)記清晰容易判讀。

血性胸腹水離心后，沉淀物經(jīng) 10%中性甲醛固定后再用乙醇塑形，可聚集成塊。如果沉淀物內(nèi)含有腫瘤細(xì)胞，則沉淀物會(huì)分為上下兩層，上層為腫瘤細(xì)胞層，下層為血漿層，若沉淀物較大時(shí)，需用取材刀沿縱軸每間隔3 mm 平行切開，取其切面作為包埋面，這樣制作細(xì)胞蠟塊具有以下優(yōu)點(diǎn)：①蠟塊面橫向分為腫瘤細(xì)胞層與血漿層，制作切片時(shí)，由于包埋面是平面，所以不需要深修蠟塊，直接切片即可，不僅方便切片，還可最大程度地保護(hù)珍貴的細(xì)胞蠟塊內(nèi)的樣本；②細(xì)胞蠟塊內(nèi)擁有3 mm 厚的組織，不會(huì)因過度修片或者多次切片將腫瘤細(xì)胞層切光；③由于用切出來的平面作為包埋面，所以容易分辨，包埋此類細(xì)胞蠟塊時(shí)極為方便，不用擔(dān)心錯(cuò)將血漿層作為包埋面，也就不會(huì)因包埋面錯(cuò)誤造成漏診。

綜上所述，胸腹水沉淀物先固定后塑形再固定的方法操作簡便、成本低、制作成功率高、實(shí)用性強(qiáng)、效果好，能有效保護(hù)細(xì)胞形態(tài)、抗原、核酸等，能長期保存標(biāo)本，有利于后續(xù)做進(jìn)一步的檢測(cè)，值得推廣。