齊琦 田露 楊思琪 龔國利

摘?要：藤黃微球菌是一種條件致病菌，不僅會感染養(yǎng)殖水產品，還會導致人體感染.麝香草酚作為一種綠色、天然、高效的植物源抗菌劑，具有良好的抑菌活性.本研究在細胞水平上探究了麝香草酚對藤黃微球菌的生長、細胞膜通透性以及細胞形態(tài)等多方面的影響.結果表明，麝香草酚對藤黃微球菌的最小抑菌濃度為0.31 mg/mL，在該濃度下藤黃微球菌的細胞膜電位、胞內ATP、DNA完整性、胞內pH分別降低了4.79、49.90、0.40、0.56倍，胞內活性氧增加了0.36倍，并通過CLSM和SEM進一步觀察到細胞膜皺縮、破損.揭示了麝香草酚對藤黃微球菌的抑菌活性及可能的抑菌機制，為麝香草酚作為天然抗菌劑提供理論支撐.

關鍵詞：麝香草酚；藤黃微球菌；抑菌活性

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼： A

文章編號：2096-398X（2023）04-0064-06

Abstract：Micrococcus garciniae is a conditionally pathogenic bacterium that not only infects farmed aquatic products，but also causes infections in humans.Thymol，as a green，natural and highly effective plant-derived antimicrobial agent，has good antibacterial activity.In this study，the effects of muscimol on the growth，cell membrane permeability and cell morphology of M.garciniae were investigated at the cellular level.The results showed that the minimum inhibitory concentration of thymol on M.garciniae was 0.31 mg/mL，at which the cell membrane potential，intracellular ATP，DNA integrity and intracellular pH of M.garciniae decreased by 4.79，49.90，0.40 and 0.56-fold，respectively，and the intracellular reactive oxygen species increased by 0.36-fold，and further cell membrane wrinkling and breakage was observed by CLSM and SEM.The antibacterial activity of thymol against M.garciniae and the possible mechanism of inhibition were revealed，providing theoretical support for thymol as a natural antibacterial agent.

Key words：thymol; Micrococcus garciniae; antibacterial activity

0?引言

藤黃微球菌屬于微球菌屬，在自然界中廣泛存在，在人和其他哺乳動物的皮膚上可分離得到.當機體抵抗力下降時，藤黃微球菌可能會引發(fā)如腦脊液感染、腦膜炎、脊髓感染、藤黃微球菌關節(jié)炎等疾?。?-3］.研究表明，黃褐斑患者的面部藤黃微球菌數(shù)量高于正常人［4］.藤黃微球菌還會導致黃鱔出血病，造成經濟損失［5］.在過去的二十年中，由于不規(guī)范地使用抗生素，以及遺傳耐藥性成分的不斷演變和傳播，導致多種多重耐藥（MDR）甚至極端耐藥（XDR）細菌病原體出現(xiàn)，增加了患者的發(fā)病率、死亡率和醫(yī)療成本［6］.而天然產物所具備的低毒、無公害和無抗藥性等優(yōu)勢，使其被開發(fā)為新型抗菌劑并對解決當前抗生素危機提供了新思路［7］.

麝香草酚又稱百里酚，是傘花烴的天然酚單萜衍生物和香芹酚的異構體，具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎和解痙活性，以及作為生長促進劑和免疫調節(jié)劑的潛力［8］.據(jù)報道，麝香草酚可抑制食源性病原體生長，例如產氣莢膜梭菌、大腸桿菌和李斯特菌［9，10］.主要機制是通過降低細胞質膜上的pH使其去極化.pH梯度的降低也會對質子動力產生不利影響，導致細胞內ATP的消耗，從而導致細胞死亡［11，12］.Khan等［13］發(fā)現(xiàn)，麝香草酚會誘導變形鏈球菌的自溶和應激，誘導提升自溶素基因（atlE）和超氧化物歧化酶基因（sodA）的表達水平.此外，Ranjbar等［14］發(fā)現(xiàn)麝香草酚還具有抗真菌活性，表現(xiàn)為通過降低細胞壁降解酶的活性，抑制石榴果實腐爛真菌的生長.然而目前還缺乏有關麝香草酚對藤黃微球菌的抑菌活性和其作用機制的研究.

本文通過測定麝香草酚對藤黃微球菌的最小抑菌濃度、生長曲線、膜電位、胞內ATP水平、胞內活性氧含量、DNA完整性和胞內pH，同時通過激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）和場發(fā)射掃描電鏡（SEM）觀察細胞膜完整性和細胞形態(tài)，探究麝香草酚對藤黃微球菌的抑制作用和可能的機制，為麝香草酚作為新型抗菌劑提供可靠的理論依據(jù).

1?材料與方法

1.1?材料及儀器

1.1.1?菌株和培養(yǎng)物

藤黃微球菌（BNCC 103930），購自北京細菌培養(yǎng)保藏中心（China BNCC），儲存于-80 ℃.

1.1.2?主要試劑

麝香草酚（純度>98%）、2′，7′-二氯熒光素（上海生工生物工程股份有限公司），磷酸緩沖鹽（北京索萊寶科技有限公司），LB肉湯培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術有限責任公司），DiBAC4（3）（美國sigma公司），SYTO 9/PI試劑盒（賽默飛世爾科技公司），ATP檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）.

1.1.3?主要儀器

BS210S電子天平（上海天平儀器廠），DZF-6050真空干燥箱、THZ-98A恒溫振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司），TGL20M臺式高速離心機（長沙英泰儀器有限公司），Synergy H1多功能酶標儀（BT2），LSM800激光共聚焦掃描顯微鏡（德國卡爾蔡司），MLA場發(fā)射掃描電子顯微鏡（美國FEI）.

1.2?實驗方法

1.2.1?菌懸液的制備

將保藏在-80 ℃冰箱中的菌株用平板劃線法接種在LB固體平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h.挑取單菌落于LB肉湯培養(yǎng)基中活化，即可獲得藤黃微球菌的菌懸液.

1.2.2?麝香草酚對藤黃微球菌最小抑菌濃度（Minimum inhibition concentration，MIC）測定

根據(jù)1.2.1節(jié)的方法制備OD600為0.5（約108 CFU/mL）的菌懸液.本實驗在96孔板中采用微量稀釋法測定，先將麝香草酚溶解于無水乙醇中，制成100 mg/mL的母液，在96孔板中加入菌懸液和母液，使麝香草酚的終濃度為5.00 mg/mL、2.50 mg/mL、1.25 mg/mL、0.63 mg/mL、0.31 mg/mL、0.16 mg/mL和0.08 mg/mL，以不含麝香草酚的實驗組為陰性對照組，以終濃度為10 mg/mL的氨芐青霉素鈉的實驗組為陽性對照組.混合均勻后，將孔板進行恒溫培養(yǎng)，用酶標儀測定600 nm處的吸光值，并結合肉眼觀察.

1.2.3?麝香草酚對藤黃微球菌的生長曲線的影響

根據(jù)1.2.1節(jié)中的方法制備菌懸液.經1.2.2節(jié)測定得到MIC值后，在96孔板中加入菌懸液和母液，使麝香草酚的終濃度為2 MIC、MIC 、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC，同時以不含麝香草酚的實驗組作為對照組.每隔1 h用酶標儀測定600 nm處的吸光值，共檢測24 h，并繪制生長曲線.

1.2.4?麝香草酚對藤黃微球菌膜電位的影響

根據(jù)1.2.1節(jié)中的方法制備菌懸液.離心收集菌體沉淀，用PBS洗滌菌體并重懸，加入母液后使麝香草酚的終濃度為0、MIC和2 MIC，培養(yǎng)2 h后離心收集菌體沉淀，洗滌并重懸后加入3 mM DiBAC4（3）膜電位熒光探針，避光孵育30 min，分別吸取200 μL加入到黑色96孔板中.多功能酶標儀測定熒光強度（激發(fā)波長=492 nm，發(fā)射波長=515 nm）.

1.2.5?麝香草酚對藤黃微球菌胞內ATP的影響

方法同1.2.4節(jié)，得到麝香草酚處理并用PBS洗滌的菌體沉淀后，使用ATP檢測試劑盒測定細菌胞內ATP含量.

1.2.6?麝香草酚對藤黃微球菌胞內活性氧（Reactive-oxygen species，ROS）的影響

方法同1.2.4節(jié)，得到麝香草酚處理并用PBS洗滌的菌體沉淀后，加入100 μL的10 mM的2′，7′-二氯熒光素，避光孵育1 h，離心并用PBS洗滌菌體沉淀后重懸.各吸取200 μL加入到黑色96孔板中，測定熒光強度（激發(fā)波長=498 nm，發(fā)射波長=520 nm）.

1.2.7?麝香草酚對藤黃微球菌DNA完整性的影響

方法同1.2.4節(jié)，向PBS重懸的菌懸液中加入1.5 μL的SYTO 9熒光探針，避光孵育15 min，分別吸取200 μL加入到黑色96孔板中，測定熒光強度（激發(fā)波長=485 nm，發(fā)射波長=525 nm）.

1.2.8?麝香草酚對藤黃微球菌pHin的影響

根據(jù)1.2.1節(jié)中的方法制備OD600為0.5（約108 CFU/mL）的菌懸液，離心后用磷酸鉀溶液洗滌菌體并重懸，加入3 mM cFDA-SE熒光探針后孵育20 min，洗滌菌體并離心.用10 mM葡萄糖溶液重懸菌體30 min以去除未結合的cFSE熒光探針.PBS洗滌后重懸，加入母液使麝香草酚的終濃度為0、MIC和2 MIC.培養(yǎng)2 h后分別吸取200 μL加入到黑色96孔板中，測定熒光強度（激發(fā)波長=490/440 nm，發(fā)射波長=515 nm）.

測定不同pH溶液負載熒光探針后的熒光強度，將激發(fā)波長在490 nm和440 nm下的熒光比值與藤黃微球菌的pHin構建校準曲線.用NaOH/HCl調節(jié)緩沖溶液的pH值至3、4、5、6、7、8、9和10.用纈氨霉素（10 μM）平衡細胞的pH值使pHin等于pHout.最后測定熒光強度，并根據(jù)標準曲線計算細菌樣品的pH值.

1.2.9?麝香草酚對藤黃微球菌細胞膜完整性的影響

方法同1.2.4節(jié)，得到麝香草酚處理的菌體沉淀，用PBS洗滌并重懸，向菌懸液中按1∶1（v/v）加入3 μL的SYTO 9和PI熒光探針，避光孵育15 min，用PBS洗滌并重懸.吸取2-3 μL菌懸液滴加在載玻片上，通過CLSM觀察其熒光顏色的變化，拍照保存.

1.2.10?麝香草酚對藤黃微球菌細胞形態(tài)的影響

方法同1.2.4節(jié)，得到麝香草酚處理并用PBS洗滌后的菌體沉淀.用2.5%（v/v）戊二醛在冰箱（4 ℃）固定過夜，PBS洗滌菌體，將無水乙醇稀釋為30%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的梯度濃度，逐步脫水（每個梯度處理10 min）.用乙酸異戊酯重懸菌體30 min后離心.烘箱干燥后通過導電膠將菌體粘附在樣品臺上，濺射噴金，通過SEM觀察細胞形態(tài)的變化，拍照保存.

2?結果與討論

2.1?麝香草酚對藤黃微球菌的最小抑菌濃度

最小抑菌濃度是指培養(yǎng)細菌18 h后能抑制病原菌生長的最低藥物濃度.由圖1可見，當麝香草酚的濃度<0.31 mg/mL時，18 h后600 nm處的吸光度值均已超過0.5，且培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，說明細菌進行了生長繁殖；當麝香草酚的濃度≥0.31 mg/mL時，吸光度值均低于0.5，與陽性對照組的數(shù)值相當，且培養(yǎng)液相對清澈，說明細菌的生長受到了抑制.結果表明，麝香草酚對藤黃微球菌具有抑制作用，其MIC約為0.31 mg/mL.

2.2?麝香草酚對藤黃微球菌生長曲線的影響

生長曲線是指培養(yǎng)細菌時，以OD600為縱坐標，以時間為橫坐標作圖得到的曲線.由圖2可知，在0～3 h為藤黃微球菌的生長遲緩期，此時期各濃度下的吸光度未出現(xiàn)明顯差異.在3～10 h內，濃度

2.3?麝香草酚對藤黃微球菌膜電位的影響

膜電位是指生物細胞膜內外的電位差，由圖3可見，與對照組相比，經過麝香草酚處理2 h后，藤黃微球菌的細胞膜電位顯著降低.對照組的藤黃微球菌膜電位為2775，MIC組為-10 509，2 MIC組為-13 614，分別降低了4.79和5.91倍，表明麝香草酚引起了藤黃微球菌細胞膜的超極化，這可能會改變鉀離子通道的活性并導致其泄露，從而干擾菌體的正常生命活動.

2.4?麝香草酚對藤黃微球菌胞內ATP的影響

胞內ATP是細胞內最重要的能量分子，參與細胞的各種生命活動.由圖4可見，對照組的ATP含量為728，經MIC和2 MIC處理后的細菌胞內ATP分別為14.3和7.0，分別下降了49.90倍和103倍.說明經麝香草酚處理后，藤黃微球菌的胞內ATP濃度顯著降低.胞內ATP的顯著降低，可能是麝香草酚增加了藤黃微球菌的細胞膜的通透性，引起ATP的大量泄露；也可能是其影響了細菌胞內ATP的正常合成和代謝，導致胞內ATP的快速消耗或抑制了ATP的合成，最終紊亂菌體的正常生命活動，甚至導致菌體的死亡.

2.5?麝香草酚對藤黃微球菌胞內ROS的影響

ROS是氧正常代謝的天然副產物，在惡劣條件下，ROS水平會急劇增加.2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯是一種可滲透細胞的熒光探針，可定量ROS變化，用于評估毒理學中的整體氧化應激.

如圖5所示，對照組的ROS含量為979，經MIC和2 MIC濃度處理2 h后，藤黃微球菌的ROS含量分別為1 540和1 824，分別增加了0.36倍和0.46倍.表明麝香草酚會誘導細菌發(fā)生氧化應激，導致胞內ROS過量積累進而氧化損傷.

2.6?麝香草酚對藤黃微球菌DNA完整性的影響

如圖6所示，對照組熒光強度為1 006，而經MIC和2 MIC濃度處理2 h后，藤黃微球菌的熒光強度分別為605和428，分別降低了0.40倍和0.57倍.SYTO 9是一種可以和DNA小溝結合的熒光染料，熒光強度越高，則DNA的完整度越高.表明隨麝香草酚處理濃度增加，可與SYTO 9結合的DNA被降解或結構被破壞，熒光強度逐漸降低.DNA損傷會抑制細菌的正常增殖和代謝，甚至導致菌體死亡.

2.7?麝香草酚對藤黃微球菌pHin的影響

熒光探針cFDA-SE易被細胞質中的脂酶水解，水解產物會發(fā)出綠色熒光，且在490 nm和440 nm處的熒光強度比值與pH呈現(xiàn)良好的線性關系，通過計算熒光強度比值，并與pH標準曲線進行構建，可以獲得熒光強度比值與pHin的校準曲線：y=1.380 5x-2.001 3，R2=0.987 7.

如圖7所示，未經處理的藤黃微球菌pHin為1.8，而經過MIC和2 MIC濃度處理2 h后，其pHin值為0.8和0.7，分別降低了0.56倍和0.61倍.pH降低說明處理后的細胞內氫離子大量積累，導致離子通道的干擾和關閉，從而影響細胞膜的通透性和正常的生長代謝.

2.8?麝香草酚對藤黃微球菌細胞膜完整性的影響

圖 8（a）表示對照組的藤黃微球菌，細胞膜完整從而發(fā)出綠色熒光；圖8（b）和圖8（c）表示經過MIC和2 MIC濃度處理后，細胞膜已不再完整，被PI染色后發(fā)出紅色熒光.結果表明，經麝香草酚處理后，細菌的細胞膜被破壞，導致細菌死亡.本實驗采用SYTO 9和PI雙熒光染料染色法，SYTO 9透過活細胞膜，與完整的DNA結合，發(fā)出綠色熒光；PI只能通過破損的細胞膜，標記死細胞并發(fā)出紅色熒光.用兩個熒光探針同時浸染細菌，并在CLSM下觀察熒光，可區(qū)分細胞膜完整和破損的細菌.

2.9?麝香草酚對藤黃微球菌細胞形態(tài)的影響

通過SEM進一步研究了麝香草酚對細胞形態(tài)的影響.如圖9（a）所示，對照組中細胞結構完整，細胞膜表面圓滑規(guī)整；圖9（b）為MIC處理后的細菌，細胞膜表面出現(xiàn)裂紋，細胞膜被損傷出現(xiàn)創(chuàng)口；圖9（c）為2 MIC處理后的細菌，可見大部分細菌的細胞膜和細胞形態(tài)都被嚴重破壞，細胞出現(xiàn)塌陷和皺縮.

SEM結果與前文細胞膜滲透性和完整性的研究結果一致，驗證了麝香草酚會導致藤黃微球菌細胞膜的結構和功能發(fā)生改變，影響細菌的正常生長代謝，進而抑制或殺死細菌.

3?結論

本研究在細胞水平上探究了麝香草酚對藤黃微球菌的抑菌活性和可能的抑菌機制.實驗結果表明麝香草酚對藤黃微球菌有良好的抑菌作用，其MIC值約為0.31 mg/mL，麝香草酚會使藤黃微球菌的細胞膜發(fā)生超極化，誘導細胞發(fā)生氧化應激，導致細胞過氧化損傷，破壞細胞膜的通透性和形態(tài)，使胞內ATP濃度降低、核酸分子被破壞，細胞出現(xiàn)塌陷和皺縮、細胞膜破 損.本研究結果可為麝香草酚的開發(fā)和利用提供理論依據(jù).

參考文獻

［1］ 陳?玲，姚齊龍.從血液及痰液中均同檢出藤黃微球菌1例報道［J］.四川省衛(wèi)生管理干部學院學報，2000，19（2）：100.

［2］ 姜梅杰，魏緒廷.顱腦外傷患者腦脊液中檢出藤黃微球菌一例［J］.中華神經外科雜志，2005，21（12）：735.

［3］ 劉?英，鄒桂玲，孟小玉，等.骨髓培養(yǎng)檢出藤黃微球菌1例［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2007，17（8）：1 017.

［4］ 林?敏.黃褐斑患者皮損表面微球菌定植情況研究［D］.遵義：遵義醫(yī)科大學，2020.

［5］ 彭?彬，楊光友，陳曉利，等.黃鱔藤黃微球菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.上海海洋大學學報，2011，20（3）：405-411.

［6］ Banin E，Hughes D，Kuipers O P.Editorial：Bacterial pathogens，antibiotics and antibiotic resistance［J］.FEMS Microbiology Reviews，2017，41（3）：450-452.

［7］ Dai J，Han R，Xu Y，et al.Recent progress of antibacterial natural products：Future antibiotics candidates［J］.Bioorganic Chemistry，2020，101：1-25.

［8］ Salehi B，Mishra A P，Shukla I，et al.Thymol，thyme，and other plant sources：Health and potential uses［J］.Phytotherapy Research，2018，32（9）：1 688-1 706.

［9］ Du E，Gan L，Li Z，et al.In vitro antibacterial activity of thymol and carvacrol and their effects on broiler chickens challenged with Clostridium perfringens［J］.Journal of Animal Science and Biotechnology，2015，6：58-70.

［10］ Guarda A，Rubilar J F，Miltz J，et al.The antimicrobial activity of microencapsulated thymol and carvacrol［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，146（2）：144-150.

［11］ Ultee A，Bennik M H，Moezelaar R.The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68（4）：1 561-1 569.

［12］ Xu J，Zhou F，Ji B P，et al.The antibacterial mechanism of carvacrol and thymol against Escherichia coli［J］.Letters in Applied Microbiology，2008，47（3）：174-179.

［13］ Khan S T，Khan M，Ahmad J，et al.Thymol and carvacrol induce autolysis，stress，growth inhibition and reduce the biofilm formation by Streptococcus mutans［J］.AMB Express，2017，7（1）：49-60.

［14］ Ranjbar A，Ramezanian A，Shekarforoush S，et al.Antifungal activity of thymol against the main fungi causing pomegranate fruit rot by suppressing the activity of cell wall degrading enzymes［J］.LWT-Food Science and Technology，2022，161：1-15.

【責任編輯：蔣亞儒】

基金項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目（21JK0541）；陜西省咸陽市秦創(chuàng)原科技創(chuàng)新專項項目（2021ZDZX-NY-0007）

作者簡介：齊?琦（1997—），女，陜西咸陽人，在讀碩士研究生，研究方向：天然食品防腐劑

通訊作者：田?露（1989—），女，陜西榆林人，副教授，博士，研究方向：微生物代謝產物分離及鑒定?tianlu@sust.edu.cn