王?，? 陳小海 鐘燁儀 龔舉武 劉平 Chin Yaoxian 王沛政 袁有祿

摘要：【目的】通過分析棉花枯萎病菌的遺傳多樣性，探究新疆棉花枯萎病菌株的分群及其演化。【方法】2022年在新疆不同植棉區(qū)共分離出22株棉花枯萎病菌株，對延伸因子1α（elongation factor-1α， EF-1α）和β微管蛋白基因進行擴增、測序，并從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）數(shù)據(jù)庫獲取36個棉花枯萎病菌株的相關基因序列信息?；谏鲜龌蛐蛄蟹謩e進行系統(tǒng)進化分析和單倍型分析?！窘Y果】基于57條EF-1α基因序列的進化樹分析表明，棉花枯萎病菌可分為3大群，第1大群包含來自新疆、河北和澳大利亞的共31個枯萎病菌株，該大群可分成4個亞群；第2大群包含25個枯萎病菌株，構成比較復雜，可分成3個亞群；第3大群僅包含美國菌株LA140?；?8條β微管蛋白基因序列的進化樹分析表明，本次分離的新疆棉花枯萎病菌株與棉花枯萎病菌7號和8號生理小種不同。根據(jù)EF-1α基因序列構建的單倍型網(wǎng)絡將棉花枯萎病菌株分為19個單倍型，新疆21個棉花枯萎病菌株歸屬于有共同起源的5種單倍型?！窘Y論】本研究分離的新疆棉花枯萎病菌株與已報道的棉花枯萎病菌1～8號生理小種均不相同，但與河北菌株的親緣關系較近。EF-1α單倍型分析表明，本研究中的所有棉花枯萎病菌均從1號生理小種演化而來。

關鍵詞：棉花；枯萎病菌；單倍型分析；遺傳多樣性分析；延伸因子1α；β微管蛋白

Genetic diversity and haplotype analysis of cotton Fusarium wilt based on gene sequences of EF-1α and β-tubulin

Wang Haiying1， 2， Chen Xiaohai2， 3， Zhong Yeyi2， 3， Gong Juwu1， Liu Ping1， Chin Yaoxian2， 3， Wang Peizheng2， 3*， Yuan Youlu1

（1. Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Laboratory of Cotton Bio-breeding and Integrated Utilization， Anyang， Henan 455000， China; 2. Key Laboratory for Coastal Marine Eco-environment Process and Carbon Sink of Hainan Province， Hainan Tropical Ocean University， Sanya， Hainan 572022， China; 3. Yazhou Bay Innovation Institute， Hainan Tropical Ocean University， Sanya， Hainan 572022， China）

Abstract： [Objective]? This research aims to characterize the grouping and evolution of cotton Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum （FOV） strains in Xinjiang on the basis of genetic diversity analysis. [Method] A total of twenty-two FOV strains from different cotton planting areas in Xinjiang were isolated in 2022， and EF-1α and β-tubulin gene were amplified and sequenced. Sequences of other thirty-six cotton FOV strains were downloaded from National Center for Biotechnology Information （NCBI）. Phylogenetic analysis and haplotype analysis were carried out based on the above-mentioned sequences. [Result] Phylogenetic tree analysis based on fifty-seven EF-1α gene sequences indicated that FOV strains can be divided into three groups. The first group included 31 FOV strains from Xinjiang， Hebei province and Australia. This group can be further divided into four subgroups. The second group， including 25 FOV strains and relatively complex composition， can be divided into three subgroups. The last group only included LA140 from America. Phylogenetic tree analysis based on twenty-eight β-tubulin gene sequences showed that FOV strains from Xinjiang are different from the race 7 and race 8. All strains were divided into nineteen haplotypes by haplotype network analysis based on EF-1α sequences. Twenty-one FOV strains isolated from Xinjiang belongs to five haplotypes， which share a common origin. [Conclusion] The strains isolated from Xinjiang in this research are different from the reported race 1 to race 8， but share a relatively close relationship with FOV in Hebei province. Haplotype analysis of EF-1α indicates all FOV strains in this research are evolved from race 1.

Keywords： cotton; Fusarium wilt; haplotype analysis; genetic diversity analysis; EF-1α; β-tubulin

棉花枯萎病是1種危害性極大的世界性土傳病害。棉花枯萎病的致病真菌是尖孢鐮刀菌萎蔫專化型（Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum），受其侵染的棉花莖稈維管束壞死，進一步導致棉株萎蔫甚至枯死。棉花枯萎病的普遍發(fā)生和擴展，已對棉花生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展構成了嚴重威脅，并且給植棉區(qū)造成巨大的經(jīng)濟損失。棉花枯萎病菌毒力強、分布廣、危害嚴重，但其內部菌系也存在明顯的致病性分化。了解棉花枯萎病菌的分類、起源進化等，可對該病原菌今后的進化趨勢做出預測，為棉花枯萎病抗病育種和綜合防治提供理論依據(jù)。

自20世紀60年代以來，國內外學者對棉花枯萎病菌的生理生化特性開展了大量研究。研究人員借助海島棉（Gossypium barbadense）、陸地棉（G. hirsutum）、亞洲棉（G. arboreum）、煙草（Nicotiana tabacum）等鑒別寄主，將棉花枯萎病菌分為8個生理小種[1-3]。棉花枯萎病菌1號、2號、3號、4號和8號生理小種在美國有分布[4-5]。Bridge等[6]發(fā)現(xiàn)棉花枯萎病菌1號和2號生理小種主要分布在美國和坦桑尼亞，且這2個生理小種的致病性較強。Davis等[7]研究發(fā)現(xiàn)棉花枯萎病菌3號生理小種分布在埃及、以色列、蘇丹和中國。4號生理小種最初在印度被發(fā)現(xiàn)，并且很快成為美國加利福尼亞州棉花枯萎病的優(yōu)勢生理小種[3]。5號生理小種最先在蘇丹被發(fā)現(xiàn)，并根據(jù)分子分類方法和致病性測試將3號和5號小種歸為同一生理小種。6號生理小種分布在巴西和巴拉圭。7號生理小種主要分布在中國[8]。研究人員通過分子標記等技術，將4號和7號小種歸為同一生理小種[9]。專家學者借助人工接種鑒別寄主的方法，發(fā)現(xiàn)我國存在棉花枯萎病菌3號、7號和8號生理小種，其中7號生理小種為優(yōu)勢生理小種，而3號和8號生理小種少量分布于內地[1]。

依據(jù)病原菌的遺傳多樣性和遺傳距離研究可以初步判斷其所屬的生理小種類型，并為植物病害防控策略及育種計劃的制定提供有效參考，國內外學者在這方面已開展了大量研究。Abd-Elsalam等[10]利用隨機擴增多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA， RAPD）和擴增片段長度多態(tài)性（amplification fragment length polymorphisms， AFLP）標記，以棉花枯萎病菌1號、2號、3號、4號和5號生理小種等為參考菌株，對來自埃及的棉花枯萎病菌進行了研究，結果表明埃及棉花的枯萎病菌可能為3號生理小種，且與5號生理小種親緣關系較近，而與1號生理小種親緣關系較遠。Assigbetse等[11]利用RAPD分子標記技術將棉花枯萎病菌分為3個群，其中1號、2號和6號生理小種屬于1群，4號生理小種屬于2群，3號和5號生理小種屬于3群。Cianchetta等[12]利用翻譯延伸因子（elongation factor-1α， EF-1α）基因的部分序列有效鑒定了棉花枯萎病菌1號、2號、3號、4號和8號生理小種，推測棉花枯萎病菌可能有2個起源群。田新莉等[13]利用RAPD標記將新疆棉花枯萎病菌的32個代表菌株劃分為5個群，認為新疆棉花枯萎病菌群體以7號生理小種為主。白劍宇[14]通過營養(yǎng)親和群和指紋圖譜擴增技術，將新疆棉花枯萎病菌劃分為3個類群，第1類群包括7號生理小種及其親和菌株，是新疆的優(yōu)勢生理小種，但不包括3號、8號生理小種；第2和第3類群與3號、7號、8號生理小種均不親和。陳文霞[15]利用AFLP分子標記將新疆棉花枯萎病菌劃分為分別以3號、7號、8號等生理小種為代表的3個群，并認為新疆棉花枯萎病菌的遺傳變異不大。Guo等[16]利用AFLP標記研究發(fā)現(xiàn)我國棉花枯萎病菌以7號生理小種為主，還發(fā)現(xiàn)了不同于3號、7號、8號等生理小種的新生理型菌株。郭慶港等[8]利用EF-1α基因序列將河北省主要植棉區(qū)的77株枯萎病菌分為5個大群，這5個群來自2個起源，與澳大利亞生理型菌株具有較近的親緣關系。盡管與尖孢鐮刀菌種內遺傳多態(tài)性相關的研究報道較多，但目前對尖孢鐮刀菌生理小種的起源與進化仍然知之甚少。

研究者多利用持家基因序列，如EF-1α和β-微管蛋白（β-tubulin），對棉花枯萎病菌等植物病原菌的遺傳多樣性進行分析[17]。EF-1α普遍參與核糖體蛋白的翻譯，在種內具有較高的保守性，其基因序列被廣泛應用于真菌物種的鑒定分析，且相關序列信息查詢方便，易于不同研究結果間的相互比較[12]。β-tubulin是細胞內的一種骨架蛋白，是微管結構最主要的組成成分之一，在真核生物中具有高度保守性，參與維持細胞形態(tài)和有絲分裂等[18]。

單倍體基因型（單倍型）是指共存與單條染色體上的一系列遺傳變異位點的組合。由多個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）突變構成的1種突變譜可被稱為1種單倍型。單倍型分析技術是尋找單條染色體上雜合SNP變異位點的有效方法[19]。在群體遺傳學上可用于分析等位基因的變異，追蹤個體間的親緣關系，了解生物的進化歷史等[20-21]。單倍型分析技術近年來也不斷向菌物學方向滲透。李楊等[22]通過單倍型分析技術揭示油茶炭疽病原菌暹羅刺盤孢菌（Colletotrichum siamense）具有豐富的遺傳多樣性，為油茶炭疽病害的防治提供了可靠依據(jù)。夏塊菌（Tuber aestivum）是1種可食用的子實體，在全球廣受歡迎，Riccioni等[23]通過構建單倍型網(wǎng)格分析對夏塊菌的多樣性保護提出了針對性意見。

目前為止，關于利用基因序列分析新疆棉花枯萎病菌的遺傳多樣性和起源進化的研究鮮有報道。本研究通過對2022年新疆不同植棉區(qū)棉花枯萎病菌菌株的分離、EF-1α和β-tubulin基因擴增和測序，并在此基礎上進行棉花枯萎病菌的遺傳多樣性和單倍型分析，從而初步判斷供試菌株的遺傳分群和演化等，為今后新疆植棉區(qū)棉花枯萎病菌的分類、起源進化研究和綜合防控等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2022年3月對呈現(xiàn)棉花枯萎病癥狀的莖稈進行棉花枯萎病菌的分離、單孢純化。具體方法為：將莖稈剪成長度為1 cm的小段，剝下表皮，用酒精消毒后放入超凈臺中0.1%的升汞水溶液中殺菌30 s，無菌水清洗3次后接入察氏培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)3～4 d即可長出大量白色菌絲。采用平板劃線法進行枯萎病菌單孢分離純化，獲得新疆棉花枯萎病菌菌株。

莖稈材料來源如下：新疆博樂市達鎮(zhèn)紅坡4隊（以下簡稱達鎮(zhèn)）2株（DAZHEN 6和DAZHEN 20）；新疆生產(chǎn)建設兵團第八師一四九團十三連（以下簡稱13連）6株（13LIAN 8、13LIAN C1、13LIAN X11、13LIAN X30、13LIAN X31和13LIAN C17）；新疆生產(chǎn)建設兵團第六師芳草湖農場三場（以下簡稱三場）1株（SANCHANG C21）；新疆生產(chǎn)建設兵團第七師125團1連（以下簡稱奎屯）1株（KUITUN C23）；三亞師部農場新疆南繁基地（以下簡稱師部）12株（SHIBU C2、SHIBU C3、SHIBU C4、SHIBU X12、SHIBU X13、SHIBU X14、SHIBU W2、SHIBU W3、SHIBU W4、SHUBU W6、SHIBU W9和SHIBU V2）。

另外36個棉花枯萎病菌株的基本信息和EF-1α、β-tubulin基因參考序列通過美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）數(shù)據(jù)庫查詢并下載（表1）。

1.2 EF-1α和β-tubulin基因序列擴增

首先將分離純化的枯萎病菌株加入到含有100 mL察氏液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于搖床（25 ℃，180 r·min－1）中振蕩培養(yǎng)5 d，吸取1.5 mL菌液放入無菌的1.5 mL離心管中，10 000 r·min－1離心30 s，盡可能吸干凈上清液，收集菌體。采用植物基因組DNA提取試劑盒（通用型，廣州擎科生物技術有限公司）提取菌體DNA，菌體DNA提取的詳細操作步驟參見試劑盒說明書。DNA提取完成后，使用NanoGenius超微量光度計（上海美譜達儀器有限公司）檢測DNA原液的濃度。

擴增EF-1α和β-tubulin基因序列的引物序列如下。EF-F：5'-CACCTTAACGTCGTCGTCATC-3'，EF-R：5'-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3'；β-tubulin-F：5'-CGTCTAGAGGTACCCATACCG-GCA-3'，β-tubulin-R：5'-GCTCTAGACTGCTTT-CTGGCAGACC-3'[24]。PCR擴增試劑盒購自廣州擎科生物技術有限公司。PCR反應體系：模板 DNA（20～80 ng·μL－1）2.0 μL，2×PCR Mix 10.0 μL，上下游引物（10 μmol·L－1）各1.0 μL，滅菌超純水6.0 μL。PCR反應程序如下：97 ℃ 1 min；96 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，37個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物送往廣州擎科生物技術有限公司進行測序。

1.3 棉花枯萎病菌遺傳多樣性和單倍型分析

利用MEGA 7軟件選擇鄰近法（neighborjoining， NJ）分別構建基于EF-1α和β-tubulin基因序列的系統(tǒng)進化樹，自展值（Bootstrap值）設置為1 000。借助MEGA 7軟件進行序列比對，利用DnaSP v6軟件分析基因序列的多態(tài)性，獲得序列的保守位點數(shù)、變異位點數(shù)、單一變異位點數(shù)、單倍型個數(shù)、單倍型多態(tài)性、核苷酸多樣性等信息。使用Network軟件繪制單倍型網(wǎng)絡圖。

2 結果與分析

2.1 棉花枯萎病菌遺傳多樣性分析

本研究中新疆棉花枯萎病菌22個供試菌株共來源于5處，其中4處在新疆（共10株），另1處為新疆北疆的繁育基地（海南三亞，共12株）。通過菌株的分離、鑒定和基因測序得到EF-1α基因的21條序列信息（其中SHIBU V2菌株未擴增出條帶），其余36條EF-1α基因序列通過文獻查找并從GenBank下載獲得?；谏鲜?7條EF-1α基因序列（長度為611 bp）構建系統(tǒng)進化樹，顯示各分支的遺傳變異程度。結果表明，棉花枯萎病菌株可分成3大群（圖1）。第1大群為來自新疆、河北和澳大利亞的枯萎病菌株，該群又可以分成4個亞群，第1亞群由來自新疆的21個枯萎病菌株構成，第2亞群由來自河北的4個枯萎病菌株構成，第3亞群由來自澳大利亞的5個枯萎病菌株構成，第4亞群包括來自河北的1個枯萎病菌株（HB8-2），這4個亞群的親緣關系較近。第2大群包含25個菌株，該大群又可以分成3個亞群，第1亞群主要包含棉花枯萎病菌3號生理小種（共4株），第2亞群包含1個菌株LA112，第3亞群（共20株）主要包括棉花枯萎病菌1號、2號、4號、6號、7號、8號生理小種和來自河北的棉花枯萎病菌株（HB180-2和HB120）等。第3大群只有1個來自美國的菌株LA140。根據(jù)本次對EF-1α基因序列的分析結果，新疆棉花枯萎病菌株和河北枯萎病菌株等在內的第1大群與其他2個大群的親緣關系較遠。本研究表明，基于EF-1α基因序列，新疆棉花枯萎病菌株與已報道的棉花枯萎病菌1～8號生理小種均存在差異。

基于β-tubulin基因序列構建的進化樹見圖2。該進化樹中共包含28條序列，其中5條序列（長度為370 bp）是本研究中從新疆菌株SHIBU W6、SHIBU W9、SHIBU X14、SHIBU V2、SHIBU W2中擴增測序所得（其他材料未擴增劑基因序列），另外23條序列是通過文獻查找不同來源的棉花枯萎病菌生理小種（菌株）[25]，并從GenBank下載獲得。結果表明，以上棉花枯萎病菌株可以分為3大群，第1大群（共17株）包括本研究中分離的新疆5個菌株和1號、2號、3號、4號、6號、8號生理小種以及來自澳大利亞的菌株；第2大群（共10株）包括來自河北（7株）、中國的3號與8號枯萎病菌生理小種（各1株）和來自澳大利亞的菌株（1株）；第3大群，僅1株，為中國的7號生理小種。

2.2 棉花枯萎病菌株EF-1α和β-tubulin基因的單倍型分析

基于上述棉花枯萎病菌EF-1α基因的57條序列和β-tubulin基因的28條序列進行了單倍型分析，結果（表2）表明棉花枯萎病菌EF-1α基因可分為19個單倍型，β-tubulin基因可分為9個單倍型，EF-1α基因的單倍型多態(tài)性較β-tubulin基因更高，但其核苷酸多樣性低于β-tubulin基因。

基于EF-1α基因序列構建的單倍型網(wǎng)絡圖見圖3，各單倍型對應的菌株信息見表3。EF-1α基因單倍型網(wǎng)絡圖表明，棉花枯萎病菌單倍型均由H8（1號生理小種）單倍型演化而來。以H8單倍型作為棉花枯萎病菌進化演化路線來看，共有5條演化路線。第1條演化路線包括單倍型H1～H5（本研究分離的新疆菌株）和H12（河北菌株）～H16（澳大利亞菌株）。第2條演化路線包括單倍型H6～H7（包含1號、2號、3號、4號、6號、7號和8號生理小種）和H9～H10（包含2號、3號、4號和8號生理小種、澳大利亞菌株和河北菌株）。其他3條演化路線包含的菌株數(shù)很少，分別為H11和H17、H18、H19單倍型。結果表明，根據(jù)EF-1α基因序列，新疆21個枯萎病菌株中有17個菌株屬于H1單倍型，其余4個菌株分別屬于H2～H5單倍型。其他多種類型的生理小種和部分澳大利亞枯萎病菌株屬于H6～H9單倍型。河北枯萎病菌株屬于H10～H12單倍型。其他部分澳大利亞枯萎病菌株屬于H15～H16單倍型。BBA65934菌株屬于H17單倍型。埃及枯萎病菌株FovE-1單獨屬于H18單倍型。BBA69711菌株屬于H19單倍型。

由于擴增出的β-tubulin基因序列與我國的3號和7號生理小種基因序列差異較大，所以在單倍型網(wǎng)絡構建過程中將 Race3 CN3 和Race7 CN7的β-tubulin基因序列刪去?；?6條β-tubulin基因序列構建的單倍型網(wǎng)絡圖見圖4，各單倍型對應的菌株信息見表4。結果表明，單倍型H7～H9分到1個類群，主要包括來自河北的菌株和1個8號生理小種菌株（Race8 CN8）及1個澳大利亞菌株（Aus Type ATCC96291）等。其余6個單倍型（H1～H6）歸為第2類群，以單倍型H1為核心分別演化出H2～H6等單倍型，其中單倍型H1主要包括本研究分離的5個新疆棉花枯萎病菌株和1個1號生理小種菌株（Race1 ATCC16421）。

3 討論

真核生物延伸因子EF-1α在蛋白質翻譯過程中發(fā)揮重要作用，由于在種內具有較高的保守性，被廣泛應用于真菌物種的鑒定分析[26]。本研究利用新疆不同植棉區(qū)的棉花枯萎病菌21條EF-1α基因序列和GeneBank數(shù)據(jù)庫中的36條EF-1α基因序列構建進化樹，將57個棉花枯萎病菌株分成3大群，其中新疆棉花枯萎病菌株與河北及澳大利亞的枯萎病菌株親緣關系較近，與其他報道的棉花枯萎病菌株親緣關系較遠，包括先前國內報道的棉花枯萎病菌7號和8號生理小種。這與郭慶港等[8]報道的河北省主要植棉區(qū)的枯萎病菌與澳大利亞生理型菌株具有較近的親緣關系，而與其他枯萎病菌株親緣關系較遠相符。但本研究發(fā)現(xiàn)新疆棉花枯萎病菌株與河北的枯萎病菌株存在差異，這與白劍宇[14]、陳文霞[15]報道的新疆棉花枯萎病菌以7號小種為優(yōu)勢生理小種的研究結果不同。本研究中分離的新疆棉花枯萎病菌株與河北菌株及澳大利亞菌株親緣關系較近，表明新疆棉花枯萎病菌的來源可能與早期新疆從國內其他省份頻繁引進棉花品種有關。本研究中基于57條EF-1α基因序列構建的進化樹將棉花枯萎病菌株分成3大群，與Assigbetse等[11]、白劍宇[14]、陳文霞[15]將棉花枯萎病菌分為3個群的結果類似，而與田新莉等[13]將新疆棉花枯萎病菌32個代表菌株劃分為5個群的結果不同。同時基于28條β-tubulin基因序列構建的進化樹也將棉花枯萎病菌株分為3大群。本研究將棉花枯萎病菌3號和5號生理小種歸為同一生理型，與Skovgaard等[9]的研究報道相同。

基于棉花枯萎病菌株57條EF-1α基因序列進行的單倍型分析表明，棉花枯萎病菌共分為19個單倍型。新疆棉花枯萎病菌株屬于單倍型H1～H5。本研究中所有棉花枯萎病菌的單倍型均由H8單倍型（枯萎病菌1號生理小種）演化而來?；诿藁菸【?8條β-tubulin基因序列進行的單倍型分析表明，棉花枯萎病菌可分為9種單倍型。以單倍型H1為核心分別演化出H2～H6等單倍型，其中單倍型H1主要包括本研究分離的新疆棉花枯萎病菌株和枯萎病菌1號生理小種。以上結果也表明棉花枯萎病菌單倍型可能最早也由棉花枯萎病菌1號生理小種演化而來，這與棉花枯萎病菌1號生理小種最早在美國被發(fā)現(xiàn)，并在美國植棉區(qū)廣泛分布的報道相吻合[27]。而Skovgaard等[9]利用分子系統(tǒng)學研究表明棉花8個枯萎病菌生理小種至少有2個獨立的進化起源；郭慶港等[8]和Cianchetta等[12]認為棉花枯萎病菌可能來自2個起源群。

4 結論

基于棉花枯萎病菌EF-1α基因序列的遺傳多樣性，將棉花枯萎病菌株分成3大群。第1大群包含本次分離出、來自河北和澳大利亞的共31個菌株；第2大群包含25個菌株，可以分成4個亞群；第3大群僅有來自美國的菌株LA140。第1大群與其他2大群的親緣關系較遠，表明本次分離出的新疆棉花枯萎病菌與已報道的棉花枯萎病菌1～8號生理小種均不相同，但與河北分離的枯萎病菌親緣關系較近。β-tubulin基因進化樹分析也表明本次分離的新疆棉花枯萎病菌株與7號和8號生理小種不同?；贓F-1α基因序列構建的單倍型網(wǎng)絡將棉花枯萎病菌株分為19個單倍型，新疆21個棉花枯萎病菌株有共同的起源，屬于H1～H5單倍型，本研究中的所有棉花枯萎病菌均由1號生理小種演化而來。

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