周錚錚，徐凱，陳義鋼，孫慶科*

（1 無錫市第八人民醫(yī)院腫瘤科，無錫 214000；2 無錫市第二人民醫(yī)院普外科，無錫 214000；3 火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心胸心外科，北京 100088）

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率均最高的癌癥[1]，其包括小細(xì)胞肺癌、大細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其中NSCLC病例約占據(jù)總肺癌的80%[2]。由于煙草消費(fèi)量增加和環(huán)境污染嚴(yán)重，NSCLC 的發(fā)病率每年都在增加[3,4]。雖然針對NSCLC 已經(jīng)取得了重要的臨床進(jìn)展，但由于NSCLC 發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚，因此肺癌最終治療效果尚不盡人意[3-5]。。

額外11-19 白血病融合基因蛋白（extra eleven-nineteen leukemia fusion gene protein, EEN）是含有SH3 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[6]，在哺乳動物中高度保守，且在多種生物活動中有重要作用，如內(nèi)吞、腫瘤發(fā)生和發(fā)展[7-9]。然而，EEN 在NSCLC 細(xì)胞增殖和存活以及腫瘤生長中的作用仍有待研究。因此，本研究通過觀察EEN 在NSCLC 組織和A549 細(xì)胞中的表達(dá)，然后觀察下調(diào)EEN 表達(dá)對A549 細(xì)胞生長與凋亡的影響及其機(jī)制，為揭示EEN 在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的作用與機(jī)制提供依據(jù)。

材料和方法

1 實驗試劑及儀器

A549 和BEAS-2B 細(xì)胞均購自中科院上海細(xì)胞庫，RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司，shRNA-EEN 質(zhì)粒與對照shRNA-Con 質(zhì)粒、小鼠抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、EEN、細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）、COX IV、β-actin和GAPDH一抗和辣根過氧化物酶綴合的羊抗小鼠IgG二抗均購自美國Santa Cruz Biotechnologies 公司；MTT 試劑、TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ROS 檢測試劑盒、線粒體膜電位（JC-1）檢測試劑盒、細(xì)胞質(zhì)核分離試劑盒、細(xì)胞蛋白提取試劑盒和Western blot 用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；細(xì)胞凋亡AnnexinV-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司。FACScanto II 型流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences 公司；SpectraMax i3x 型熒光酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices 公司。

2 組織樣本

收集2019 年1 月至2021 年1 月我院病理科留存的行NSCLC 手術(shù)切除的NSCLC 原發(fā)癌中心的腫瘤組織和配對的距腫瘤侵潤周圍約2 cm 的相鄰癌旁組織，共25 對組織。

3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將A549 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期A549 細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基同步化12 h后，按照轉(zhuǎn)染說明書步驟進(jìn)行sh-EEN 和sh-Con 轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h 后收獲細(xì)胞用于分析。

4 MTT 檢測

將已轉(zhuǎn)染sh-EEN 和sh-Con 的A549 細(xì)胞接種到96 孔板（4×103細(xì)胞/孔）中，分別在37 ℃、5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 和96 h，然后向每孔中加入20 μg/mL MTT 試劑，在37 ℃下孵育2.5 h。然后，除去培養(yǎng)基，加入100 μL MTT 增溶溶液，在37℃下震蕩使完全溶解，在酶標(biāo)儀上用620 nm 的參比濾光器在590 nm 處測量吸光度。

5 Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)

收獲轉(zhuǎn)染sh-EEN 和sh-Con 的A549 細(xì)胞，用冰冷PBS 洗滌，重懸浮于結(jié)合緩沖液中，室溫下用Annexin V-FITC 和PI 避光染色10 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

6 TUNEL 分析

將轉(zhuǎn)染sh-EEN 和sh-Con 的A549 細(xì)胞用4%多聚甲醛中固定后，用Triton-X 100 在4 ℃通透細(xì)胞5 min，按照TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明書，用TUNEL 反應(yīng)混合物在37 ℃避光條件下標(biāo)記細(xì)胞1 h，DAPI 染核5 min。使用Olympus BX50熒光顯微鏡隨機(jī)選擇5 個視野，并采用Image-Pro Plus 軟件計數(shù)TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)目。

7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平DCFH-DA 探針酶標(biāo)儀檢測

按照ROS 檢測試劑盒說明書，在室溫避光條件下使用熒光探針DCFH-DA 處理轉(zhuǎn)染sh-EEN 和sh-Con 的A549 細(xì)胞，通過熒光酶標(biāo)儀分別在480 nm和525 nm 的激發(fā)和發(fā)射波長下檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度值。

8 線粒體膜電位JC-1 探針-流式細(xì)胞術(shù)檢測

按照線粒體膜電位JC-1 檢測試劑盒說明書，在室溫避光條件下使用JC-1 探針處理轉(zhuǎn)染sh-EEN 和sh-Con 的A549 細(xì)胞，通過FACScanto II 流式細(xì)胞儀在525 nm 的發(fā)射波長下檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度值。

9 蛋白印跡實驗

用冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞，按照細(xì)胞質(zhì)核分離試劑盒和細(xì)胞蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞質(zhì)蛋白、線粒體蛋白和細(xì)胞全蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，進(jìn)行8% SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳分離的蛋白經(jīng)半干轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜用5%脫脂乳封閉后，在4 ℃下用1 ∶2000 稀釋的抗EEN、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cyt-c、COX IV 抗體以及1 ∶5000 稀釋的抗GAPDH 和β-actin 一抗孵育過夜。TBST 洗膜后，在4 ℃下用1 ∶2000稀釋的辣根過氧化物酶綴合的羊抗小鼠IgG 二抗孵育1 h。TBST 洗膜后，使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑使得目的蛋白顯像。通過Image-Pro Plus 軟件定量蛋白的光密度值，然后細(xì)胞質(zhì)和全蛋白以β-actin或GAPDH的光密度值為參考，線粒體蛋白以COX IV 的光密度值為參考，量化目的蛋白的相對表達(dá)水平。

10 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究中的所有數(shù)據(jù)至少來自3 次獨立實驗，定量數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組數(shù)據(jù)比較采用成組t檢驗。P值小于0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EEN 在NSCLC 組織和A549 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)

免疫組織化學(xué)染色顯示，NSCLC 組織中EEN表達(dá)水平高于癌旁組織（圖1A、B）。Western blot結(jié)果顯示，與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 細(xì)胞相比，EEN 在A549 細(xì)胞中的表達(dá)顯著增高（圖1C、D）。

圖1 NSCLC 組織和A549 細(xì)胞中EEN 表達(dá)增加。A 和B，NSCLC 腫瘤組織和癌旁組織中代表性EEN 免疫組織化學(xué)染色圖像（A）和EEN表達(dá)量的定量分析結(jié)果（B）；比例尺，50μm。C 和D，A549 細(xì)胞和BEAS-2B 細(xì)胞中EEN 表達(dá)的代表性Western blot 檢測（C）和定量分析（D）。***P＜0.001 vs BEAS-2B 細(xì)胞或sh-Con 轉(zhuǎn)染細(xì)胞；n=3Fig. 1 Increased EEN expression in NSCLC tissues and A549 cells. A and B, representative EEN immunohistochemical staining images (A) and quantitative analysis results of EEN expression level (B) in NSCLC tumor tissues and adjacent tissues; scale bar, 50μm; C and D, representative Western blot detection (C) and quantitative analysis (D) of EEN expression in A549 cells and BEAS-2B cells. ***P＜0.001 vs adjacent tissues or BEAS-2B cells; n=3

2 敲低EEN 抑制A549 細(xì)胞增殖

為了解EEN 在A549 細(xì)胞的作用，先用sh-EEN轉(zhuǎn)染細(xì)胞觀察敲低EEN 后的生物學(xué)效應(yīng)。Western blot 檢測顯示，轉(zhuǎn)染sh-EEN 的的A549 細(xì)胞中EEN的表達(dá)明顯降低（圖2A、B），表明敲低EEN 的細(xì)胞構(gòu)建成功。MTT 分析顯示，與轉(zhuǎn)染sh-Con 的A549細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染sh-EEN 的A549 細(xì)胞增殖力顯著減弱（圖2C）。

圖2 敲低EEN 抑制A549 細(xì)胞的增殖。A 和B，sh-EEN 沉默A549 細(xì)胞EEN 表達(dá)效果的代表性Western blot 檢測（A）和定量分析（B）。C，MTT 分析敲低EEN 對A549 細(xì)胞增殖的影響。*P＜0.05，***P＜0.001 vs sh-Con；n=3Fig. 2 Effect of EEN knockdown on A549 cell proliferation. A and B, representative Western blot detection (A) and quantitative analysis (B) for silencing effect of sh-EEN on EEN expression in A549 cells. C, MTT assay for the effect of silencing EEN on A549 cell proliferation. *P＜0.05, ***P＜0.001 vs sh-Con; n=3

3 敲低EEN 表達(dá)促進(jìn)A549 細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC/ PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，敲低EEN 表達(dá)后，A549 細(xì)胞的凋亡率明顯升高（圖3A、B）。TUNEL 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染sh-Con 的A549細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染sh-EEN的A549細(xì)胞中TUNEL陽性比例顯著升高（圖3C、D）。

圖3 敲低EEN 引起A549 細(xì)胞凋亡。A 和B，敲低EEN 對A549 細(xì)胞凋亡影響的代表性Annexin V-FITC/ PI 染色流式細(xì)胞術(shù)檢測（A）和統(tǒng)計分析結(jié)果（B）。C 和D，敲低EEN 對A549 細(xì)胞凋亡影響的代表性TUNEL 熒光染色（C）和統(tǒng)計分析結(jié)果（D）；綠色示TUNEL 陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）；比例尺，20μm。***P＜0.001 vs sh-Con 轉(zhuǎn)染細(xì)胞；n=3Fig. 3 A549 cells apoptosis induced by EEN knockdown. A and B, representative flow cytometry detection by Annexin V-FITC/ PI staining (A) and statistical analysis results (B) of the effect of EEN knockdown on apoptosis of A549 cells. C and D, representative TUNEL staining (C) and statistical analysis results (D) of the effect of EEN knockdown on apoptosis of A549 cells; green, TUNEL-positive cell (apoptotic cells); scale bar, 20 μm.***P＜0.001 vs sh-Con transfected cells; n=3

4 敲低EEN 促進(jìn)A549 細(xì)胞ROS 產(chǎn)生和線粒體膜電位丟失

熒光探針DCFH-DA 檢測ROS 水平的酶標(biāo)儀分析顯示，轉(zhuǎn)染sh-EEN 的A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著高于轉(zhuǎn)染sh-EEN 的A549 細(xì)胞（圖4A、B）。線粒體膜電位的JC-1 探針-流式細(xì)胞術(shù)分析表明，轉(zhuǎn)染sh-EEN 的A549 細(xì)胞的綠色熒光所占百分比顯著高于轉(zhuǎn)染sh-Con 的A549 細(xì)胞（圖4C、D），表明敲低EEN 降低A549 細(xì)胞線粒體膜電位。

圖4 敲低EEN 對A549 細(xì)胞ROS 水平和線粒體膜電位的影響。A 和B，敲低EEN 對A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平影響的代表性DCFH-DA 染色檢測（A）和統(tǒng)計學(xué)分析（B）。C 和D，敲低EEN 對A549 細(xì)胞線粒體膜電位影響的代表性JC-1 染色流式細(xì)胞術(shù)檢測（C）和統(tǒng)計學(xué)分析（D）。Mean±SD, n=3, ***P＜0.001 vs. sh-Con 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Fig. 4 Effect of EEN knockdown on ROS level and mitochondrial membrane potential in A549 cells. A and B, representative DCFH-DA staining assay for (A) and statistical analysis of (B) the effect of EEN knockdown on ROS level in A549 cells. C and D, representative JC-1 staining flow cytometry assay (C) and statistical analysis (D) for the effect of knocking down EEN on mitochondrial membrane potential in A549 cells. ***P＜0.001 vs sh-Con transfected cells; n=3

5 敲低EEN 上調(diào)促凋亡蛋白水平

Western blot 分析表明，敲低EEN 可降低線粒體中Cyt-c 水平（圖5A、B），增加細(xì)胞質(zhì)中Cyt-c水平（圖5A、C1）。此外，與轉(zhuǎn)染sh-Con 的A549比較，轉(zhuǎn)染sh-EEN 的A549 細(xì)胞中Bax 水平升高，Bcl-2 水平降低，同時Cleaved Caspase-3 水平升高(圖5D—G)。

圖5 敲低EEN 對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。A—C，線粒體和細(xì)胞質(zhì)中Cyt-c 表達(dá)的代表性Western blot 檢測（A）和統(tǒng)計學(xué)分析（B 和C）。D—G，Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 表達(dá)的代表性Western blot 檢測（D）及統(tǒng)計學(xué)分析（E-G）。Mean±SD, n=3, ***P＜0.001 vs. sh-Con轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Fig. 5 Effect of EEN knockdown on the expression of apoptosis-related proteins. A to C, representative Western blot assay (A) and statistical analysis(B and C) for the expression of Cyt-c in mitochondria and cytoplasm. D to G, representative Western blot assay (D) and statistical analysis (E to G) for the levels of Bax, Bcl-2 and Cleaved caspase-3 expression. ***P＜0.001 vs sh-Con transfected cells; n=3

討 論

在臨床上，大多數(shù)NSCLC 患者確診時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[10]。雖然，NSCLC 的整體5 年生存率在過去10年中略有增加（從15.7%增加到17.4%）[4-5]，但這種結(jié)果仍然不盡人意。因此，必須進(jìn)一步加強(qiáng)針對NSCLC 進(jìn)展機(jī)制的研究，開發(fā)針對NSCLC 有效的的療法。

有研究報道EEN 通過介導(dǎo)胰島素樣生長因子1（IGF-1）分泌來調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖和存活[8]，EEN 過表達(dá)與白血病發(fā)病相關(guān)[11]。然而，EEN 在NSCLC 細(xì)胞增殖和存活以及腫瘤生長中的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)EEN 在NSCLC 組織和A549 細(xì)胞中高表達(dá)，提示EEN 表達(dá)可能與肺癌進(jìn)展有關(guān)。為進(jìn)一步明確EEN 與NSCLC 的關(guān)系，我們通過sh-EEN 來干擾EEN 在A549 細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低EEN 可以抑制A549 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是最有效的癌癥治療方法之一[12]。細(xì)胞凋亡主要通過死亡受體介導(dǎo)的途徑和線粒體依賴途徑介導(dǎo)[13]。線粒體依賴途徑在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)過程中起重要作用，其起源于線粒體去極化，由Bcl-2 蛋白家族成員調(diào)節(jié)，觸發(fā)Cyt-c 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而引起Caspase-3 活化并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。因此，本研究進(jìn)一步研究敲低EEN 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑，發(fā)現(xiàn)敲低EEN 能促使A549 細(xì)胞線粒體膜電位丟失。另外，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高可使細(xì)胞線粒體膜電位的去極化，并發(fā)生細(xì)胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低EEN 能促使細(xì)胞ROS 水平升高，推測線粒體膜電位丟失可能與下調(diào)EEN 促使ROS生成水平相關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。線粒體膜電位的去極化與細(xì)胞凋亡相關(guān)的線粒體功能障礙有關(guān)[15,16]。為進(jìn)一步確認(rèn)下調(diào)EEN 是影響線粒體依賴途徑，本研究通過Western blot 檢測線粒體依賴途徑相關(guān)關(guān)鍵凋亡分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低EEN 可降低線粒體中Cyt-c 蛋白的表達(dá)同時增加其在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，提示敲低EEN 能促進(jìn)A549 細(xì)胞Cyt-c 釋放到細(xì)胞質(zhì)。本研究還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)EEN 可增加Bax表達(dá)、降低Bcl-2 表達(dá)，同時增加Cleaved Caspase-3表達(dá)，由此表明敲低EEN 通過線粒體依賴途徑促使A549 細(xì)胞凋亡。