金艷麗 蘭曉君 姚拓 丁小琴

摘要：為獲取對當(dāng)歸和羌活生長具有促生作用的促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR），以當(dāng)歸、羌活的根系為研究對象，利用選擇性培養(yǎng)基分離具有固氮、溶磷和分泌3-吲哚乙酸（IAA）能力的菌株。通過對菌株的固氮酶活性、溶磷能力及分泌IAA的能力進(jìn)行測定，篩選出促生性能優(yōu)良的菌株；進(jìn)一步通過生理生化指標(biāo)和16S rDNA序列分析相結(jié)合的方法分析優(yōu)良菌株的分類地位。結(jié)果表明，共篩選到12株具有固氮酶活性的菌株，其固氮酶活性為0.30～4.04 nmol C2H4·mL-1·h-1；6株溶解無機磷的菌株，溶磷量為290.98～420.33 μg·mL-1；3株產(chǎn)IAA的菌株， IAA分泌量為10.38～18.63 μg·mL-1。經(jīng)鑒定，溶磷特性優(yōu)良的菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）和錯玫桿菌屬（Falsirhodobacter），假單胞菌屬為優(yōu)勢菌屬。綜合各菌株的促生特性，篩選出2株促生性能優(yōu)良的菌株：WQP-5（Pseudomonas grimontii）和MDP-8（Pseudomonas thivervalensis），為開發(fā)適用于甘肅道地藥材當(dāng)歸與羌活專用生物菌肥提供了優(yōu)良菌種。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；羌活；促生菌；固氮；溶磷；3-吲哚乙酸doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0534

中圖分類號：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2023）01018710

當(dāng)歸（Angelica sinensis）具有廣泛的藥理活性，藥用價值較高，能夠抗癌、抗衰老并增強免疫功能［1］；傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，當(dāng)歸具有補氣活血、調(diào)理經(jīng)絡(luò)和潤腸通便的功效［2］。羌活（Notopterygiumincisum）也是一種藥用植物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有消炎、鎮(zhèn)痛、解熱、抗心律失常、抗心肌缺血、促進(jìn)腦部血液循環(huán)、預(yù)防血栓形成等作用［3-5］，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有解表散寒、祛風(fēng)勝濕、止痛等功效［6］。當(dāng)歸與羌活均為甘肅道地藥材，是道地藥材中的“西北藥”。道地藥材是在一定的生產(chǎn)區(qū)域內(nèi)生產(chǎn)，能夠長期、穩(wěn)定地滿足市場需求，并經(jīng)臨床或現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)驗證的優(yōu)質(zhì)中藥材，在中醫(yī)藥市場上具有一定地位［7］。為了提高當(dāng)歸與羌活的藥材產(chǎn)量，藥農(nóng)大量施用化肥和農(nóng)藥，肖婉君等［8］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在當(dāng)歸成藥期一般田地磷酸二銨的施用量為400～450 kg·hm-2。大量施用化肥不僅會造成土壤退化板結(jié)、農(nóng)殘超標(biāo)，還會降低藥材品質(zhì)［9-11］。生物菌肥是生物肥料的一種，具有環(huán)境友好、作用時間長、改善土壤結(jié)構(gòu)的優(yōu)良特性［12］，應(yīng)用前景廣闊。生物菌肥研發(fā)的基礎(chǔ)是獲取促生特性優(yōu)良的植物根際促生菌（plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR），Kloepper 等［13］將PGPR 定義為定殖于植物根際區(qū)域可促進(jìn)宿主生長的有益細(xì)菌。Vessey 等［14］和 Weller 等［15］認(rèn)為，滿足定殖、促進(jìn)植物生長和生防作用三個功能中的兩個就可被定義為PGPR。近年來，對PGPR的研究多針對糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，從蔬菜［16］、萵筍［17］、珠芽蓼［18］、紅三葉［19］、黑果枸杞［20］等植物根際均分離出具有良好特性的促生菌。藥用植物與其根際促生菌間存在著一定的互作關(guān)系［21］，然而，目前對藥材植物根際微生物的研究較少。因此，本研究以甘肅岷縣的當(dāng)歸和渭源縣的羌活根系為研究對象，分離篩選具有促生特性（固氮、溶磷、分泌IAA等）的促生菌，并對優(yōu)良菌株進(jìn)行鑒定，為后續(xù)開發(fā)適用于甘肅道地藥材當(dāng)歸與羌活專用生物菌劑提供優(yōu)良菌種和研究基礎(chǔ)，對生產(chǎn)綠色中藥材及保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

當(dāng)歸樣品采集于甘肅岷縣西寨鎮(zhèn)（34°48′33.6″N、103°80′47.9″E，海拔2 651 m）；羌活樣品采集于甘肅渭源縣會川鎮(zhèn)（N 35°09′70.7″、E 103°98′85.9″，海拔2 149 m）。采用五點取樣法選擇長勢良好的植株，去除植株地上部分，將根連同根系土壤混合后裝入無菌自封袋中，低溫運輸至實驗室，48 h內(nèi)進(jìn)行樣品處理。

1.2 培養(yǎng)基

試驗所用培養(yǎng)基包括： LB培養(yǎng)基、NFM培養(yǎng)基［22］、NBRIP（National Botanical Research InstitutesPhosphate medium）培養(yǎng)基［23］、蒙金娜有機磷培養(yǎng)基［24］和KingB培養(yǎng)基［25］。

1.3 植物根際促生菌的分離純化及其測定

1.3.1 涂布液制備 抖落根系附著的土壤，將抖落虛土后的根系稱取10 g置于盛有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，搖床震蕩30 min（180 r·min-1），靜置10 min后用移液器吸取1 mL懸液加入盛有9 mL滅過菌生理鹽水的試管中，制得10-1土壤梯度稀釋液，依次配制10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋液，充分混勻備用。

1.3.2 固氮菌分離純化 分別吸取不同樣本10-3、10-4、10-5的梯度稀釋液100 μL，分別接種于滅菌的NFM固體培養(yǎng)基上。將接種好的培養(yǎng)皿置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后，用接種環(huán)挑取NFM 培養(yǎng)基上不同的單菌落，用四區(qū)劃線法反復(fù)純化至菌落均一，經(jīng)結(jié)晶紫或美蘭簡單染色后在顯微鏡（1 000×，油鏡）下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定為純化合格的菌株后，將菌株轉(zhuǎn)接至LB固體斜面置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 固氮特性測定 菌株的固氮酶活性采用乙炔還原法進(jìn)行測定［26］。將待測菌株活化后與無菌水配制成108 cfu·mL-1的菌懸液，吸取10 μL菌懸液接入盛有NFM半固體培養(yǎng)基的血清小瓶中（血清瓶體積15 mL，NFM半固體培養(yǎng)基5 mL），每個菌株3 個重復(fù)，對照為等量不接菌。接種后28 ℃培養(yǎng)48 h，用一次性注射器從每個小瓶中抽出1 mL 氣體，然后再注入1 mL 乙炔氣體，28 ℃培養(yǎng)48 h，最后吸取50 μL的氣體注入氣相色譜儀（GC7890B），色譜條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄C2H4出峰時間及峰面積百分比，計算菌株的固氮酶活性。

1.3.4 溶磷菌的分離純化 用移液器分別吸取不同樣本10-3、10-4、10-5梯度稀釋液100 μL，分別接種于滅菌的NBRIP和Menkina固體培養(yǎng)基上。將接種好的培養(yǎng)皿置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，用接種環(huán)挑取NBRIP和Menkina培養(yǎng)基上出現(xiàn)溶磷圈的菌株，用四區(qū)劃線法反復(fù)純化至菌落均一，經(jīng)結(jié)晶紫或美蘭簡單染色后顯微鏡（1 000×，油鏡）下觀察，細(xì)胞形態(tài)均一為純化合格的菌株，將菌株轉(zhuǎn)接LB斜面培養(yǎng)基置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 溶解無機磷能力的測定 參考張英［27］的方法，在150 mL三角瓶中裝入50 mL NBRIP液體培養(yǎng)基，每個待測菌株3個重復(fù)；121 ℃滅菌25 min，冷卻后，生物安全柜內(nèi)吸取各待測菌株的菌懸液（108 cfu·mL-1）500 μL 接種至三角瓶中。對照為不接種菌株的NBRIP培養(yǎng)基。將上述三角瓶固定于搖床，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)10 d后，用酸度計測定培養(yǎng)液pH。取8 mL上述培養(yǎng)液在10 000 r·min-1離心20 min后，吸取5 mL上清液轉(zhuǎn)150 mL三角瓶中，加入0.5 mol·L-1碳酸氫鈉浸提劑45 mL，再加入適量無磷活性炭粉，振蕩機上振蕩30 min，無磷濾紙過濾，吸取濾液5 mL于50 mL容量瓶中，加入鉬銻抗試劑5 mL，用蒸餾水定容，然后搖勻，放置30 min 后，用分光光度計700 nm 波長進(jìn)行比色。讀出待測液的吸光值，計算顯色液的磷含量（μg·mL-1）?？鄢龑φ蘸蟮闹禐橛行Я自隽浚é蘥·mL－1）。

培養(yǎng)液磷含量＝ρ × V × Ts／V0?（1）

式中，ρ 為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得P 的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；V為顯色時定容體積（mL）；Ts為分取倍數(shù)；V0為測定發(fā)酵液的體積（mL）。

1.3.6 有機磷溶解菌的半定量測定 參考Shenoy等［28］的方法，將保存于LB斜面培養(yǎng)基上的溶解有機磷菌株活化后點接種于蒙金娜有機磷平板上，恒溫培養(yǎng)7 d（28 ℃）后測量各菌株形成的溶磷圈。根據(jù)測量的溶磷圈直徑（D，mm）和菌落直徑（d，mm）計算溶磷指數(shù)，計算公式如下。

溶磷指數(shù)＝D + d／d×100%?（2）

1.3.7 分泌IAA菌株初篩 于生物安全柜內(nèi)用接種環(huán)將上述分離純化后的固氮菌與溶磷菌全部接入制備好的培養(yǎng)基中，同時做空白對照處理，接種后在28 ℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)12 d。培養(yǎng)結(jié)束后，10 000 r·min-1離心菌液，吸取50 μL上清液，將50 μL 上清液與50 μL Spot 比色液混合滴于白瓷板凹陷處，同時做陰性（50 μL 未接菌的KingB培養(yǎng)基上清與Spot比色液混合）和陽性對照（50 μL·mL-1吲哚-3-乙酸10 μL與Spot比色液混合），黑暗處靜置30 min，觀察混合液的顯色反應(yīng)，粉紅色為陽性，根據(jù)顯色反應(yīng)的結(jié)果初步判定菌株產(chǎn)IAA 能力大小，記錄分泌IAA 菌株編號。

1.3.8 IAA的定量測定 參考Glickmann等［29］的方法，制備50 mL KingB 液體培養(yǎng)基于150 mL三角瓶中，121 ℃，0.1 MPa 條件下滅菌25 min。

生物安全柜內(nèi)，每個三角瓶中分別接入500 μL待測菌株配制成的菌懸液（108 cfu·mL-1），同時用未接菌的King'B 液體培養(yǎng)基做空白對照處理，每個待測菌株3 個重復(fù)；接種后在28 ℃、180 r·min-1 搖床振蕩培養(yǎng)12 d。培養(yǎng)結(jié)束后，10 000 r·min-1 離心菌液，取上清液5 mL 加5 mLS2 比色液，在黑暗下靜置30 min 后，迅速用分光光度計在波長530 nm 下測定各待測液的吸光值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算待測液的IAA 含量（μg·mL-1）。扣除對照后的值記為該菌株分泌到培養(yǎng)液中IAA的含量。

1.4 PGPR 菌株鑒定

1.4.1 PGPR 表型特征 將菌株從斜面接出后，四區(qū)劃線接到LB 平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落大小、色澤、邊緣和質(zhì)地等。選擇生長在指數(shù)期的細(xì)菌，結(jié)晶紫簡單染色，顯微鏡（BX60；Olympus）放大倍數(shù)1 000 倍下觀察細(xì)胞形態(tài)，測定細(xì)胞大小。并進(jìn)行部分生理和生化特性的檢測［30］。

1.4.2 16S rDNA分析 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提細(xì)菌總DNA，采用16S rDNA 通用引物27F/1492r（生工生物工程股份有限公司合成）進(jìn)行PCR。 擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，合格后送北京奧科生物有限公司測序。將測得合格的序列用ChromasPro V2.1.8 軟件進(jìn)行拼接，在EZBiocloud網(wǎng)站（www.ezbiocloud.net） 用16S-based ID進(jìn)行比對分析，選擇序列相近模式菌株的16S rDNA序列下載，用MEGA 7.0.17軟件采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Pairwise Deletion，Kimura 2計算核苷酸差異值， 自展數(shù)為10 000。所有待鑒定菌株序列拼接后提交NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫并獲得檢索號。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，采用SPSS 24.0對菌株促生特性進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸、羌活根際PGPR 菌株的分離純化

通過選擇性培養(yǎng)基分離篩選出具有固氮、溶磷特性的菌株共28株。其中，聯(lián)合固氮菌12株；溶解無機磷的菌株6株；溶解有機磷的菌株10株。從溶磷菌株和固氮菌株中分離出3株可分泌IAA的菌株，分別是MDM-6、MDP-4和WQP-5（表1）。

2.2 固氮酶活性

以乙烯濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)乙烯峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，制作的乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=13 441x-2 124；R2=0.999 1。采用ARA 法測定21株初篩為固氮菌的固氮酶活性，結(jié)果（圖1）表明，12株菌株檢測到固氮酶活性，其固氮酶活性為0.30～4.04 nmol （C2H4）·h-1·mL-1。其中，分離自羌活根際的菌株WQN-10 固氮酶活性最高；分離自當(dāng)歸根際的菌株MDN-5 固氮酶活性最低。

2.3 無機磷溶解菌溶磷能力

以磷濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)比色濁度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得磷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.529 3x+0.000 25；R2=0.999 9。采用鉬銻抗比色法定量測定19 株無機磷溶解菌株的溶磷能力，結(jié)果（圖2）表明，19 株的溶磷量為317.19～420.33 μg·mL-1，有6 株菌都具有較高的溶磷量。其中，菌株WQP-6 溶磷量最高，達(dá)420.33μg·mL-1；其次為菌株WQP-5，溶磷量也大于400 μg·mL-1；菌株WQP-1 溶磷量最低，為317.19 μg·mL-1。

2.4 菌株溶解有機磷能力

根據(jù)溶磷指數(shù)篩選到10 株溶磷指數(shù)大于200%的菌株（表2），其溶磷指數(shù)為214%～434%。其中，菌株WQM-13溶磷指數(shù)最高，為434%，溶磷能力顯著高于其它菌株；菌株WQM-1溶磷指數(shù)最低，為214%，各菌株之間溶磷能力差異顯著。

2.5 溶磷菌分泌IAA

以IAA含量為橫坐標(biāo)，比色濁度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，制作的IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.013 2x+0.001 5；R2=0.999 5。利用Spot比色法和高效液相色譜法測定其分泌IAA的能力，結(jié)果表明，有5株菌株出現(xiàn)顯色反應(yīng)，有3株菌株具有分泌IAA能力（圖3）。分離自當(dāng)歸的MDM-6菌株分泌的IAA量最高，為18.63 μg·mL-1，顯著高于其他株菌。

2.6 菌株鑒定結(jié)果

對篩選出促生效果較好的12株優(yōu)良菌株進(jìn)行鑒定，綜合表型特征（表3）、16S rDNA相似性（表4）和系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4），結(jié)果（表5）表明，菌株MDP-4為醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）；MDP-8 為Pseudomonas thivervalensis；MDM-4 為猴假單胞菌（Pseudomonas simiae）；MDM-6和WQP-6為地中海假單胞菌（Pseudomonas mediterranea）；WQP-1 為Pseudomonas laurylsul-fatiphila；WQP-5為格式假單胞菌（Pseudomonas grimontii）；WQP-7為Pseudomonas frederiks-bergensis；WQM-11 和WQM-13 為沙漠錯玫桿菌（Falsirhodobacterdeserti）。

3 討論

本研究從當(dāng)歸根際分離到27株菌，從羌活根際分離到47株菌。其中，有固氮酶活性的菌株12株，固氮酶活性為0.30～4.04 nmol C2H4·h-1·mL-1；具有溶解無機磷能力的菌株6 株，溶磷量為317.19～420.33 μg·mL-1；溶解有機磷的優(yōu)良菌株10株，有4菌溶磷指數(shù)高達(dá)400%；從溶磷菌和固氮菌中分離出3株菌具有分泌IAA的性能，其中2株綜合性能優(yōu)良。從當(dāng)歸根系分離的MDP-8溶磷量超過400 μg·mL-1，具有良好的溶磷潛力；從羌活根系分離的WQP-5同時具有溶磷和分泌IAA的能力，且溶磷量也超過400 μg·mL-1。由此表明，MDP-8和WQP-5具有良好的開發(fā)潛力，有望發(fā)展為微生物肥料用于當(dāng)歸與羌活專用菌肥。

從來自于岷縣和渭源的當(dāng)歸、羌活根系篩選到固氮菌的固氮酶活性均不高，可能與采樣地的環(huán)境條件有關(guān)。研究表明，植物生長狀況和外界環(huán)境條件均會影響固氮菌的固氮酶活性［31］。而分離到菌株的溶磷特性較好，可能是由于該地域土壤中可利用的磷素含量較低，對于溶磷菌的需求較大。因此，相較于固氮菌，當(dāng)歸和羌活根系溶磷菌的挖掘及溶磷特性值得進(jìn)一步重點關(guān)注。當(dāng)歸根際分離的3株溶解無機磷特性優(yōu)良的菌株經(jīng)鑒定分別為醋酸鈣不動桿菌（A. calcoaceticus）、P.thivervalensis 和未定種假單胞菌（Pseudomonassp.）；2株溶解有機磷特性優(yōu)良的菌株經(jīng)鑒定為猴假單胞菌（P. simiae）和地中海假單胞菌（P.mediterranea）。羌活根際分離的4株溶解無機磷特性優(yōu)良的菌株經(jīng)鑒定分別屬于格式假單胞菌（P. grimontii） 、P. laurylsulfatiphila、P.frederiksbergensis 和地中海假單胞菌（P.mediterranea）；3株溶解有機磷特性優(yōu)良的菌株經(jīng)鑒定后1 株屬于未定種假單胞菌（Pseudomonassp.），2 株屬于沙漠錯玫桿菌（Falsirhodobacterdeserti）。目前，沙漠錯玫桿菌（F. deserti）的溶磷特性還未見報道，這為生物菌肥的研發(fā)提供了新的微生物資源。本研究篩選的溶磷特性優(yōu)良的菌株中，假單胞菌屬占比較大，是主要的溶磷優(yōu)勢菌屬，與早先報道的假單胞菌屬細(xì)菌廣泛存在于植物根際土壤，且該屬中多個菌種被發(fā)現(xiàn)有較強的溶磷能力［32］相印證。Elliott等［33］研究表明，小麥根際溶磷菌主要為芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈霉菌屬（Streptomyces），與本研究結(jié)果一致。假單胞菌屬（Pseudomonas）是常見的PGPR菌屬，作為重要的微生物資源，具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力和優(yōu)良的促生特性。目前，國內(nèi)對于假單胞菌的研究主要集中在促生和生物防治兩個方面，寧爽［34］從植物內(nèi)生菌中篩選出兩株假單胞菌，既可以分泌植物生長激素促進(jìn)植物生長，還可以分泌溶菌酶抑制病原菌的生長。李海碧［35］從甘蔗根際土壤分離到30株假單胞菌均具有多種促生特性，除具有良好的溶磷作用外，還具有分泌嗜鐵素的能力，說明假單胞菌的促生作用可能不是通過單一的溶磷作用實現(xiàn)，而是不同促生機制相互協(xié)同的結(jié)果。研究表明，礦質(zhì)元素含量的增加可能與菌株的溶磷能力相關(guān)［36］。假單胞菌可分泌甲酸、乙酸和丙酸等物質(zhì)，降低土壤pH，絡(luò)合土壤中的鐵、鋁、鈣等離子，溶解難溶性磷酸鹽，將其轉(zhuǎn)化為植物可以利用的可溶性磷［37］。本研究僅對篩選到的假單胞菌的溶磷特性進(jìn)行了初步研究，后續(xù)可以進(jìn)一步對菌株的促生機理進(jìn)行深入研究，通過基因工程等手段對菌株進(jìn)行改造，從而提高溶磷效果和促生效果［38］。

篩選出高效的PGPR株對于調(diào)節(jié)土壤中營養(yǎng)元素的供需矛盾、促進(jìn)植物生長和改善土壤條件具有重要意義［39］，研究表明，微生物肥料具有增產(chǎn)效果的同時還能改善土壤結(jié)構(gòu)和質(zhì)量［40］，藥用植物根際促生菌對藥用植物的生長發(fā)育及其代謝活動有著重要影響，不僅可以促進(jìn)藥用植物對土壤養(yǎng)分的吸收，而且還可以提高藥用植物的產(chǎn)量及品質(zhì)［41］。此外，植物根際促生菌還能夠增強植物對外界環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力，有利于藥用植物有效成分的積累。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）