李欽麗，張繼偉*

（1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院病理科，武漢 430022；2 武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，武漢 430040）

隨著間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）抑制劑的研發(fā)與臨床應(yīng)用取得較大突破，ALK 基因融合已成為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者重要的驅(qū)動靶點，ALK 陽性的NSCLC 患者可顯著獲益于ALK 抑制劑[1]。臨床檢測中常用于ALK檢測的方法主要包括免疫組織化學(xué)（IHC）、熒光原位雜交（FISH）和熒光定量PCR （qRT-PCR）等。因與其他檢測方法相比，RT-PCR 法由于檢測周期短、結(jié)果易于判讀及可與EGFR 等其它驅(qū)動基因進(jìn)行聯(lián)合檢測等優(yōu)點，而得到廣泛應(yīng)用，但RT-PCR 法進(jìn)行ALK 融合基因檢測是基于mRNA 的擴(kuò)增，其對于樣本質(zhì)量的要求較高[2]。本研究通過對HE 染色切片褪色后用RT-PCR 法行ALK 融合基因的檢測進(jìn)行分析，探討褪色后的樣本能否滿足ALK 融合基因的檢測，能否為腫瘤組織不足NSCLC 患者的后續(xù)治療提供可靠依據(jù)。

材料與方法

1 材料

選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院病理科經(jīng)檢測確認(rèn)ALK 基因融合為陽性的NSCLC 標(biāo)本3 例，每例標(biāo)本各選取一個蠟塊，4 μm 厚連續(xù)切片6 張，隨機(jī)分為對照組（未進(jìn)行HE 染色的石蠟樣本切片）、HE 染色切片高錳酸鉀草酸褪色組和HE染色切片鹽酸乙醇褪色組，每組2 張切片。

核酸提取試劑盒（FFPE RNA）和人類ALK 基因融合檢測試劑盒（熒光定量PCR 法）購自廈門艾德公司；ALK Ventana-D5F3 OptiView DAB檢測試劑盒購自美國羅氏公司；ALK 基因重組熒光原位雜交法檢測試劑盒（Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit）購自美國雅培公司。Mx3000P 型熒光定量PCR 儀購自美國安捷倫公司；SMA4000 超微量紫外可見核酸蛋白分析儀購自廈門艾德公司；CLEARERTM （康萊）透明脫蠟劑購自武漢同聲科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 HE 染色

組織切片65 ℃烤片3 min，康萊2 次×5 min，康萊1 次×3 min，無水乙醇1 次×3 min，無水乙醇1 次×2 min，90%和80%乙醇各1 次×30 s，水洗2 min，蘇木精染液浸染10 min，水洗2 min，0.3%鹽酸乙醇分化1 s，水洗1 min，飽和碳酸鋰水溶液返藍(lán)15 s，水洗1 min，80%乙醇醇化30 s，1%醇溶性伊紅染液浸染40 s，80%乙醇15 s，90%乙醇30 s，無水乙醇2 次×1 min，，二甲苯2 次×2 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.2 HE 褪色

將HE 切片加熱后，置入康萊中浸泡至蓋玻片自行脫落。洗凈殘存的中性樹膠后，梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）脫去康萊，用蒸餾水沖洗后采用以下2 種方法褪色。方法一：將切片放入新鮮配置的1%鹽酸乙醇，待組織完全變白后用蒸餾水沖洗干凈，顯微鏡下觀察褪色效果。方法二：將切片放入0.5%高錳酸鉀氧化，蒸餾水沖洗干凈，2%草酸溶液漂白，待組織完全變白后用蒸餾水沖洗干凈，顯微鏡下觀察褪色效果。

2.3 標(biāo)本RNA 的提取和定量

按照核酸提取試劑盒（FFPE RNA）說明書的操作方法，提取3 組標(biāo)本的RNA，并用SMA4000 超微量紫外可見核酸蛋白分析儀測量RNA 的濃度及純度。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取出相應(yīng)數(shù)量的ALK 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管，室溫解凍后，快速離心15 s；取出ALK 逆轉(zhuǎn)錄酶，快速離心15 s，放置于冰架上；分別移取0.5 μL ALK 逆轉(zhuǎn)錄酶至ALK 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中，混勻后快速離心15 s；移取6 μL 待測樣本RNA 至ALK 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中，混勻后快速離心15 s； 42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min 后冰上冷卻，得到的cDNA 溶液用于PCR 擴(kuò)增。

2.5 PCR 擴(kuò)增和結(jié)果判讀

取出預(yù)分裝的PCR 反應(yīng)試劑，按照人類ALK基因融合檢測試劑盒的要求依次分別加入純化水作為陰性對照、待測樣本RNA 逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 和ALK 陽性質(zhì)控品作為陽性對照，蓋緊管蓋短暫離心后，放入熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為第一階段：95℃ 5 min，1 個循環(huán)；第二階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15 個循環(huán)；第三階段：93℃ 25 s，60 ℃35 s，72 ℃ 20 s，31 個循環(huán)。60 ℃時收集FAM 標(biāo)記的ALK 熒光探針和HEX 標(biāo)記的外控?zé)晒馓结樀臒晒庑盘?。EML4-ALK擴(kuò)增所用引物序列：上游——5’-AAAACTACTGTAGAGCC-3’，下游——5’-AGCTCCATCTGCATGGCTTG-3’；外控HPRT1 擴(kuò)增所用引物序列：上游——5’-TTTCCTTGGTCAGGCAGTATAATCC-3’，下游——5’-TTATATCCAACACTTCGTGGGGTCC-3’。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，嚴(yán)格按照人類ALK 基因融合檢測試劑盒的判讀要求進(jìn)行樣本結(jié)果判讀。

2.6 RNA 完整性檢測

RNA 的降解程度可以根據(jù)RNA Integrity Number (RIN)值[3]進(jìn)行評定，RIN 值范圍為1～10，不同數(shù)值代表著樣品RNA 的不同降解程度，RIN 值越高，表明RNA 質(zhì)量越好。RIN 值用Agilent 2100 Bioanalyser 和 RNA 6000 LabChip 進(jìn)行檢測。

2.7 免疫組織化學(xué)與熒光原位雜交

ALK Venana-D5F3 免疫組織化學(xué)用OptiView DAB 檢測試劑盒在 BenchMark XT 自動染色機(jī)上進(jìn)行染色，染色步驟遵循標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，由兩名有經(jīng)驗的病理科診斷醫(yī)生進(jìn)行結(jié)果判讀。使用Vysis ALK break-apart FISH probes Kit 進(jìn)行FISH 檢測，按照試劑盒說明書進(jìn)行手工操作及結(jié)果評估。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用表示，兩組間比較采用配對樣本t檢驗，P＜ 0.05 為結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HE 染色與褪色降低RNA 濃度

按照核酸提取試劑盒的要求進(jìn)行RNA 提取，各組樣本RNA 均用50 μL 的洗脫液進(jìn)行洗脫。3 組樣本RNA 的純度均在1.8～2.0 之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；高錳酸鉀草酸褪色組RNA 濃度低于對照組，鹽酸乙醇褪色組RNA 濃度低于高錳酸鉀草酸褪色組和對照組（表1)。

表1 RNA 的濃度和純度比較Tab. 1 The comparison of RNA concentration and purity

2 HE 染色鹽酸乙醇褪色對ALK 融合基因qRTPCR 檢測無明顯影響

按照人類ALK 基因融合檢測試劑盒的要求，各組樣本均用60 ng RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行ALK 基因融合檢測。對照組外控曲線和ALK 基因融合曲線的Ct 值分別為19.98±0.37 和18.23±0.32，鹽酸乙醇褪色組外控曲線和ALK 基因融合曲線的Ct 值分別為19.41±0.20 和18.76±0.17，兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)，符合試劑盒的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，為明確的ALK 基因融合陽性，而高錳酸鉀草酸褪色組的外控和ALK 基因融合均無擴(kuò)增曲線升起（圖1），無法進(jìn)行結(jié)果判讀。

圖1 HE 染色鹽酸乙醇褪色對ALK 基因融合qRT-PCR 檢測的影響分析。A，外控擴(kuò)增曲線；B，ALK 基因融合擴(kuò)增曲線；紅色曲線，陽性對照；灰色曲線，陰性對照；綠色曲線，白片組；黃色曲線，鹽酸乙醇褪色組；藍(lán)色曲線，高錳酸鉀草酸褪色組Fig. 1 Analysis of effect of HE stained section discoloration by hydrochloric acid ethanol on RT-qPCR detection of ALK fusion gene. A, externally controlled amplification curve; B, ALK gene fusion amplification curve; red curve, positive control; gray curve, negative control; green curve, control group; yellow curve, hydrochloric ethanol fading group; blue curve, potassium permanganate oxalate fading group

3 HE染色鹽酸乙醇褪色對RNA完整性無明顯影響

為明確HE 切片褪色樣本RNA 對RT-PCR 法檢測ALK的影響，本研究利用Agilent 2100 Bioanalyser分析了各組樣本RNA 的完整性。通過對3 組樣本RNA 的RIN 值分析比較發(fā)現(xiàn)，鹽酸乙醇褪色組RIN值（2.23±0.13）與對照組（2.28±0.10）相近，高錳酸鉀草酸褪色組的RIN 值（1.73±0.12）明顯低于對照組和鹽酸乙醇褪色組（圖2）。

圖2 HE 染色與褪色對RNA 完整性影響的的Agilent 2100 檢測。A，RNA 完整性代表性Agilent 2100 檢測結(jié)果； B，RIN 值統(tǒng)計學(xué)分析（n=3）Fig. 2 Agilent 2100 detection for the effect of HE staining and fading on the integrity of extracted RNA. A, representative Agilent 2100 detection of RNA intergrity; B, quantitative analysis of RIN value (n=3)

4 HE 染色與褪色不改變ALK 基因融合狀態(tài)

為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究最后通過免疫組織化學(xué)與熒光原位雜交對所選擇的經(jīng)RT-PCR 檢測ALK 基因融合為陽性的3 例NSCLC標(biāo)本進(jìn)行驗證，結(jié)果表明3 例NSCLC 標(biāo)本ALK Ventana-D5F3 免疫組織化學(xué)染色和ALK-FISH 均為明確陽性（圖3）。

圖3 HE 染色與褪色對ALK 基因融合狀態(tài)的影響。A，ALK Ventana-D5F3 免疫組織化學(xué)檢測；B，ALK-FISH 檢測。比例尺：A，50 μm；B，5 μmFig. 3 The effect of HE staining and fading on the fusion status of ALK gene. A, ALK Venana-D5F3 immunohistochemical examiantion; B, ALK-FISH examination; scale bar∶ 50 μm in A, 5 μm in B

討 論

對于不可進(jìn)行手術(shù)的晚期NSCLC 患者，如果ALK 基因融合檢測陽性可顯著受益于ALK 抑制劑治療，這一發(fā)現(xiàn)使得ALK成為NSCLC中除EGFR外的另一個重要檢測靶點[4]。中國非小細(xì)胞肺癌ALK檢測臨床實踐專家共識推薦的ALK 檢測人群主要包括：①病理學(xué)診斷為肺浸潤性腺癌（包括含腺癌成分）的患者；②經(jīng)活檢組織病理學(xué)診斷為非腺癌的晚期NSCLC 患者[2]。NSCLC 患者ALK 基因融合檢測標(biāo)本類型首選腫瘤組織標(biāo)本；如果腫瘤組織標(biāo)本不能滿足檢測需求時，可以用細(xì)胞學(xué)標(biāo)本替代；對于組織或者細(xì)胞學(xué)標(biāo)本獲取均受限的晚期NSCLC患者，也可以用血液或腦脊液進(jìn)行檢測。但在實際檢測過程中由于細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和血液或腦脊液標(biāo)本受到腫瘤細(xì)胞比例和檢測方法的限制，利用腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行ALK 基因融合檢測仍然是目前最可靠、最敏感的檢測方法。對于失去手術(shù)機(jī)會的晚期NSCLC患者，已不能獲取腫瘤組織標(biāo)本，或者僅能獲取穿刺活檢標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)病理診斷后剩余較少組織，將影響后續(xù)檢測工作。

研究證實HE褪色后可以進(jìn)行免疫組織化學(xué)[5]、熒光原位雜交(FISH)[6]和特殊染色[7]的檢測，由此解決了由于組織量少而無法進(jìn)行相應(yīng)檢測的問題，對于病理診斷有重要價值。但是利用HE 切片褪色后提取RNA 進(jìn)行ALK 基因融合檢測，目前國內(nèi)鮮有報道。以往研究發(fā)現(xiàn)蘇木精染色對PCR 檢測可造成顯著影響[8]，因此，HE 染色切片徹底褪色是進(jìn)行基因檢測的前提。

本研究通過采用鹽酸乙醇褪色法和高錳酸鉀草酸氧化漂白法對HE 染色切片褪色，并對從褪色HE染色切片提取的RNA的濃度和純度進(jìn)行分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組RNA 的純度與對照組相比無顯著差異，但RNA 濃度卻顯著降低，其中鹽酸乙醇褪色組的RNA 濃度也顯著低于高錳酸鉀草酸褪色組。原因可能為由于RNA 不穩(wěn)定，組織在進(jìn)行HE 染色和褪色過程中不同程度地導(dǎo)致了RNA 的降解，其中用鹽酸乙醇褪色法導(dǎo)致RNA 降解的程度更大。

本研究將3 組標(biāo)本RNA 用RT-PCR 法行ALK基因融合檢測，在RNA 均為 60 ng 條件下，鹽酸乙醇褪色組外控Ct 值和ALK 基因融合Ct 值與對照組相比無顯著差異，均為明確的ALK 基因融合陽性，而高錳酸鉀草酸褪色組外控和ALK 基因融合均無曲線升起。通過檢測3 組標(biāo)本RNA 的RIN 值，發(fā)現(xiàn)其原因可能為HE 染色切片經(jīng)高錳酸鉀草酸褪色時，盡管獲取的RNA 濃度高于鹽酸乙醇褪色組，但是由于高錳酸鉀為強(qiáng)氧化劑，在處理過程中嚴(yán)重破壞了RNA 的完整性所致。

綜上所述，對于樣本量不足或進(jìn)一步獲取組織樣本受限時，可以用HE 染色切片褪色后通過RTPCR 法行ALK 基因融合檢測，但褪色方法應(yīng)選擇1%鹽酸乙醇褪色法，因為該方法與高錳酸鉀草酸氧化漂白法相比，能較好地保證有效RNA 的質(zhì)量，保證ALK 基因融合檢測結(jié)果的可靠性。同時本研究也為樣本量不足的NSCLC 患者進(jìn)行ROS1 和RET 融合檢測及利用二代測序(NGS)技術(shù)檢測未知的ALK基因融合奠定了基礎(chǔ)，有利于NSCLC 患者個體化治療方案的實施。