胡雨佳，王偉，倪靜媛，張盛周

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000）

隨著我國工業(yè)化和城市化的不斷發(fā)展，大量含有重金屬離子的工業(yè)廢水被排放到水體環(huán)境中，導(dǎo)致水域重金屬污染日益嚴(yán)重。鋅和鎳為水體重金屬污染的主要元素，可在魚體內(nèi)富集，并與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)結(jié)合或者與DNA 等相互作用，引起不可逆轉(zhuǎn)的變性或遺傳突變，阻礙生理或代謝過程的正常進(jìn)行，進(jìn)而影響魚類的生長發(fā)育和繁殖等，甚至出現(xiàn)胚胎、幼體致死現(xiàn)象[1-5]。

鯽（Carassius auratus），隸屬鯉科，鯽屬，是一種溫水性魚類，在我國分布廣泛。鯽肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，可進(jìn)行人工養(yǎng)殖，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。研究表明，重金屬離子在鯽體內(nèi)富集后，與酶和核酸等生物大分子相互作用，引起鯽中毒或死亡[7]。目前有關(guān)重金屬離子對(duì)鯽腸道黏膜上酶活性的影響研究未見報(bào)道?，F(xiàn)以鯽為研究對(duì)象，探討不同濃度的鋅和鎳離子對(duì)其腸道黏膜中過氧化物酶（POX）、非特異性酯酶（NSE）、堿性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）和三磷酸腺苷酶（ATPase）5 種酶活性的影響，以期為魚類的清潔養(yǎng)殖和污染防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮活鯽5 條，體長為20～25 cm，體質(zhì)量為350～500 g，購于蕪湖市黃山西路菜市場。購回后清水靜養(yǎng)2～3 h，待其將腸道殘留物排出。

1.2 制備組織切片

解剖并取鯽中腸，切成5 mm 的腸段，用0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗干凈，于OCT 包埋劑包埋，冰凍切片，制成厚度8 μm 的組織切片，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 金屬離子處理

分別設(shè)置2×10-5，2×10-4，2×10-3，2×10-2和2×10-1mol/L 5 個(gè)不同濃度的硫酸鋅和氯化鎳試驗(yàn)組，并對(duì)應(yīng)設(shè)置2 個(gè)空白對(duì)照組。每個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組均放入5 塊鯽腸組織切片，30 min 后吸除離子溶液，進(jìn)行酶組織化學(xué)染色。

1.4 酶組織化學(xué)染色

采用酶組織化學(xué)染色法，對(duì)金屬作用過的鯽組織切片進(jìn)行染色，POX 采用DAB 法、NSE 采用偶氮法、ALP 采用NBT/BCIP 法、ACP 采用鉛法、ATPase采用鈣-鈷法，染色方法參考文獻(xiàn)[8-9]，染色時(shí)間根據(jù)顏色反應(yīng)強(qiáng)度適當(dāng)調(diào)整。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用BX61 型顯微鏡觀察并拍照記錄各酶組織化學(xué)染色結(jié)果。利用Image-Pro Plus 分析軟件，對(duì)酶組織化學(xué)染色的陽性部位進(jìn)行光密度分析，測出其面積（Area）與累積光密度值（IOD），計(jì)算出IOD 與Area 的比值，即用平均光密度值來表示酶活性大小。最后利用SPSS 軟件中的單因素分析法，將不同離子濃度梯度下的酶活性與對(duì)照組進(jìn)行比較，得出不同濃度梯度的金屬離子對(duì)酶活性影響的差異顯著性。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽腸道黏膜5 種重要酶的組織化學(xué)染色特征

鯽腸道黏膜中5 種重要酶均呈現(xiàn)明顯的酶組織化學(xué)染色反應(yīng)。POX 酶組織化學(xué)反應(yīng)呈棕紅色，顆粒狀，主要分布于腸道黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣和固有層，見圖1（a）；NSE 酶組織化學(xué)反應(yīng)呈磚紅色，主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的頂部和基部，在固有層中呈顆粒狀分布，見圖1（b）；ALP 酶組織化學(xué)反應(yīng)呈藍(lán)紫色，主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的頂部，固有層中亦有少量分布，見圖1（c）；ACP 酶組織化學(xué)反應(yīng)呈棕黃色，主要分布于固有層，部分黏膜上皮細(xì)胞的基部亦有少量分布，見圖1（d）；ATPase 酶組織化學(xué)反應(yīng)呈棕黑色，主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣，固有層亦有少量分布，見圖1（e）。

圖1 鯽腸道黏膜5 種重要酶的組織化學(xué)染色

2.2 鋅離子對(duì)鯽腸道黏膜5 種重要酶活性的影響

經(jīng)光密度分析，不同濃度的鋅離子（Zn2+）作用下鯽腸道黏膜5 種重要酶活性見表1。由表1 可見，隨c（Zn2+）的增高，POX 活性呈減弱趨勢。當(dāng)c（Zn2+）≤2×10-4mol/L 時(shí)，對(duì)POX 活性無顯著影響（P＞0.05），當(dāng)c（Zn2+）≥2×10-3mol/L，POX 活性被極顯著抑制（P＜0.01）；在c（Zn2+）為2×10-5mol/L時(shí)，NSE 活性極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），當(dāng)c（Zn2+）≥2×10-4mol/L 時(shí)，NSE 活性被極顯著抑制（P＜0.01）；當(dāng)c（Zn2+）為2×10-5mol/L 時(shí)，對(duì)ALP 活性無顯著影響（P＞0.05），當(dāng)c（Zn2+）≥2×10-4mol/L 時(shí)，ALP 活性呈減弱趨勢，其中c（Zn2+）為2×10-4mol/L 時(shí)差異顯著（P＜0.05），c（Zn2+）≥2×10-3mol/L 時(shí)差異極顯著（P＜0.01）；當(dāng)c（Zn2+）≥2×10-5mol/L 時(shí)，ACP 活性被極顯著抑制（P＜0.01），且隨c（Zn2+）升高ACP活性減弱；當(dāng)c（Zn2+）為2×10-5mol/L 時(shí)，ATPase 活性極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），當(dāng)c（Zn2+）≥2×10-4mol/L時(shí)，ATPase 活性被極顯著抑制（P＜0.01）。

表1 不同濃度Zn2+作用下鯽腸道黏膜5 種重要酶活性①

續(xù)表

2.3 鎳離子對(duì)鯽腸道黏膜5 種重要酶活性的影響

經(jīng)光密度分析，不同濃度鎳離子（Ni2+）作用下鯽腸道黏膜5 種重要酶活性見表2。由表2 可知，POX 活性隨c（Ni2+）的升高呈先增強(qiáng)后降低的趨勢。當(dāng)c（Ni2+）為2×10-5mol/L 時(shí)，POX 活性極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），當(dāng)c（Ni2+）≥2×10-2mol/L 時(shí)，POX 活性被極顯著抑制（P＜0.01）；當(dāng)c（Ni2+）為2×10-5mol/L 時(shí)，NSE 活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），當(dāng)c（Ni2+）≥2×10-2mol/L時(shí)，NSE 活性被極顯著抑制（P＜0.01）；當(dāng)c（Ni2+）為2×10-5mol/L 時(shí)，對(duì)ALP 和ACP 活性無顯著影響（P＞0.05），當(dāng)c（Ni2+）≥2×10-4mol/L，ALP 和ACP 活性均逐漸降低，且與對(duì)照組差異均極顯著（P＜0.01）；c（Ni2+）為2×10-5mol/L 時(shí)，ATPase 活性極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），當(dāng)c（Ni2+）≥2×10-3mol/L 時(shí)，ATPase 活性被極顯著抑制（P＜0.01）。

表2 不同濃度Ni2+作用下5 種重要酶活性①

3 討論

魚類的胃和腸道是消化和吸收的主要器官，參與離子、水和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和吸收[10-11]。其中腸道酶活性對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收至關(guān)重要，已有研究證明，溫度、pH 值及飼料添加劑等[12-14]均對(duì)魚類酶活性有影響。因此，通過探討Zn2+和Ni2+對(duì)腸道酶活性的影響，有助于增進(jìn)對(duì)魚類的毒理認(rèn)識(shí)。

3.1 過氧化物酶（POX）

過氧化物酶是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，是一類氧化還原酶，可催化過氧化氫分解，氧化酚類、胺類和烴類化合物，消除其對(duì)機(jī)體的毒性作用[15-16]。劉樹青等[17]研究表明，POX 具有減少自由基對(duì)正常細(xì)胞的損傷作用，可以清除細(xì)胞生理代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，從而提高機(jī)體的解毒功能和防病抗病能力。陳劍興等[18]的研究表明，鎘對(duì)POX 活性具有毒物興奮效應(yīng)，即低濃度激活高濃度抑制的現(xiàn)象，這與本研究結(jié)果相一致。本研究顯示，低濃度Zn2+對(duì)POX 活性無顯著影響（P＞0.05），但低濃度Ni2+對(duì)POX 活性有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05）；而高濃度的Zn2+和Ni2+則對(duì)POX 活性均具顯著抑制作用（P＜0.05）。可見，高濃度的Zn2+和Ni2+會(huì)通過抑制POX的活性，降低機(jī)體解毒功能和防病抗病能力。

3.2 非特異性酯酶（NSE）

非特異性酯酶屬于水解酶類，參與大部分脊椎動(dòng)物包括魚類，對(duì)脂肪酸和甘油酯類物質(zhì)的消化和吸收[19]，對(duì)魚類獲取能源物質(zhì)有重要作用[20]。NSE 在低濃度Zn2+或Ni2+處理下活性增強(qiáng)，但隨著離子濃度的增加，酶活性減弱，表明低濃度的Zn2+和Ni2+對(duì)NSE 活性有促進(jìn)作用，高濃度的Zn2+和Ni2+會(huì)抑制NSE 活性，這與鉛對(duì)櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）NSE 活性的影響結(jié)果一致[21]。可見，在低濃度Zn2+或Ni2+作用下會(huì)增強(qiáng)NSE 活性，促進(jìn)機(jī)體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)來獲取能源，抵抗重金屬離子的脅迫作用。但高濃度Zn2+和Ni2+會(huì)抑制NSE 活性，從而阻礙機(jī)體對(duì)能源物質(zhì)的獲取，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用。

3.3 堿性磷酸酶（ALP）

堿性磷酸酶是在腸上皮細(xì)胞中，對(duì)磷化物以及其他物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要作用的酶類，其活力大小可以反映細(xì)胞對(duì)鈣、磷以及其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[22]。本研究結(jié)果表明，Zn2+和Ni2+對(duì)鯽腸道黏膜上的ALP 活性有抑制作用，且抑制效果隨濃度的升高而增強(qiáng)，與鎘對(duì)鯽腸ALP 的抑制作用相一致[23]。王秋穎等[22]研究表明，鈣、磷供應(yīng)不足，對(duì)動(dòng)物的影響主要表現(xiàn)為骨結(jié)構(gòu)異常、軟骨病、食欲降低、生長遲緩、生產(chǎn)性能下降等。因此，當(dāng)Zn2+和Ni2+超標(biāo)時(shí)會(huì)抑制ALP 活性，從而阻礙鯽的磷循環(huán)和物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，影響鯽的生長發(fā)育。

3.4 酸性磷酸酶（ACP）

酸性磷酸酶是溶酶體中的標(biāo)志酶，與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的消化吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，胞飲作用也被認(rèn)為是硬骨魚類吸收和消化蛋白質(zhì)的一種途徑[24-25]。本研究結(jié)果表明，ACP 活性隨Zn2+和Ni2+濃度的升高而降低，與鎘對(duì)鯽腸ACP 活性和鉛對(duì)鯽肝胰ACP活性的影響結(jié)果一致[23，26]?？梢姡?dāng)Zn2+和Ni2+濃度升高會(huì)抑制ACP 活性，阻礙腸道細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的吸收與利用。

3.5 三磷酸腺苷酶（ATPase）

三磷酸腺苷酶是一類催化ATP 水解的酶并伴隨能量的釋放，一般存在于組織細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜上，維持細(xì)胞膜內(nèi)外的離子梯度差，保證各種代謝活動(dòng)能量的供給[27]。在鯽腸道中，ATPase 主要是對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收提供能量。本研究結(jié)果表明，在低濃度Zn2+或Ni2+作用下，ATPase 活性增強(qiáng)，但在高濃度下酶活性被抑制，與銅和鎘對(duì)鯽肝胰臟ATPase 活性的影響及NiSO4（硫酸鎳）對(duì)大鼠（Rattus norregicus）心肝腎ATPase 的影響結(jié)果相一致[28-29]。劉存岐等[30]在金屬離子對(duì)中國對(duì)蝦（Penaeus chinensis）幼體內(nèi)ATPase 活性的影響研究中發(fā)現(xiàn)，ATPase 活性的高低和對(duì)蝦的生長速度快慢呈現(xiàn)出極大的一致性，表明ATPase 活性會(huì)直接影響生物機(jī)體的生存能力。因此當(dāng)水環(huán)境中的Zn2+和Ni2+含量過高時(shí)會(huì)抑制ATPase 的活性，同樣會(huì)對(duì)鯽健康狀態(tài)和生存產(chǎn)生負(fù)面影響。

Zn2+和Ni2+對(duì)5 種酶活性的影響均具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。水體中Zn2+和Ni2+含量超標(biāo)，會(huì)抑制鯽腸道黏膜中重要酶的活性，阻礙機(jī)體抗病和消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力，從而影響其生長和發(fā)育。本研究結(jié)果也表明，鯽腸道黏膜中重要酶活性的高低，可以作為反映水體Zn2+與Ni2+污染的指示指標(biāo)。