朱克玉，宋淵*，沈稼軒，喬靖，韓瀟，王恒杰

（1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730030；2 甘肅省中醫(yī)院，蘭州 730050）

隨著工業(yè)和農(nóng)業(yè)化進(jìn)程，復(fù)雜的手工操作，各類(lèi)軟組織缺損傷逐漸增多。一期閉合傷口，降低感染率，恢復(fù)其良好的外形及功能是一個(gè)難題。皮瓣移植技術(shù)是解決此類(lèi)損傷最常用、最有效的辦法。缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion, I/R）是造成皮瓣移植術(shù)后皮瓣壞死的主要原因，是皮瓣從供區(qū)轉(zhuǎn)移至創(chuàng)面的過(guò)程中，組織經(jīng)歷缺血、重新獲得血液灌注或供氧后所產(chǎn)生的一系列損傷[1]。皮瓣壞死后需行復(fù)雜的重建修復(fù)手術(shù)，給患者帶來(lái)心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)I/R 的主要病理機(jī)制有炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、鈣超載、鐵死亡、細(xì)胞凋亡等[3]。這些體外或體內(nèi)應(yīng)激性刺激造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的強(qiáng)氧化環(huán)境被破壞，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)障礙，產(chǎn)生突變的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)二硫鍵不能形成，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 （endoplasmic reticulum stress, ERS)[4]。細(xì)胞為了消除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚的未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（unfloded protein response,UPR）[5]。細(xì)胞自噬是伴隨UPR 發(fā)生的另一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制, 幫助降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白，降低ERS，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定性，保護(hù)細(xì)胞存活[6,7]。近年來(lái)研究表明[8,10]，I/R 與ERS 誘導(dǎo)的自噬密切相關(guān)，中醫(yī)藥干預(yù)ERS-自噬成為防治I/R 損傷的新方法。本文就近年來(lái)關(guān)于該方面的研究進(jìn)展作一綜述，旨在為I/R 防治尋找新的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在真核細(xì)胞內(nèi)具有重要的生理功能，能協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)折疊，脂質(zhì)合成和鈣儲(chǔ)存與釋放，具有很強(qiáng)的活躍性，當(dāng)受到缺血缺氧、未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量堆積、Ca2+平衡破壞、蛋白質(zhì)糖基化抑制等內(nèi)源或外源因素刺激時(shí)均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能受損，從而引起ERS[11]。細(xì)胞自噬是真核生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的一類(lèi)降解途徑，通過(guò)自噬體將蛋白質(zhì)等生物大分子、線粒體等細(xì)胞器以及微生物等回收至溶酶體形成自噬溶酶體，再降解為氨基酸、單糖等小分子，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)循環(huán)再利用的動(dòng)態(tài)過(guò)程[12]，因此，ERS 和細(xì)胞自噬是兩個(gè)獨(dú)立的生物過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明[13,14]，二者存在相互作用，ERS 可引發(fā)自噬，自噬通過(guò)降解積聚的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)來(lái)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。當(dāng)ERS 持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，細(xì)胞激活UPR 信號(hào)通路以應(yīng)對(duì)環(huán)境變化，恢復(fù)利于蛋白質(zhì)折疊的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。若ERS 不能逆轉(zhuǎn)，UPR 激活細(xì)胞自噬甚至誘發(fā)細(xì)胞凋亡，以實(shí)現(xiàn)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[15]。葡萄糖調(diào)控蛋白（glucose-regulated protein78, GRP78）作為ERS 標(biāo)志蛋白，對(duì)于ERS 誘導(dǎo)自噬發(fā)生非常重要，在發(fā)生ERS 時(shí)，GRP78 的表達(dá)量顯著增高，大量積聚的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白優(yōu)先與GRP78 結(jié)合，導(dǎo)致GRP78 與UPR 的類(lèi)PKR 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKRlike endoplasmic reticulum kinase, PERK）、肌醇需求激酶1α（inositol requiring enzyme 1α, IRE1α）、轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor-6, ATF6）3種感受器分離，激活UPR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白降解，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境的穩(wěn)定[16,17]。可見(jiàn)，ERS 和細(xì)胞自噬是細(xì)胞在程度不同的刺激因素下產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，二者相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)。輕度的ERS 引起的UPR是一種防御機(jī)制，維護(hù)細(xì)胞和機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。持續(xù)發(fā)生的ERS 則能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，發(fā)揮類(lèi)似UPR 的補(bǔ)充機(jī)制，進(jìn)一步降解異常蛋白質(zhì)和受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，并通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制ERS，減弱環(huán)境刺激對(duì)細(xì)胞的影響，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[18]。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在缺血/再灌注損傷中的作用

I/R 是皮瓣不可避免的一個(gè)極其復(fù)雜的病理、生理過(guò)程，其機(jī)制包括缺血和再灌注兩部分[19]。缺血過(guò)程會(huì)導(dǎo)致三磷酸腺苷（ATP）減少、細(xì)胞內(nèi)代謝性酸中毒、線粒體和細(xì)胞內(nèi)鈣超載等；再灌注過(guò)程會(huì)引起活性氧、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、自身免疫反應(yīng)等[20,21]。因此，全面認(rèn)識(shí)I/R 的機(jī)制，尋找多方法、多渠道的干預(yù)措施才能預(yù)防和治療I/R 損傷，并能減少皮瓣術(shù)后的并發(fā)癥[22]。研究表明[23]ERS 參與I/R損傷過(guò)程，ERS 預(yù)處理可以提高組織缺血再灌注損傷的耐受性，其可能的效應(yīng)機(jī)制[24,25]：一方面，上調(diào)GRP78 蛋白表達(dá)增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊蛋白能力；另一方面，抑制 CHOP 信號(hào)途徑激活，減少細(xì)胞凋亡、減輕組織炎性反應(yīng)。GRP78 和CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的兩個(gè)經(jīng)典標(biāo)志物[26]。ERS 早期，細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)特異信號(hào)系統(tǒng)，促使GRP78表達(dá)上調(diào)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊的和未折疊的蛋白結(jié)合，恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。但在過(guò)久的ERS 情況下CHOP 被大量誘導(dǎo)表達(dá)，從而啟動(dòng)CHOP 介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡[27]。因此，通過(guò)抑制ERS 反應(yīng)，可以有效預(yù)防細(xì)胞凋亡，使I/R 病理進(jìn)程得到抑制。以上研究提示以ERS 為干預(yù)靶點(diǎn)，可能為阻斷皮瓣缺血誘導(dǎo)I/R 損傷提供一種新方法。

3 自噬在缺血/再灌注損傷中的作用

自噬是細(xì)胞在溶酶體內(nèi)消化細(xì)胞質(zhì)的現(xiàn)象，其主要功能是清除和回收錯(cuò)誤折疊或損壞的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，這與細(xì)胞的存活和凋亡密切相關(guān)[28]。自噬是一把“雙刃劍”，在皮瓣缺血階段，自噬降解非功能性胞質(zhì)蛋白，為關(guān)鍵生命活動(dòng)提供關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)，從而抑制細(xì)胞凋亡和壞死[29]。最新研究表明[30]，自噬是減少缺血后損害的必要條件，自噬過(guò)程可通過(guò)去除受損的線粒體來(lái)限制NLRP3 炎性小體（inflammasome）的活化。但是，過(guò)度自噬在再灌注階段可能會(huì)對(duì)皮瓣產(chǎn)生負(fù)面影響。研究顯示[31]，中藥可能通過(guò)缺血期誘導(dǎo)自噬發(fā)生，再灌注期抑制自噬來(lái)發(fā)揮抗I/R 損傷的作用。I/R 通過(guò)抑制自噬體的形成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡增加[32]。因此，自噬是I/R損傷的重要病理機(jī)制之一，利用自噬的雙重作用及特點(diǎn)和功能，通過(guò)藥物干預(yù)細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，促進(jìn)皮瓣成活，可能是未來(lái)防治皮瓣I/R 損傷的主要策略。

4 中藥干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬防治I/R 損傷

近年來(lái)隨著I/R 損傷相關(guān)研究的不斷深入，中藥單體、提取物及復(fù)方通過(guò)干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-自噬相關(guān)因子的表達(dá)，提高皮瓣成活率成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。中藥以其多靶點(diǎn)、效應(yīng)廣，副作用少等優(yōu)勢(shì)在I/R 損傷治療藥物中的地位日益提高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟，其治療機(jī)制研究也日益增多。本部分總結(jié)近年來(lái)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志細(xì)胞因子GRP78、CHOP，自噬相關(guān)研究的熱點(diǎn)或關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子LC-3、beclin-1、mTOR 和P62，以及中藥的調(diào)控作用與機(jī)制。

4.1 中藥干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

4.1.1 中藥單體和中藥

Pan 等[33]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以上調(diào)GRP78，下調(diào)p-PERK 和CHOP 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，減輕細(xì)胞損傷，從而減輕I/R 損傷。代小蘭等[34]發(fā)現(xiàn)白芍總苷干預(yù)能夠顯著降低大鼠腦組織GRP78、p-PERK、CHOP、NF-κB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)，抑制過(guò)度ERS 介導(dǎo)達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)I/R 損傷起保護(hù)作用[35,36]。實(shí)驗(yàn)表明，香葉醇降低ERS 相關(guān)蛋白PPERK、ATF4、CHOP 和GRP78 和促凋亡蛋白BAX的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白BCL-2 的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，減輕I/R 損傷[37]；柚皮苷顯著抑制 GRP78、CHOP、Caspase-12 和ATF6 蛋白的表達(dá)，對(duì)I/R 引起的ERS 具有抑制作用[38]；絞股藍(lán)苷XVII 顯著降低GRP78、ATF6、CHOP 的表達(dá)和PERK 的磷酸化，對(duì)ERS 具有抑制作用[39]；黃芪素下調(diào)ERS 相關(guān)蛋白GRP78 及其下游凋亡介質(zhì)CHOP 和Caspase-12的表達(dá)水平，防止I/R 誘導(dǎo)的損傷[40]；川芷素預(yù)處理顯著下調(diào)ERS 相關(guān)信號(hào)分子GRP78，CHOP 和caspase-12 蛋白質(zhì)水平，上調(diào)p-PI3K 和p-AKT 的水平，減輕I/R 引起的損傷[41]；龍血竭灌注可以上調(diào)BCL-2 蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、GRP78、CHOP-1、p-P38、p-JNK-1、pERK 蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，抑制ERS，進(jìn)而達(dá)到抗I/R 損傷的作用[42]。

4.1.2 中藥復(fù)方

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是清代名醫(yī)王清任的經(jīng)典方。具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功效。程一升等[43]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可下調(diào)GRP78、PERK、elF2α、ATG12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬相關(guān)基因的表達(dá)改善缺血再灌注損傷。清熱活血湯由黃芩、丹參、赤芍、川芎、紅花等組成，具有清熱解毒、活血化瘀之效。李睿等[44]研究發(fā)現(xiàn)清熱活血湯下調(diào)Bax /Bcl-2、GRP78、CHOP、P62 的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、FAM134B 蛋白表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其凋亡通路激活，減輕組織損傷?！督饏T要略》中栝蔞桂枝湯具有抗炎、抗氧化應(yīng)激的作用[45]，可以減少氧化應(yīng)激、促進(jìn)Ca2+動(dòng)態(tài)平衡來(lái)抑制I/R 損傷引起的ERS與細(xì)胞凋亡[46]。陳喆鳴等[47]發(fā)現(xiàn)栝蔞桂枝湯治療后可明顯下調(diào) GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3，上調(diào)Bcl-2 mRNA 的表達(dá)，下調(diào)ERS 水平，抑制下游凋亡通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮治療I/R 作用。加味益氣通玄方由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍、水蛭、全蝎九味中藥組成，彭艷等[48]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)加味益氣通玄方可以通過(guò)抑制GRP78、caspase12 和CHOP 的表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

4.2 中藥干預(yù)自噬

4.2.1 中藥單體

有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷促進(jìn)細(xì)胞活力并平衡Bcl-2 和Bax 表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，降低P62 表達(dá)，增加LC3II / LC3I 表達(dá)，表明黃芪甲苷通過(guò)促進(jìn)自噬程度來(lái)下調(diào)細(xì)胞凋亡，對(duì)I/R 損傷起保護(hù)作用[49]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葛根素預(yù)處理降低beclin-1 的表達(dá)和LC3-II/LC3-I 比率，以及p-AMPK 和pS317-ULK1水平，相較之下增加p62、mTOR 和pS757-ULK1 的表達(dá)水平，抑制I/R 誘導(dǎo)的自噬，治療I/R 損傷[50]。再灌注后beclin1、LC3 和P62 表達(dá)升高，細(xì)胞自噬增加；川芎嗪干預(yù)后beclin1、LC3 和P62 蛋白表達(dá)相對(duì)降低，表明川芎嗪可能對(duì)細(xì)胞自噬有抑制或調(diào)節(jié)作用[51]。松香素能降低LC3II 和Beclin1 的表達(dá)，并增加p62 的水平，減少I(mǎi)/R 大鼠細(xì)胞自噬的過(guò)度激活[52]。在天麻素預(yù)處理的細(xì)胞模型中，LC3II 的表達(dá)增加，p62 被抑制，表明自噬的誘導(dǎo)增強(qiáng)；同時(shí)，串聯(lián)熒光監(jiān)測(cè)顯示天麻素預(yù)處理增強(qiáng)自噬流量，消除功能失調(diào)的線粒體，減少細(xì)胞死亡，從而減輕I/R損傷[53]。

4.2.2 中藥復(fù)方

活血解毒湯具有清熱解毒，活血止痛之功效。主瘀血阻滯，日久化熱?；钛舛痉筋A(yù)處理可降低組織中的自噬：beclin-1 和LC3-II 減少，Bcl-2，p62 和LC3-I / LC3-II 的比率增加，改善組織I/R 損傷[54]。實(shí)驗(yàn)證明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)SIRT1/自噬途徑增加beclin 1 和LC3-II 以及減少p62，促進(jìn)自噬的重要調(diào)節(jié)因子sirtuin1 (SIRT1) 的表達(dá)，顯著增強(qiáng)自噬，減輕I/R 損傷[55]?；瘽峤舛净钛ńj(luò)方可明顯降低缺血再灌注后的自噬水平，下調(diào)LC3、Beclin1、Atg5 的表達(dá)，上調(diào)P62 蛋白的表達(dá)，有效改善I/R 損傷[56]。清熱化瘀方顯著降低I/R 大鼠組織Nix 及beclin-1、LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ表達(dá)，抑制線粒體自噬，同時(shí)降低ROS、TNF-α 和IL-6 水平，改善大鼠I/R 損傷[57]。桃紅四物湯預(yù)處理后自噬標(biāo)記蛋白LC3-II / LC3-I、beclin1、Atg5 和線粒體自噬標(biāo)記蛋白Parkin（PINK-1）的表達(dá)顯著升高，活性氧、NLRP3 炎癥小體和促炎細(xì)胞因子明顯減少，從而保護(hù)細(xì)胞免受I/R 損傷[58]。

5 總結(jié)

皮瓣I/R 損傷是一個(gè)復(fù)雜的生理病理過(guò)程，涉及大量的細(xì)胞類(lèi)型、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志細(xì)胞因子GRP78、CHOP 及自噬熱點(diǎn)因子LC-3、beclin-1、P62、mTOR 等密切相關(guān)，在治療I/R 中具有巨大的潛力，中藥可能通過(guò)干預(yù)ERS-自噬等位點(diǎn)起效。本文重點(diǎn)討論了ERS、自噬在皮瓣I/R 損傷中的作用及中藥對(duì)相關(guān)因子的調(diào)控趨勢(shì)，歸納ERS、自噬對(duì)皮瓣I/R 損傷的保護(hù)作用及相應(yīng)機(jī)制。兩種機(jī)制相互協(xié)同，相互促進(jìn)，形成一系列的反應(yīng)來(lái)促進(jìn)皮瓣的成活。但目前缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)、大樣本的臨床研究及循證數(shù)據(jù)支持。中藥單體或復(fù)方具有高效低毒、多靶點(diǎn)及多通路協(xié)調(diào)作用的顯著優(yōu)勢(shì)，在本文文獻(xiàn)回顧中，大量中藥單體及復(fù)方調(diào)控相關(guān)因子表達(dá)，干預(yù)ERS、自噬，減輕I/R 損傷，達(dá)到提高皮瓣成活率的目的，但其中蘊(yùn)藏著龐大而錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制著I/R 的發(fā)展轉(zhuǎn)歸，后期還需通過(guò)“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)+細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”等手段對(duì)有效成分及作用機(jī)制研究，同時(shí)進(jìn)行大樣本臨床隨機(jī)對(duì)照研究，進(jìn)而分析中藥治療皮瓣I/R 損傷的優(yōu)勢(shì)所在。