張帆，李柏霖，劉海琴，唐元瑜*

（1 福建中醫(yī)藥大學針灸學院，福州 350122；2 福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福州 350122；3 海軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院長征醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，上海 200003）

腦微血管內皮細胞( brain microvascular endothelial cells，BMECs)是構成血腦屏障的重要細胞組份之一[1]，在調節(jié)血液和大腦間的物質交換、維持中樞神經系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著關鍵作用，與臨床缺血性腦卒中、高血壓腦病、血管性癡呆等疾病的發(fā)生密切相關，是開展腦血管疾病研究的重要載體和工具細胞[2]。

目前國內外尚未成功建立大鼠BMECs細胞株，其主要的原代培養(yǎng)方法包括物理過篩法[3,4]、化學酶消化法[5,6]和組織塊法[7,8]。然而，每種方法都有其優(yōu)缺點，如化學酶消化法需要較長的消化時間和較高的實驗成本，而組織塊法則存在重復性較差和細胞純度較低等問題。為此課題組參考國內外相關文獻，通過不斷優(yōu)化實驗技術條件，最終采用實驗成本較低的單篩過濾法，成功培養(yǎng)出了數(shù)量足夠、活性較好、純度較高的大鼠BMECs?，F(xiàn)報道如下。

材料和方法

1 實驗動物

選取4 周齡的Sprague Dawley 大鼠4 只，雌雄不拘。購自上海斯萊克動物有限責任公司，動物質量合格證號為SCXK(閩)2022-0004。

2 主要試劑及儀器

胎牛血清（Gibco 公司）；M199 培養(yǎng)基（Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶混合酶液（含EDTA）（南京凱基生物公司）；肝素（南京新百藥業(yè)有限公司）；Triton-100（Solarbio 公司)；Ⅱ型膠原酶（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；Rabbit Anti rat-Ⅷ因子抗體（北京博奧森生物科技公司）；生物素標記的羊抗兔IgG、免疫組織化學試劑盒SABC 即用型、DAB 顯色劑均購自武漢博士德生物公司。超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司）；水平離心機（湖南湘儀公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；倒置相差顯微鏡（德國Leica 公司）。

3 大鼠BMECs 的原代培養(yǎng)

選取4 周齡SD 大鼠4 只，經斷頸處死、75%酒精浸泡消毒后，剪開顱骨，用眼科鑷無菌取出大腦皮質。在玻璃培養(yǎng)皿中去除腦干、小腦及皮質表面的軟腦膜、大血管等。將大腦皮質剪碎成大小約1mm×1mm×1mm 的組織小塊，使其通過孔徑為40 μm 的細胞篩網，收集網上截留的組織于15ml 錐底離心管中。離心，棄上清，向離心管底部沉淀中加入5 ml 0.1%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴震搖消化15～20 min。預冷PBS 液漂洗消化后的沉淀物，予M199 完全培養(yǎng)基4ml 重懸，接種于50 ml 進口Nunc 培養(yǎng)瓶中，并將其靜置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔24 h 換液1 次。

4 大鼠BMECs 的傳代培養(yǎng)

待細胞培養(yǎng)至接近90%的融合度時，吸取全部培養(yǎng)液，用37 ℃預熱的PBS 液漂洗2 次，然后加入4 ml 0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）溶液，室溫下消化5～10 min，期間間斷性地輕微震蕩培養(yǎng)瓶，以促進細胞脫落。鏡下觀察到大部分細胞變圓縮，開始從瓶壁脫落時，滴加4 ml 培養(yǎng)液以終止消化，吹打混勻，離心，收集沉淀，按1∶2 的傳代比例分瓶接種后，靜置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5 倒置生物顯微鏡觀察大鼠BMECs 的細胞形態(tài)

將培養(yǎng)有BMECs 的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、貼壁、出芽及融合等生長狀況，并拍照記錄。

6 免疫細胞化學染色法檢測大鼠BMECs 第Ⅷ因子相關抗原

待傳代于培養(yǎng)皿中的BMECs 增殖生長接近80%融合度時，用PBS 液漂洗5 min×3 次，滴加預冷的4%多聚甲醛，常溫固定細胞15 min；PBS 液漂洗5 min×3 次，滴加0.3% Triton X-100 常溫透膜15 min；PBS 液漂洗5 min×3 次，滴加5%BSA 室溫封閉20 min；甩棄封閉液，滴加稀釋度1∶300 的兔抗大鼠Ⅷ因子多克隆抗體，置于濕盒中4 ℃過夜；PBS液漂洗5 min×3 次，滴加羊抗兔IgG 二抗，37 ℃孵育30 min；PBS 液漂洗5 min×3 次，滴加SABC，37 ℃孵育30 min；PBS 液漂洗5 min×3 次，DAB 室溫顯色2 min；PBS 液再次充分漂洗后，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

結 果

1 原代大鼠BMECs 形態(tài)

倒置顯微鏡下可見：接種于培養(yǎng)瓶中的腦微血管段呈長短不一的短棍狀（圖1B、C）；24 h 后貼壁的血管段周圍爬出短梭形細胞，呈“蜈蚣蟲樣”的出芽式生長（圖1D—F）；48 h 后以血管段為中心的島嶼狀或團簇樣分布的細胞集落形成（圖1G—I）；72 h 后集落逐漸擴大，并相互融合成片（圖1J—L）；96 h 后血管段逐漸塌陷，管形消失，細胞鋪滿瓶底，呈典型的單層、鋪路石樣、鑲嵌式貼壁生長（圖1M—O）。

圖1 原代大鼠BMECs 生長情況及形態(tài) A，解剖獲得的大鼠大腦皮質；B 和C，短棍狀的腦微血管段；D—F，24 h 后血管段周圍爬出短梭形細胞，呈“蜈蚣蟲樣”出芽式；G—I，48 h 后以血管段為中心的島嶼狀或團簇樣分布的細胞集落形成；J—L，72 h 后細胞集落擴大，并逐漸融合成片；M—O，96 h 后細胞鋪滿瓶底，呈典型的單層、鵝卵石樣、鑲嵌式排列。比例尺：A，10 mm; B to N，200 μm；O，100 μmFig. 1 Growth and morphology of rat BMECs in primary culture. A, rat cerebral cortex obtained from dissection; B and C, short rod-like segments of brain microvessels; D to F, short spindle-shaped cells crawling out around the vessel segments after 24 h, exhibiting budding, centipede-like growth;G to I, cell colonies distributed in an island-like or cluster pattern centered around the vessel segments were formed after 48 h; J to L, the cell colonies expanded and gradually fused into patches by 72 h; M to O, cells covered the bottom of the flask, presenting a typical monolayer, cobblestone-like,mosaic arrangement, after 96 h. Scale bar∶ A, 10 mm; B to N, 200 μm; O, 100 μm

2 傳代大鼠BMECs 形態(tài)

1—3 代傳代細胞，其形態(tài)均一，均為短梭形，細胞間隙較大，表現(xiàn)為典型的單層、鵝卵石樣、鑲嵌式貼壁生長（圖2）。

圖2 傳代細胞生長情況及形態(tài)學觀察。 A—C，分別為1—3 代BMECs 傳代細胞，其形態(tài)均一，為短梭形，呈典型的單層、鵝卵石樣、鑲嵌式排列。比例尺，200 μmFig. 2 Growth and morphological observation of passaged cells. A to C, the 1st to 3rd passage BMECs, all of which have a uniform morphology, being short spindle-shaped, and presenting a typical monolayer, cobblestone-like, mosaic arrangement. Scale bar, 200 μm

3 大鼠BMECs 第Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色的檢測

免疫細胞化學染色檢測第Ⅷ因子相關抗原表達，倒置顯微鏡不同放大倍數(shù)下均可見細胞胞質淡染成棕紅色，表達為陽性，陽性細胞率達99%以上（圖3）。

圖3 大鼠BMECs 第Ⅷ因子相關抗原表達檢測 A—C，分別為不同倍數(shù)下細胞Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色，陽性細胞率達99%以上。比例尺：A，200 μm；B，100 μm；C，50 μmFig. 3 Detection of VIII factor-related antigen expression in primary culture of rat BMECs. A to C, immunocytochemical staining of factor VIII-related antigen at different magnifications, showing a positive cell rate of over 99%. Scale bar∶ A, 200 μm; B, 100 μm; C, 50 μm.

討 論

過篩法，是一種極具推廣性的BMECs 體外組織分離培養(yǎng)方法，其基本原理是采用一定孔徑大小的細胞篩網分離腦微血管段并進行體外培養(yǎng)。由于其操作簡單、污染機率小、實驗成本低，國內外諸多學者都傾向于采用此方法開展原代BMECs 的培養(yǎng)及其生物學特性研究。

大鼠BMECs 的原代培養(yǎng)始于20 世紀70 年代末，自國外學者BRENDEL[9]首次采用微孔過濾法獲得300 μm 以下的腦微血管段以來，過篩方法也在不斷地改進和優(yōu)化中，目前主要包括單篩過濾和雙篩過濾。根據(jù)實驗目的和要求的不同，選用的篩網目數(shù)也不一樣，如郭洋等[10]采用200 目和250 目兩種篩網連續(xù)過濾腦組織，獲得了直徑在61 μm～74 μm之間的微血管；鮑歡等[11]則采用100 目和200 目篩網，獲得了直徑在75 μm～150 μm 的微血管。在使用雙篩過濾法時，由于使用了雙層細胞篩網，導致腦微血管容易被篩網過度截留，造成其數(shù)量頓減而不能滿足實驗要求，因此研究者往往通過增加實驗大鼠的數(shù)量以彌補微血管段的損失，這也無形中增加了實驗成本和污染機率。為此，單篩過濾法被廣泛采用，如趙春雨[12]、徐建文等[13]采用200 目細胞篩網單層過濾，在篩網上均獲得了直徑在75 μm 以上的腦微血管，其數(shù)量也大幅度增加，實驗效率也相應得到了提高。

然而，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，盡管使用200 目篩網能獲得75 μm 以上腦微血管，但仍然有一定數(shù)量的更加細小的微血管可以通過200 目篩網而遺漏在網下的濾液中，并且其數(shù)量較大，不容忽視。因此，我們增加了篩網目數(shù)以減小孔徑大小，將200 目細胞篩改進為375 目進行單篩過濾，結果網上收集到的微血管數(shù)量明顯大幅度增加。后續(xù)實驗結果也進一步證實所培養(yǎng)的BMECs 增殖速度明顯加快，96 h即可鋪滿瓶底，達到融合狀態(tài)。其細胞形態(tài)均表現(xiàn)為內皮細胞樣的典型的單層、鵝卵石樣、鑲嵌式排列；第Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色檢測，細胞胞質呈現(xiàn)棕紅色，表達為陽性，陽性細胞率高達99%以上，提示所培養(yǎng)的內皮細胞純度較高。

綜上，我們積極改進物理過篩法，選用375 目細胞篩網，采取單篩過濾方法，成功地獲得了純度較高、活性較好的原代大鼠BMECs，為后期開展腦血管疾病的基礎研究提供了重要的細胞生物學實驗載體。