王云娜　何悅　孫娜娜　黃銳　徐秦峰

摘要：乳鐵蛋白（Lactoferrin）是一種廣泛存在于哺乳動物外分泌液中的天然非血紅素鐵結(jié)合蛋白，具有多種生理活性應用于乳制品.羊乳營養(yǎng)組成更加趨近于人乳，以羊乳為基底物的“全羊”配方產(chǎn)品具有更廣闊的市場訴求，對其乳鐵蛋白的來源及含量監(jiān)督有助于推動乳品“母乳化”研究的不斷發(fā)展，對羊乳基嬰幼兒配方乳粉的開發(fā)研究有重大的指導意義.研究利用DNA序列與羊乳鐵蛋白的特異性結(jié)合，采集凝膠成像圖中GLF-DNA序列復合物條帶的灰度值，建立了一種簡便、快速檢測乳及乳制品中羊乳鐵蛋白含量的電泳遷移技術(shù).結(jié)果表明，該方法結(jié)果準確、操作簡單，適用于乳及乳制品中羊乳鐵蛋白含量檢測，可以為特色生鮮乳中乳鐵蛋白檢測和營養(yǎng)價值評估提供參考.

關(guān)鍵詞：羊乳鐵蛋白檢測； 電泳遷移技術(shù)； DNA序列； 熒光標記

中圖分類號：TS252文獻標志碼： A

Determination of goat lactoferrin in milk and

dairy products by electrophoretic mobility shift assay

WANG Yun-na HE Yue SUN Na-na HUANG Rui XU Qin-feng（1.School of Food Science and Engineering， National R & D Center for Goat Dairy Products Processing Technology， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China； 2.Zhongken Huashan Mu Dairy Co.， Ltd.， Weinan 714000， China）

Abstract：Lactoferrin is a natural non-heme iron-binding glycoprotein widely found in mammalian exudate，which has a variety of physiological activities and has been applied to dairy products.The nutritional composition of goat milk is more similar to human milk.The ″whole sheep″ formula based on goat milk has a broader market appeal.The supervision of the source and content of lactoferrin is helpful to promote the continuous development of the research on ″breast milk″ of dairy products，and has great guiding significance for the development and research of goat milk based infant formula milk powder.In this study，a simple and rapid electrophoretic migration technique was established to detect the content of goat lactoferrin in dairy products by using the specific binding of DNA sequence and GLF-DNA sequence complex band in gel imaging images.The results show that the method is accurate，simple and suitable for the detection of goat lactoferrin in dairy products，and could provide a reference for the detection of goat lactoferrin in characteristic fresh milk and the evaluation of nutritional value.

Key words：detection of goat lactoferrin； electrophoretic mobility shfit assay； DNA sequence； fluorescent labeled

0引言

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種廣泛存在于哺乳動物外分泌液中的天然非血紅素鐵結(jié)合蛋白［1］.我國的優(yōu)質(zhì)乳工程已經(jīng)把乳鐵蛋白含量作為評價優(yōu)質(zhì)乳的重要參考指標之一.已有大量研究證實，乳鐵蛋白具有多種對人體有益的生理活性，最常見的包括廣譜抗菌活性、抗病毒功能，鐵轉(zhuǎn)運以及維持人體鐵平衡等可以作為營養(yǎng)強化劑用于乳制品及保健食品中［2-5］.

國內(nèi)外對乳鐵蛋白含量檢測已有很大進展，GB 1903.17-2016《食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑 乳鐵蛋白》中僅針對乳及其制品為原料制得的LF原料的檢測，并不能用于食品中LF檢測，對食品中乳鐵蛋白檢測通常有免疫法［6-8］、色譜法［9-11］及電泳法［12-14］.羊乳含有羊乳鐵蛋白等多種營養(yǎng)物質(zhì)，致敏性較低，蛋白組成更加接近人乳，得到了越來越廣泛的應用［15］.以羊乳為基底物的配方產(chǎn)品，比如羊乳清蛋白研制的“全羊”嬰幼兒配方奶粉會有更大的市場訴求，需要我們對其配方中乳清蛋白來源及含量評估及監(jiān)督，使得“全羊配方”成為可能［16］.

例如，免疫法特異性強，靈敏度高，但需要考慮乳鐵蛋白的活性，避免加工工藝的影響.王玉堂等［17］開發(fā)了羊乳中乳鐵蛋白的高效液相色譜測定方法分析羊乳中乳鐵蛋白的分布規(guī)律，結(jié)果準確，但對樣品的純度要求較高，樣品前處理繁瑣.田榮榮等［18］利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測不同來源乳中乳鐵蛋白的含量，靈敏度高，可實現(xiàn)微量檢測，但儀器昂貴，對操作人員要求較高.電泳法操作簡單，分離效果好，但容易受檢測條件及毛細管吸附作用的影響.

近年來，適配體與靶標蛋白具有高特異性和親和力，更加適用于復雜樣品體系中乳鐵蛋白含量的檢測.孫娜娜等［19］利用核酸適配體和LF的特異性結(jié)合，引起的游離核酸適配體的峰面積大小和LF濃度的線性變化，對乳制品中乳鐵蛋白進行檢測，操作簡便，但只能間接定量.黃銳等［20］基于DNA序列和LF-DNA復合物凝膠電泳遷移率差異，通過復合物的熒光值和蛋白的濃度關(guān)系實現(xiàn)LF檢測，操作簡單，無需大型儀器.以上電泳方法均是針對牛乳鐵蛋白定性定量分析，缺乏對羊乳鐵蛋白的檢測.

本研究采用凝膠電泳遷移法測定乳及乳制品中羊乳鐵蛋白含量，靈敏度高、成本低且不需要復雜的前處理，希望為特色乳的營養(yǎng)價值評估提供參考及食品加工提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和技術(shù)思路.

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

1.1.1主要試劑

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG） 純度≥90%、α-乳白蛋白（α-lactabumin，α-Lac） 純度≥85%、酪蛋白（Casein）純度≥90%，均購買自Sigma-Aldrich；羊乳鐵蛋白（goat lactoferrin，GLF） 純度≥85%（優(yōu)博）；100 μM FAM-DNA序列（5′- GCA GGA CAC CGT AAC AAT ACT CCT GTT ACC GTG CAT CTA TGG CCA TTG GCT TTT CCT GC-3′（FAM））；DL500 bp DNA marker（Takara）；PBS粉末（Sigma公司）；分子生物級瓊脂糖（Thermo Fisher Scientific）；Molecular Biology Grade 50×TAE buffer（上海生工生物工程公司）；SYBR Gold染料（Invitrogen）.

1.1.2主要儀器

5424R高速冷凍離心機（Eppendorf）；MYSPIN12微型離心機（Thermo Fisher Scientific）；VORTEX2渦旋振蕩器（IKA）；DK-8D恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；PowerPacTM Basic瓊脂糖水平電泳儀（BIO-RAD）；VE0100 B-BOX 藍光透射儀（SMOBIO）；M1-L213B 21L微波爐（美的）.

1.2實驗材料

嬰幼兒配方羊乳粉（不含乳鐵蛋白）購買于當?shù)厥袌觯貎Υ?；鮮羊乳購買于當?shù)啬翀觯? ℃儲存.

1.3檢測方法

（1）DNA序列前處理：DNA序列儲備液用1×PBS稀釋至一定濃度，退火處理后保存至冰箱冷卻備用.

（2）瓊脂糖凝膠電泳：將退火后的核酸適配體加入稀釋至一定濃度的乳鐵蛋白標準溶液或含一定量乳鐵蛋白的待測樣品，用1×PBS調(diào)整終體積為20 μL，孵育一定時間，在樣品中加入4 μL甘油上樣液后進行電泳.電泳參數(shù)：1%的瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，電壓為100 V，電泳時間為25 min.電泳結(jié)束后使用藍光透射儀觀察電泳結(jié)果.使用數(shù)據(jù)處理軟件WCIF Image J采集條帶灰度值，將得出的數(shù)據(jù)值導入QriginPro生成結(jié)果圖.

1.4實際樣品檢測

（1）實際樣品前處理：鮮羊乳在4 ℃，12 000 r/min離心處理10 min，取中間層；羊奶粉溶解方式為稱取1 g奶粉用超純水定容至7 mL，4 ℃，12 000 r/min離心處理10 min，取中間層.

（2）實際樣品檢測：用所建立的檢測GLF的方法，分別檢測鮮羊乳、羊奶粉中GLF含量.在實際樣品中加入GLF標準品進行加標回收檢測.

2結(jié)果與討論

2.1凝膠電泳遷移法檢測乳鐵蛋白可行性

凝膠電泳遷移法是根據(jù)帶電粒子在電場作用下的遷移率，研究核酸結(jié)合蛋白和相關(guān)核酸互相作用的技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)和核酸的定性定量分析［21］.牛羊乳鐵蛋白相同氨基酸序列達92.23%，楊博睿等［22］通過聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗發(fā)現(xiàn)GLF相較BLF條帶位置更加偏上，兩種蛋白有明顯的不同.通過比較蛋白-核酸復合物和游離核酸的電泳遷移率差異，來判斷GLF是否發(fā)生特異性結(jié)合.乳制品中含有多種組分，包括酪蛋白及其他乳清蛋白.將單獨的DNA序列分別與乳制品中幾種主要的乳清蛋白α-Lac、β-LG、Casein、GLF標準品的混合液進行瓊脂糖凝膠電泳.

如圖1所示，1～4號泳道中只觀察到游離適配體的條帶，表明該DNA序列不會與α-Lac、β-LG、Casein等乳蛋白產(chǎn)生非特異性結(jié)合.而在5號泳道中觀察到明顯的DNA-GLF復合物條帶且遷移率低于游離適配體，同時未結(jié)合的DNA序列灰度值明顯降低.說明只有GLF能與適配體結(jié)合形成復合物.該實驗可以說明凝膠電泳遷移法可以特異性檢測GLF.

2.2實驗條件優(yōu)化

2.2.1Mg2+濃度優(yōu)化

研究表明，核酸適配體的分支點處未配對的核苷酸和二價金屬離子能通過促進兩個螺旋之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變來穩(wěn)定DNA三向接合結(jié)構(gòu)，且適當?shù)腗g²⁺濃度能使適配體的二級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定［23-25］.為提高凝膠電泳遷移法檢測GLF的性能，需要對GLF中Mg²⁺進行優(yōu)化.將單獨的核酸適配體與DNA-GLF復合物在0～4 mM濃度范圍的Mg²⁺下進行優(yōu)化，以獲得GLF檢測性能最佳的Mg²⁺濃度［26］.

電泳結(jié)果如圖2（a）所示.采集GLF-DNA序列復合物條帶的灰度值，比較不同濃度Mg²⁺下復合物灰度值與空白組差值（如圖2（b）所示）可知，當Mg²⁺的終濃度為1 mM時，測得的灰度值與空白組差值較大，說明此時Mg²⁺的濃度已經(jīng)對GLF-DNA序列起到穩(wěn)定作用，電泳效果較好，利于檢測.因此，將Mg²⁺終濃度為1 mM作為后續(xù)的實驗條件.

2.2.2孵育時間優(yōu)化

合適的孵育時間能夠保證核酸適配體與GLF的有效結(jié)合，提高結(jié)果的準確性.在一小時內(nèi)，隨著孵育時間增長，復合物條帶的灰度值如圖3（a）所示先增加后降低，結(jié)合不同孵育時間下復合物灰度值與空白組差值分析，可以看出孵育時間10 min時復合物的灰度值與空白組差值最大（如圖3（b）所示），說明此時羊乳鐵蛋白與核酸適配體充分結(jié)合，檢測效果最佳，結(jié)合乳鐵蛋白核酸適配體的最佳孵育溫度37 ℃［27］，將孵育時間10 min作為后續(xù)實驗條件.

2.2.3膠濃度優(yōu)化

瓊脂糖凝膠濃度大小影響復合物的分離效果，膠濃度不同時，GLF-DNA序列復合物的條帶分辨率與亮度存在差異，優(yōu)化膠濃度有利于實驗結(jié)果的準確性.

相同樣品和電流條件下，分別設置1%、2%、4%膠濃度進行GLF檢測，對電泳結(jié)果進行比較.采集復合物條帶的灰度值制作標準曲線計算線性回歸系數(shù)R²（如表1所示）.當膠濃度為1%時，復合物受到的阻礙作用較小，分離效果差，當膠濃度為2%和4%時，R²接近1，線性關(guān)系良好，復合物條帶清晰、明亮，有利于灰度值采集.對羊奶粉中GLF檢測，當膠濃度為4%時加標回收率為106.7%.原因可能是瓊脂糖凝膠濃度越高，孔徑越小，能夠更好的消除掉實際樣品中其它結(jié)構(gòu)復雜的大分子物質(zhì)影響，如乳鐵蛋白與酪蛋白膠體、乳球蛋白形成的復合物等［28］.因此，選擇4%膠濃度更適用實際樣品中GLF的定性定量分析.

2.3實驗方法靈敏度驗證

為將所建立的凝膠電泳遷移技術(shù)用于實際樣品中的GLF檢測，條件優(yōu)化后，在相同濃度的核酸適配體中加入梯度設置GLF濃度進行靈敏度驗證，其結(jié)果如圖4所示.由圖4（a）可知，隨著乳鐵蛋白濃度增加，復合物條帶的灰度值增加，下方游離適配體條帶的灰度值降低.采集復合物條帶的灰度值經(jīng)計算與GLF濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系y=69.4+0.041x，線性回歸系數(shù)R²=0.989 6，實驗的靈敏度較高，可以根據(jù)GLF濃度依賴GLF-DNA序列條帶的灰度值改變對GLF進行定性定量檢測（如圖4（b）所示）.

2.4實際樣品檢測

將所建立的乳鐵蛋白含量檢測方法應用于羊奶粉和鮮羊奶中，其檢測結(jié)果如圖5及表2所示.采集鮮羊奶電泳結(jié)果（如圖5（a）所示）中不同濃度GLF-DNA序列復合物的灰度值制作標準曲線，標準曲線方程為y=25.916 6+0.118 81x，線性回歸系數(shù)R²=0.974 7，對實際樣品加標后得出回收率92.6%，具有較好的靈敏度和準確性.鮮羊奶檢測出乳鐵蛋白含量為0.13 mg/mL，與報道的0.08～0.15 mg/mL相符［16］.對羊奶粉進行同樣的處理（如圖5（b）所示），得到標準曲線方程為y=39.392+0.139 6x，線性回歸系數(shù)R²=0.974 7，加標回收率分別為93.1%和91.9%.表明本研究建立的凝膠電泳遷移技術(shù)可以實現(xiàn)乳及乳制品中羊乳鐵蛋白的定性定量檢測.

3結(jié)論

本研究利用凝膠電泳遷移技術(shù)建立了一種乳及乳制品中GLF含量的檢測方法.該方法利用GLF與核酸適配體形成復合物，通過瓊脂糖凝膠電泳，優(yōu)化實驗條件后采集復合物條帶的灰度值，依據(jù)灰度值與乳鐵蛋白含量的線性關(guān)系，實現(xiàn)乳制品中GLF定量檢測.該方法特異性強，靈敏度高，樣品僅需要進行簡單的稀釋、離心處理，可以為乳及乳制品中羊乳鐵蛋白的檢測提供參考及特色乳的生產(chǎn)加工工藝控制提供技術(shù)支持.

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【責任編輯：陳佳】