蘭偉途 王萬(wàn)宏 武峰 蘭文達(dá) 何建昌

【摘要】 目的 探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）XIST通過(guò)miR-543對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖凋亡的作用及機(jī)制。方法 RT-PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783中XIST表達(dá)水平及si-XIST轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后XIST與miR-543表達(dá)；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中敲低XIST后，MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡情況；用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證LncRNA XIST與miR-543的靶向關(guān)系。結(jié)果 XIST在U251細(xì)胞中表達(dá)水平（0.79±0.08）最高，故以U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；與XIST組［（2.35±0.17）、（0.37±0.05）］相比，si-XIST組U251細(xì)胞XIST表達(dá)水平（0.25±0.19）較低，miR-543表達(dá)水平（3.15±0.36）較高（P＜0.05）；與XIST組［（0.57±0.09）、（0.81±0.01）、（1.15±0.04）］相比，si-XIST組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h［（0.22±0.02）、（0.31±0.03）、（0.55±0.04）］明顯降低（P＜0.05）。與XIST組（1.12±0.56）%相比，si-XIST組細(xì)胞凋亡率（35.64±4.31）%較高（P＜0.05）。共轉(zhuǎn)染XIST-wt和miR-543處理組中相對(duì)熒光素酶活性顯著下降［（1.15±0.22）vs（0.22±0.03）］（P＜0.05）。結(jié)論 干擾LncRNA XIST可通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-543表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 LncRNA XIST；miR-543；膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖；凋亡

【中圖分類號(hào)】 R734.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】 1672-7770（2023）02-0158-05

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of long non coding RNA（LncRNA） XIST on proliferation and apoptosis of glioma cells through miR-543. Methods RT-PCR was used to detect the expression of XIST in U251， T98G， U87-MG， A172 and SW1783 glioma cell lines and the expression of XIST and miR-543 in U251 cells transfected with si-XIST. After knocking down XIST in U251 glioma cells， MTT assay and flow cytometry were used to detect the effects on proliferation and apoptosis of glioma cells. Double luciferase reporter gene was used to verify the targeting relationship between LncRNA XIST and miR-543. Results The expression level of XIST in U251 cells was（0.79±0.08）， so U251 cells were used for follow-up experiments. Compared with XIST group［（2.35±0.17），（0.37±0.05）］， the expression level of XIST in U251 cells in si-XIST group（0.25±0.19） was lower， miR-543（3.15±0.36） is highly expressed（P＜0.05）. Compared with XIST group［（0.57±0.09）， （0.81±0.01）， （1.15±0.04）］， A570 of glioma U251 cells in si-XIST group decreased significantly at 24， 48 and 72 h［（0.22±0.02）， （0.31±0.03）， （0.55±0.04）］（P＜0.05）. Compared with XIST group（1.12±0.56）%， the apoptosis rate of si-XIST group was（35.64±4.31）% （P＜0.05）. The relative luciferase activity was significantly decreased in the co-transfected XIST-wt and mir-543 groups［（1.15±0.22）vs（0.22±0.03）］（P＜0.05）， these results suggested that there was a targeted relationship between XIST and miR-543 and XIST negatively regulates the expression of miR-543. Conclusion Silencing LncRNA XIST can negatively regulate the expression of miR-543 inhibit the proliferation and induce apoptosis of glioma cells， which may be a molecular target of glioma.

Key words： LncRNA XIST; miR-543; glioma cell; proliferation; apoptosis

基金項(xiàng)目：河北省2020年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計(jì)劃（20200172）

作者單位：061000 滄州，河北省滄州市人民醫(yī)院醫(yī)專院區(qū)神經(jīng)外科（蘭偉途，武峰，蘭文達(dá)，何建昌）；唐山市豐南區(qū)醫(yī)院神經(jīng)外科（王萬(wàn)宏）

膠質(zhì)瘤為中樞系統(tǒng)最常見(jiàn)惡性腫瘤，因其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)方式造成致殘率、死亡率較高，患者經(jīng)常規(guī)治療后中位生存時(shí)間僅15個(gè)月［1］。故研究抑制膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制，探索潛在的精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)已成為相關(guān)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）可能與microRNA（miRNA）互相作用，影響膠質(zhì)瘤進(jìn)展［2］。LncRNA XIST為染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物（X-inactivation-specific transcript X，XIST）基因產(chǎn)物，被證實(shí)是有生物學(xué)功能的LncRNA［3］。研究表明，LncRNA XIST在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲，且與患者生存時(shí)間及預(yù)后相關(guān)，可作為膠質(zhì)瘤生物標(biāo)記物［4］。miRNA與腫瘤之間的關(guān)系已成為腫瘤學(xué)研究熱點(diǎn)之一，miR-543是一種促癌基因，Zhang等［5］報(bào)道，miR-543在膠質(zhì)瘤發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，關(guān)于LncRNA XIST、miR-543在膠質(zhì)瘤中的相互作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)敲低XIST表達(dá)，探討XIST對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。XIST干擾劑（si-XIST）及其陰性對(duì)照（si-XIST-NC）、miR-543模擬物及其陰性對(duì)照（miR-543-NC）（海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ThermoFisher公司），實(shí)驗(yàn)所用引物由上?？迫A生物工程股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清和0.1%的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2、37 ℃，隔天換液1次，細(xì)胞融合率達(dá)到85%以上時(shí)傳代，傳代濃度1×104個(gè)/mL。

1.3 RT-PCR檢測(cè)不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中XIST表達(dá)水平 用Trizol試劑提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783及用si-XIST轉(zhuǎn)染后的U251細(xì)胞總RNA，定量分析后，每組取等量RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，用PCR儀擴(kuò)增，用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行定量分析。反應(yīng)程序：95 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。用2-△△Ct法定量分析各細(xì)胞系中XIST相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分組為對(duì)照組、XIST組、XIST-NC組、si-XIST組、si-XIST-NC組，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，參考轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)用XIST、XIST-NC、si-XIST、si-XIST-NC分別轉(zhuǎn)染XIST組、XIST-NC組、si-XIST組、si-XIST-NC組細(xì)胞，對(duì)照組加入等量載體處理。轉(zhuǎn)染6 h后更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，待后續(xù)檢測(cè)使用。

1.5 MTT法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性 取si-XIST轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞48 h后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，2×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)置8個(gè)平行孔。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后24、48、72 h取出培養(yǎng)板，加入20 μL MTT液培養(yǎng)4 h，吸出上清液加入150 μL二甲基亞砜振蕩溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各細(xì)胞的吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率 取各組轉(zhuǎn)染后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞洗滌2次，根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用400 μL標(biāo)記緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），用流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡率。

1.7 RT-PCR檢測(cè)XIST與miR-543表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)合成XIST與miR-543，XIST以GAPDH為內(nèi)參，miR-543以U6為內(nèi)參。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、59 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)。引物見(jiàn)表1。用2-△△Ct法定量分析U251細(xì)胞中XIST、miR-543相對(duì)表達(dá)量。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證XIST與miR-543靶向關(guān)系 經(jīng)生物信息預(yù)測(cè)XIST與miR-543的結(jié)合片段，用PCR擴(kuò)增，插入熒光素酶報(bào)告酶載體，構(gòu)建XIST野生型（wild type，wt）質(zhì)粒。用基因突變技術(shù)對(duì)XIST序列上與miR-543結(jié)合位點(diǎn)上個(gè)別核苷酸進(jìn)行突變，構(gòu)建XIST突變型（mutant type，mut）質(zhì)粒。用miR-543模擬物及陰性對(duì)照與XIST-wt或XIST-mut共同轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，24 h后檢驗(yàn)熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，XIST、miR-543相對(duì)表達(dá)量等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較進(jìn)行LSD-t分析。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中XIST表達(dá)水平 如圖1所示，XIST在多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中表達(dá)水平以U251細(xì)胞最高，故選擇U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 U251細(xì)胞XIST與miR-543表達(dá)情況 與對(duì)照組及各自NC組相比，XIST組U251細(xì)胞XIST表達(dá)水平較高，miR-543表達(dá)水平較低，si-XIST組U251細(xì)胞XIST表達(dá)水平較低，miR-543表達(dá)水平較高（P＜0.05）；與XIST組相比，si-XIST組U251細(xì)胞XIST表達(dá)水平較低，miR-543表達(dá)水平較高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 敲低XIST抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性 敲低XIST表達(dá)后，各組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高。與對(duì)照組及各自NC組相比，XIST組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h較高（P＜0.05），si-XIST組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h較低（P＜0.05）；與XIST組相比，si-XIST組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h明顯降低（P＜0.05），表明敲低XIST可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖3。

2.4 敲低XIST促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡 敲低XIST表達(dá)后，與對(duì)照組及各自NC組相比，XIST組細(xì)胞凋亡率較低（P＜0.05），si-XIST組細(xì)胞凋亡率較高（P＜0.05），與XIST組相比，si-XIST組細(xì)胞凋亡率較高（P＜0.05），表明敲低XIST可誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡。見(jiàn)表2、圖4。

2.5 XIST與miR-543的靶向關(guān)系 生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，XIST序列中含有與miR-543互補(bǔ)的序列（圖3A所示）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示（圖3B所示），共轉(zhuǎn)染XIST-wt和miR-543處理組中相對(duì)熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），表明XIST與miR-543有結(jié)合關(guān)系；轉(zhuǎn)染XIST-MUT和miR-543的處理組中相對(duì)熒光素酶活性未受影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討 論

腫瘤發(fā)生發(fā)展是多通路活化或抑制、多因子參與、多步驟的生物學(xué)過(guò)程，基因異常表達(dá)與失調(diào)在腫瘤微環(huán)境創(chuàng)建及其發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。據(jù)了解，人類基因組基本上都可轉(zhuǎn)錄LncRNA，與編碼基因相比，LncRNA的轉(zhuǎn)錄方式不同［6］。據(jù)報(bào)道，LncRNA有干擾轉(zhuǎn)錄、誘導(dǎo)染色體重塑、改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)等功能，可通過(guò)與miRNA、蛋白質(zhì)分子或其組合相互作用，發(fā)揮著抑癌或促癌作用［7］。最近，LncRNAs和miRNAs之間的相互作用引起了很多關(guān)注。多項(xiàng)研究報(bào)道，LncRNA異常表達(dá)不但會(huì)影響真核細(xì)胞基因表達(dá)，還可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖使其獲得無(wú)限增殖能力，提升癌癥發(fā)生率，并誘導(dǎo)癌癥轉(zhuǎn)移與惡化［8-9］。Luo等［10］發(fā)現(xiàn)LncRNA CASC11可通過(guò)miRNA-150促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖。Liu等［2］報(bào)道，LncRNA參與了膠質(zhì)瘤血管生成過(guò)程。因此研究LncRNA在膠質(zhì)瘤中分子作用機(jī)制十分必要，可為膠質(zhì)瘤臨床治療提供新思路。

XIST最早在1991年被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究表明其在多種癌癥病理進(jìn)程中呈異常表達(dá)。Salama等［11］報(bào)道，XIST在乳腺癌中表達(dá)明顯上調(diào)。Liu等［12］發(fā)現(xiàn)，XIST下調(diào)可抑制非小細(xì)胞肺癌發(fā)展。XIST參與了X染色體滅活啟動(dòng)階段，同時(shí)參與了細(xì)胞全部過(guò)程，影響癌癥增殖與凋亡［13］；可見(jiàn)，XIST在膠質(zhì)瘤中也發(fā)揮了相同作用。為此，本研究首先檢驗(yàn)了XIST在幾種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)U251細(xì)胞中XIST表達(dá)水平最高，故選擇U251細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞無(wú)限增殖為癌癥基本特征之一，抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是臨床治療癌癥的主要途徑。經(jīng)MTT與流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低XIST表達(dá)后，膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h均明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，提示敲低XIST可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活性，并誘導(dǎo)其凋亡。Luo等［14］發(fā)現(xiàn)XIST在膠質(zhì)瘤中也發(fā)揮癌基因功能，對(duì)膠質(zhì)瘤增殖、遷移等生物學(xué)行為均有影響，本研究與其結(jié)果存在一致性。這些結(jié)果證明了XIST在膠質(zhì)瘤中所扮演的癌基因角色以及對(duì)膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的影響情況，而這一項(xiàng)研究結(jié)果為加深本研究對(duì)XIST在膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中潛在機(jī)制的理解提供了新的思路。

miR-543在人類14號(hào)染色體DLK1-DIO3區(qū)域，含有較大的非編碼RNA群，可通過(guò)調(diào)控各種靶基因影響癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。Fan等［15］發(fā)現(xiàn)，miR-543可通過(guò)靶向KRAS、MTA1和HMGA2抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因此認(rèn)為miR-543是一種候選腫瘤抑制分子。但近幾年報(bào)道發(fā)現(xiàn)，miR-543也可發(fā)揮促癌基因的作用；Chen等［16］報(bào)道m(xù)iR-543對(duì)腎細(xì)胞癌的增殖與轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用；Wang等［17］表明miR-543可在口腔鱗狀細(xì)胞癌中充當(dāng)新型致癌基因。由此可知，miR-543在不同腫瘤類型中發(fā)揮的作用不同，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮何種作用尚不明確。本研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲低XIST后，U251細(xì)胞中XIST表達(dá)下調(diào)、miR-543表達(dá)上調(diào)，結(jié)合敲低XIST對(duì)U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響研究結(jié)果可知，miR-543在膠質(zhì)瘤中扮演促癌基因的角色。由此可見(jiàn)，miR-543表達(dá)上調(diào)對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用，應(yīng)高度重視膠質(zhì)瘤診斷中miR-543的檢測(cè)，且在膠質(zhì)瘤治療期間可通過(guò)干擾miR-543表達(dá)從而達(dá)到治療目的，但上述想法在臨床上是否可行，有待進(jìn)一步研究證明。根據(jù)XIST與miR-543可能存在的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建包含miR-543在內(nèi)的XIST-wt、XIST-mut基因報(bào)告載體，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，XIST與miR-543存在靶向關(guān)系，由此可見(jiàn)，XIST可能是膠質(zhì)瘤的分子靶點(diǎn)。

綜上所述，XIST在膠質(zhì)瘤發(fā)展中發(fā)揮了致癌作用，敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞株中XIST表達(dá)，可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，XIST可通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-543影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，可能是膠質(zhì)瘤分子靶點(diǎn)，靶向XIST/miR-543可能是治療膠質(zhì)瘤的新興方法，這對(duì)臨床治療膠質(zhì)瘤而言是有意義的發(fā)現(xiàn)。但本研究亦存在一些缺陷，比如僅從敲低XIST了解其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，未能從過(guò)表達(dá)XIST方面驗(yàn)證本研究的結(jié)論，且單純觀察了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性、凋亡率，未能觀察敲低XIST對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響，這些未來(lái)會(huì)進(jìn)一步完善。

［參 考 文 獻(xiàn)］

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（收稿2021-12-28 修回2022-04-14）