楊紅秀 李麗華

【摘要】 目的 探討Omega-3多不飽和脂肪酸（ω-3PUFA）對缺氧缺血性腦損傷（HIBD）新生大鼠模型的腦組織炎癥、氧化應激和凋亡反應的作用。方法 將90只新生大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法等分為空白組、模型組、ω-3PUFA組。ω-3PUFA組和模型組行HIBD模型處理，造模后前者予150 mg/kg ω-3PUFA灌胃，后者予等體積等頻率生理鹽水灌胃；空白組行假手術(shù)處理，術(shù)后處理同模型組。再根據(jù)處死時間將每組分為6 h、12 h、24 h三個亞組，比較空白組、模型組、ω-3PUFA組及其亞組的腦組織白細胞介素（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、腦組織含水量、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、腦細胞凋亡率。結(jié)果 在12 h和24 h時ω-3PUFA組IL-6水平低于模型組，在不同時間點ω-3PUFA組TNF-α水平均低于模型組，高于空白組（均P<0.017）；在24 h時，ω-3PUFA組腦組織含水量低于模型組，高于空白組（均P<0.017）；24 h時，ω-3PUFA組MDA水平低于模型組，高于空白組（均P<0.017），ω-3PUFA組SOD水平高于模型組，低于空白組（均P<0.017）；在24 h時，ω-3PUFA組腦細胞凋亡率低于模型組（P<0.017）。結(jié)論 在新生大鼠HIBD模型中，應用ω-3PUFA可有效改善腦組織損傷和凋亡情況。

【關(guān)鍵詞】 Omega-3多不飽和脂肪酸；大鼠；缺氧缺血性腦損傷；凋亡反應

【中圖分類號】 R651 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）02-0173-06

Abstract： Objective To explore effects of omega-3 polyunsaturated fatty acids（ω-3PUFA）on inflammation， oxidative stress and apoptosis of brain tissue in newborn rats model with hypoxic-ischemic brain damage（HIBD）. Methods 90 newborn rats were divided into control group， model group and ω-3PUFA group by random number table. The ω-3PUFA group and the model group were treated with HIBD model， after modeling the former was given 150 mg/kg ω-3PUFA by intragastric administration， the latter was treated with equal volume and frequency physiological saline by intragastric administration， the control group was treated with sham surgery on the basis of the model group. Each group was divided into three subgroups of 6 h， 12 h and 24 h according to the time of being put to death，interleukin（IL）-6， tumor necrosis factor（TNF）-α， brain tissue water content， malondialdehyde（MDA）， superoxide dismutase（SOD） and neuronal apoptpsis rate of the control group， model group and ω-3PUFA group and their subgroups were comparatively analyzed. Results At 12 h and 24 h，IL-6 level in the ω-3PUFA group was lower than that in the model group， at different points in time， TNF-α level in the ω-3PUFA group was lower than that in the model group， TNF-α level in the ω-3PUFA group was higher than that in the control group（all P<0.017）. At 24 h，brain tissue water content in the ω-3PUFA group was lower than that in the model group， brain tissue water content in the ω-3PUFA group was higher than that in the control group（all P<0.017）. At 24 h，MDA level in the ω-3PUFA group was lower than that in the model group， MDA level in the ω-3PUFA group was higher than that in the control group（all P<0.017）， ??SOD level in the ω-3PUFA group was higher than that in the model group， SOD level in the ω-3PUFA group was lower than that in the control group（all P<0.017）. At 24 h，neuronal apoptpsis rate in the ω-3PUFA group was lower than that in the model group（P<0.017）. Conclusion In the neonatal rats with HIBD model， the application of ω-3PUFA can effectively relieve the brain tissue injury and apoptosis.

Key words： ω-3PUFA； rats； HIBD； apoptotic responses

基金項目：首都醫(yī)科大學2019年度科技技術(shù)、社科計劃項目（KM201910025001）

作者單位：101100 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院兒科

通信作者：李麗華

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指新生兒在圍生期由于窒息導致部分或完全缺氧，腦血流量降低或暫停引起的腦損傷［1］。在我國，新生兒HIBD的發(fā)病率約為2‰，其中15%～20%的患兒于新生期死亡，存活的患兒中25%～30%者將伴有永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷［2］。HIBD致病機制錯綜復雜，缺血缺氧狀態(tài)通過炎癥反應、氧化應激、線粒體功能障礙等途徑引發(fā)神經(jīng)元壞死和凋亡，形成近遠期神經(jīng)功能缺陷［3］。當前針對HIBD尚無根治性治療方法，臨床多采用亞低溫治療、機械通氣、保護神經(jīng)元等對癥支持治療，但預后并不理想［4-5］，促使研究人員積極地尋找更多的治療靶點。

Omega-3多不飽和脂肪酸（omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3PUFA）是人體必需脂肪酸之一。既往體外研究表明其不僅作為營養(yǎng)物質(zhì)供能，還能在許多神經(jīng)疾病中發(fā)揮調(diào)控炎性因子水平、保護神經(jīng)元、減輕傷后自噬反應等效用［6-7］，如Zhang等［8］報道ω-3PUFA能改善新生HIBD大鼠的血腦屏障功能，減少神經(jīng)元損傷。據(jù)此，本研究應用新生HIBD大鼠模型，進一步探索ω-3PUFA在HIBD中對腦組織的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物來源及分組 90只10日齡新生SD大鼠由潞河醫(yī)院實驗室提供，體質(zhì)量15～22 g，實驗期間大鼠飼養(yǎng)于室溫18～25 ℃、相對濕度40%～80%的清潔環(huán)境中；所有大鼠應用隨機數(shù)字表法等分為空白組、模型組、ω-3PUFA組（各30只），每組再隨機分為3個亞組（各10只），處死時間分別為模型建立后6 h、12 h、24 h。比較空白組、模型組、ω-3PUFA組及其亞組的腦組織白細胞介素（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、腦組織含水量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、腦細胞凋亡率。

1.2 HIBD模型建立

1.2.1 模型組和ω-3PUFA組行HIBD模型處理 ω-3PUFA組于術(shù)后立即予150 mg/kg的ω-3魚油脂肪乳注射液（華瑞制藥有限公司，國藥準字J20150040，100 mL∶10 g∶1.2 g）灌胃［9］；模型組予等體積等頻率生理鹽水灌胃。HIBD模型采用Rice-Vannucci經(jīng)典方法［10］：兩組大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，消毒頸部，然后鈍性分離大鼠右頸總動脈，用絲線行右頸總動脈永久性結(jié)扎，逐層縫合切口。大鼠在室溫中恢復2 h后，再而將兩組大鼠置于37 ℃的水浴恒溫箱中，通入80 mL/L氧氣和920 mL/L氮氣行缺氧處理2 h，完成HIBD模型后放回母鼠身邊喂養(yǎng)。當大鼠蘇醒后，于爬行時出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈，或提尾后右前肢屈曲，提示HIBD模型建立成功。

1.2.2 空白給予假手術(shù)處理 僅做右頸處鈍性分離和切口縫合，不做右頸總動脈結(jié)扎和缺氧處理，術(shù)后予等體積等頻率生理鹽水灌胃，操作結(jié)束后放回母鼠身邊喂養(yǎng)。分別于造模后6 h、12 h、24 h予ω-3PUFA組、模型組、空白組的亞組大鼠斷頭處死，死后快速取腦。

1.3 腦組織炎性因子水平檢測 大鼠經(jīng)處死后，取其右側(cè)腦皮質(zhì)組織約（200±20）mg，用冰9 g/L鹽水洗凈表面附著的血液，加入無菌生理鹽水，置入勻漿器行冰上勻漿，制成100 g/L的勻漿液。將勻漿液在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱中待檢。采用ELISA法檢測IL-6和TNF-α水平，試劑盒購自美國Adlitteram Diagnostic Laboratories公司，操作遵說明書。

1.4 腦組織氧化因子水平檢測 腦組織勻漿液制備方法同上，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平，用硫代巴比妥酸法檢測MDA水平。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，操作遵說明書。

1.5 腦組織含水量檢測 大鼠經(jīng)處死后，取其右側(cè)腦皮質(zhì)組織約（200±20）mg，采用干濕比重法檢測腦組織含水量。用已知重量的錫紙包裹腦組織樣本，在電子分析天平上獲得稱重結(jié)果后減去錫紙重量，得到濕重。再將錫紙與樣本共同放入60 ℃電熱烘干箱中24 h后稱重，減去錫紙重量后獲得干重，此后每6 h重復測量1次干重，直至前后兩次獲得的干重值差值不超過0.1 mg。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 腦細胞凋亡率檢測 大鼠經(jīng)處死后，取其右側(cè)腦皮質(zhì)組織約（100±20）mg，經(jīng)PBS清洗后除去PBS，剪碎腦組織，再用PBS清洗后除去PBS。加入0.4%胰蛋白酶3.0 mL，置于37 ℃水浴箱中30 min，然后除去胰蛋白酶，用PBS清洗后吸凈PBS。加入PBS 3.0 mL反復吹打1 min，制成單細胞懸液，過濾后離心5 min（1 000 r/min），去上清液，加入紅細胞裂解液3 mL，振蕩后離心10 min（1 200 r/min），重復2次，去上清液。加190 μL Bing buffer液搖勻，用5 μL Annexin V染色，再加5 μL碘化丙啶染色。試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司，應用流式細胞儀（美國Thermo公司產(chǎn)）檢測腦組織凋亡情況，操作遵說明書。

1.7 腦組織H&E染色病理檢測 大鼠經(jīng)處死后，取其右側(cè)腦皮質(zhì)組織約100 mm3加入多聚甲醛進行固定，石蠟包埋切片，厚度5～8 μm，組織切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精覆水、H&E染液染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后中性樹脂封片，在光學顯微鏡下檢測拍照。

1.8 腦組織免疫組化檢測 大鼠經(jīng)處死后，取其右側(cè)腦皮質(zhì)組織約100 mm3加入多聚甲醛進行固定，石蠟包埋切片，厚度5～8 μm，組織切片經(jīng)65 ℃烤片、二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、抗原修復、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后中性樹脂封片，光學顯微鏡觀察染色結(jié)果，并拍照記錄。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0版統(tǒng)計學軟件分析，計量資料等采用均數(shù)±標準差（x-±s）表示，計數(shù)資料用［（n）%］表示。三組間比較采用方差分析兩兩比較采用Bonferroni法，兩兩比較時采用校正P值即P<0.017。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 空白組和模型組大鼠腦組織HE染色病理變化比較 與空白組相比，12 h與24 h模型組大鼠腦組織炎性細胞數(shù)目顯著高于空白組（圖1），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。以上結(jié)果表明該模型構(gòu)建成功。

2.2 三組大鼠腦組織炎癥因子水平比較 三組大鼠腦組織免疫組化結(jié)果顯示，IL-6及TNF-α在模型組腦組織中表達顯著增加，而ω-3PUFA組表達則顯著減少（圖2）。在不同時間點，三組IL-6和TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=40.098，91.956；均P<0.01）；在不同時間點，模型組IL-6和TNF-α水平均高于空白組（均P<0.017）；在12 h和24 h時ω-3PUFA組IL-6水平低于模型組（均P<0.017）；在不同時間點，ω-3PUFA組TNF-α水平均低于模型組，高于空白組（均P<0.017），見表2，Elisa結(jié)果與免疫組化結(jié)果相符。

2.3 三組大鼠腦組織含水量比較 不同時間點三組大鼠腦組織含水量比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=67.845，P<0.01）；不同時間點，模型組腦組織含水量均高于空白組（P<0.017）；在24 h時，ω-3PUFA組腦組織含水量低于模型組，高于空白組（均P<0.017），見表3。

2.4 三組大鼠腦組織氧化因子水平比較 三組不同時間點MDA和SOD水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=71.763，138.039；均P<0.01）；不同時間點模型組MDA水平均高于空白組，SOD水平均低于空白組（均P<0.017）；24 h時，ω-3PUFA組MDA水平低于模型組，高于空白組（均P<0.017），ω-3PUFA組SOD水平高于模型組，低于空白組（均P<0.017），見表4。

2.5 三組大鼠腦細胞凋亡率比較 三組大鼠腦組織的流式細胞凋亡結(jié)果顯示，三組不同時間點腦細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義（F=305.179，P<0.01）；在不同時間點，模型組和ω-3PUFA組腦細胞凋亡率均高于空白組（P<0.017）；24 h時，ω-3PUFA組腦細胞凋亡率低于模型組（P<0.017），見圖3、表5。

3 討 論

HIBD發(fā)病急、預后差、病死率高，是引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷的主要原因之一［11-12］。目前亞低溫治療等對癥支持措施是HIBD的主要救治手段，但即使經(jīng)過正規(guī)治療，仍有相當部分患兒死亡或遺留永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷（如智能發(fā)育障礙、認知障礙、發(fā)育遲緩、癲癇等）［13-14］，可見尋找更多有效的保護神經(jīng)元策略至關(guān)重要。先前有研究報道，ω-3PUFA在缺血性腦卒中、缺血性腦損傷、缺血性視神經(jīng)病變等動物模型中均呈現(xiàn)出不同程度的抗氧化和抗炎作用［15-16］，ω-3PUFA對神經(jīng)元的這種保護作用提示其或在HIBD中發(fā)揮良好治療效果，由此本研究對HIBD大鼠模型應用ω-3PUFA，觀察其效。

炎癥反應是HIBD的重要環(huán)節(jié)之一，活化的中性粒細胞、小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞等炎性細胞將釋放炎性因子，破壞血腦屏障，引起腦水腫，導致神經(jīng)元變性和壞死［17］。本研究中，在12 h和24 h時，ω-3PUFA組IL-6水平低于模型組，在不同時間點ω-3PUFA組TNF-α水平均低于模型組，高于空白組。HIBD建成后根據(jù)不同亞組實驗結(jié)果可觀察到，大鼠腦組織炎性因子水平和含水量在6 h、12 h、24 h后漸漸增多，而應用ω-3PUFA的大鼠IL-6、TNF-α水平以及腦水腫程度在部分時間點較模型組少。說明隨著時間的延長，HIBD大鼠的炎癥反應逐漸加重，ω-3PUFA在緩解HIBD炎癥程度上具有一定作用。Giacobbe等［18］報道ω-3PUFA是神經(jīng)發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也是腦神經(jīng)元細胞膜中幾種成分的前體，其能改變鈣離子通道和細胞信號轉(zhuǎn)導通路功能，如MAPK、P38、JNK信號通路，進而調(diào)控炎性因子基因的表達水平。由此可以進一步推測，ω-3PUFA在HIBD大鼠模型中的抗炎癥反應機制或許與影響相關(guān)信號通路有關(guān)。Trépanier等［19］分析61篇研究得出，ω-3PUFA在創(chuàng)傷性腦損傷、神經(jīng)病理性疼痛、脂多糖誘導腦損傷、脊髓損傷等動物模型中，均呈現(xiàn)出抗神經(jīng)炎癥的特性，一定程度支持了本研究的結(jié)論，但本研究未詳細挖掘相關(guān)機制，有望在后續(xù)的研究中進行拓展。

缺血缺氧狀態(tài)可產(chǎn)生大量活性氧，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)中氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡紊亂，最終導致神經(jīng)元凋亡。未成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化能力有限，因此具有更高的細胞凋亡率。本研究中，24 h時ω-3PUFA組MDA水平低于模型組，高于空白組，ω-3PUFA組SOD水平高于模型組，低于空白組。SOD是氧自由基清除系統(tǒng)中的抗氧化酶，MDA是氧化應激反應中脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，二者水平反映了氧化應激對機體的損傷程度。對HIBD大鼠模型應用ω-3PUFA可減少MDA的增多，緩解SOD的減少，改善了氧化反應程度，說明ω-3PUFA還可在抗氧化應激方面上減少HIBD時的腦組織損傷。不僅如此，在其他原因?qū)е碌纳窠?jīng)系統(tǒng)損傷中，ω-3PUFA也表現(xiàn)出了抗氧化應激作用：Bi等［20］報道對脊髓損傷大鼠補充ω-3PUFA可降低缺血再灌注誘導的氧化應激、細胞凋亡、炎癥的程度，ω-3PUFA對脊髓神經(jīng)元具有保護作用；Shi等［21］應用脂多糖誘導新生大鼠海馬組織發(fā)生炎癥反應和氧化應激，再予大鼠ω-3PUFA，觀察到ω-3PUFA可升高海馬組織中SOD和谷胱甘肽活性，降低MDA和氧化型谷胱甘肽含量，減少脂多糖對神經(jīng)元的氧化作用。然而當前關(guān)于ω-3PUFA在HIBD中的抗氧化作用的研究尚不多見，有待更多證據(jù)證實具體途徑。

凋亡是細胞生理性、自主性的死亡程序，相關(guān)研究表明，缺氧缺血狀態(tài)引發(fā)神經(jīng)元的死亡主要是由凋亡反應引起。本研究中，在24 h時ω-3PUFA組腦細胞凋亡率低于模型組，說明ω-3PUFA能減少腦細胞的凋亡。ω-3PUFA減少HIBD大鼠腦細胞凋亡率的機制尚不明確，可能與其能減輕炎癥反應和氧化應激程度有關(guān)。Chen等［22］報道ω-3PUFA能抑制創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的腦組織小膠質(zhì)細胞活化和炎性因子表達，進而減少腦水腫和神經(jīng)元凋亡。該研究基于創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，從減少炎癥反應的角度解釋了ω-3PUFA減少腦細胞凋亡的作用，與本研究所用的HIBD模型不同，但都提示了ω-3PUFA對減少神經(jīng)細胞損傷的正性作用。另外，該研究中還提到ω-3PUFA可抑制創(chuàng)傷性腦損傷引起的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Cleaved caspase-3）和凋亡相關(guān)基因Bax蛋白的表達量以發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用，這可能是ω-3PUFA減少神經(jīng)元凋亡的機制之一。

綜上，ω-3PUFA可減輕HIBD新生大鼠的腦水腫程度，改善腦組織損傷情況，未來可能成為HIBD治療的新興策略。

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（收稿2021-12-27 修回2022-02-05）