王麗敏 周帥

摘要：[目的]探究遼東櫟幼樹葉片的光合系統(tǒng)對土壤漸進(jìn)式干旱的響應(yīng)，并篩選干旱敏感性指標(biāo)。[方法]采用盆栽漸進(jìn)式干旱脅迫法，對2年生遼東櫟幼苗葉片的葉傾角、葉綠素?zé)晒?、光合作用等指?biāo)進(jìn)行方差分析（ANOVA）和LOESS非線性擬合。[結(jié)果]漸進(jìn)式干旱對光合氣體交換的影響最顯著，其次是葉傾角，最后是光系統(tǒng)II（PSII）的電子傳遞和能量耗散。依據(jù)土壤相對含水量（SRWC）對光合特性的影響，遼東櫟幼樹光合系統(tǒng)的干旱響應(yīng)可劃分為4個階段：第1階段（脅迫未發(fā)生，26%>SRWC>20%），光合氣體交換參數(shù)無下降；第2階段（中度脅迫，20%>SRWC>14%），氣孔限制效應(yīng)明顯，葉傾角降低至-14.0±1.7°；第3階段（重度脅迫，14%>SRWC>8%），葉片水分利用效率（WUE）顯著下降，葉傾角值降低至-43.2±10.3°，光合氣體交換明顯減少，表明SRWC降低至14%是遼東櫟幼樹的灌溉臨界值；第4階段（極度脅迫，SRWC<8%），PSII的電子傳遞和能量耗散顯著改變，光合機(jī)構(gòu)嚴(yán)重受損，葉傾角值降低至-68.5±6.7°，表明SRWC降低至8%是遼東櫟幼樹葉片的致死臨界值。基于葉傾角對土壤干旱的響應(yīng)存在階段性差異，其可作為遼東櫟幼樹灌溉臨界值的預(yù)警指標(biāo)；PSⅡ單位面積有活性反應(yīng)中心數(shù)量RCo/CS、單位反應(yīng)中心吸收的能量ABS/RC、單位反應(yīng)中心以熱能形式耗散的能量Dlo/RC、葉片性能指數(shù)PlABS可作為葉片致死的預(yù)警指標(biāo)。[結(jié)論]本研究觀察到遼東櫟幼樹葉片光合系統(tǒng)對土壤干旱的響應(yīng)存在階段性差異，據(jù)此確定了灌溉臨界值和反映土壤干旱的敏感性指標(biāo)，可以為遼東櫟幼樹高效灌溉策略的制定提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：干旱；遼東櫟；土壤相對含水量；光合作用；葉綠素?zé)晒猓蝗~傾角

中圖分類號：Q945.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）03-0149-09

氣候變化導(dǎo)致全球水分循環(huán)的改變，重塑了大部分地區(qū)的土壤-植被-大氣連續(xù)體，增加了干旱發(fā)生的頻率和持續(xù)時間。目前，干旱已成為多數(shù)地區(qū)植物主要遭受的環(huán)境脅迫，而研究干旱對植物的作用機(jī)理，制定高效節(jié)水的灌溉策略成為當(dāng)前人們的重要議題。

遼東櫟（Quercus Iiaotungensis Koidz.）是我國華北中低山地帶針闊葉混交林的建群樹種。隨著氣候變化加劇，土壤干旱成為遼東櫟，尤其是遼東櫟幼樹生長的主要限制因素之一。光合作用對干旱脅迫有明顯的響應(yīng)，其可以引發(fā)氣孔限制（SL）或非氣孔限制（NSL），亦或使2種限制的疊加出現(xiàn)，植物表現(xiàn)出多種干旱響應(yīng)，例如：在光合系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)方面，氣孔、葉片表型特征及葉綠體等超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；在光合系統(tǒng)與環(huán)境的物質(zhì)交換方面，氣體交換參數(shù)和葉片含水量發(fā)生變化；在光合系統(tǒng)的能量流動方面，用于抗氧化防御和非光化學(xué)猝滅的能量改變，光能利用效率隨之變動。目前，干旱脅迫對遼東櫟幼樹的表型生理特性、葉片氣體交換、水分利用效率、木質(zhì)部液流的影響已有研究報道，但對光合系統(tǒng)的影響機(jī)制仍然不清晰。

由于植物光合系統(tǒng)各組分對土壤干旱的敏感性不同，可以利用敏感性指標(biāo)判斷干旱程度。目前已有通過監(jiān)測植物水勢、葉綠素含量、葉片反射光譜，葉片顏色信息、葉溫、葉傾角和葉片葉綠素?zé)晒馀袛喔珊得{迫程度的研究?，F(xiàn)有研究證實，葉傾角、葉片葉綠素?zé)晒夂凸夂蠚怏w交換參數(shù)均與植株含水量關(guān)聯(lián)密切，但干旱脅迫下葉傾角與光合系統(tǒng)各組分之間的關(guān)聯(lián)尚不清晰。鑒于此，本研究采用盆栽漸進(jìn)式干旱脅迫法，以2年生遼東櫟幼樹為試材，研究干旱脅迫對遼東櫟光合作用的結(jié)構(gòu)、物質(zhì)交換、能量流動等方面的影響機(jī)制，篩選干旱敏感性指標(biāo)，為遼東櫟高效灌溉提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

遼東櫟種子于2018年采自山西省臨汾市三交村（35°57′53.64″N，112°4′35.76″E，海拔1 197m），在山西省林業(yè)科學(xué)與草原研究院陽曲試驗基地（38.0981°N，112.7346°E，海拔961 m）進(jìn)行播種和培育。播種容器高25 cm、上徑36 cm、下徑31 cm，容積26.6 L，pH 6.5～7.0。培養(yǎng)土為壤土，水分特征按照《森林土壤水分-物理性質(zhì)的測定》（LY/T1215-1999）測定并計算，毛管孔隙度45.7%±8.4%，非毛管孔隙度4.8%±1.4%，總孔隙度50.5%±7.1%，土壤飽和含水量29.9%±3.7%。2021年1月選擇15株生長狀況良好、長勢一致（苗高20±5 cm，地徑4 0±0.5 mm）的幼樹，帶盆轉(zhuǎn)移到人工氣候室[光照強(qiáng)度350umol·m-2·s-1，光照時間10 h·d-1，晝夜環(huán)境溫度（ 28±2）℃/（22±2）℃，空氣濕度（50±10）%]，進(jìn)行1個月的環(huán)境適應(yīng)，期間采用與田間培養(yǎng)時相同的除草和澆水等管理措施。

1.2試驗設(shè)計

試驗在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，環(huán)境參數(shù)不變。采用盆栽漸進(jìn)式干旱脅迫法進(jìn)行干旱處理，即試驗開始前48 h，將15株遼東櫟幼樹充分灌水，達(dá)到土壤最大持水量，然后停止?jié)菜?，進(jìn)行自然干旱處理。隨機(jī)選取5株幼樹，在試驗期間每2h利用與電腦相連的土壤濕度傳感器（ST-TR-EC，Sciento，中國）自動記錄1次土壤相對含水率（SRWC）。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，當(dāng)平均SRWC低于5%時，葉片永久萎蔫，此時試驗停止（圖1）。

1.3指標(biāo)測定

1.3.1葉傾角測定 試驗期間，在每株上的半木質(zhì)化枝上選擇1片成熟、完整、無遮擋的葉片，于每日10：00，采用數(shù)碼相機(jī)（H805，F(xiàn)orsafe，中國）在固定位置、鏡頭高度與葉柄基部相同的角度拍照。試驗期間保持拍照植株的位置和角度不變動。獲得的圖像采用ImageJ 1.53e（National Institutes of Health，美國）測量葉傾角，共計30個重復(fù)。測量步驟如下（圖2）：

（1）在試驗開始時的照片中，將通過葉柄基部的水平線確定為基線；

（2）在其余照片中，測量葉柄基部至葉尖的連線與基線之間的夾角，即葉傾角；

當(dāng)葉柄基部至葉尖的連線位于基線上部時，葉傾角定義為正值；位于基線下部時，葉傾角定義為負(fù)值。

1.3.2葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)測定 每日9：00開始測定快速葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)，每株選取1片成熟、完整、無遮擋的葉片，暗適應(yīng)15 min，使用Mini調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x（FluorPen FP110.Photon Systems Instruments，捷克）測量葉肉部分。測量脈沖光強(qiáng)度900 umol·m-2·S-1（持續(xù)30 us），飽和光強(qiáng)度2 000Umol·m-2·s-1，光化光強(qiáng)度300umol·m-2·s-1。根據(jù)獲取的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線計算：暗適應(yīng)后照光150 us和300 us時的相對熒光強(qiáng)度VL和VK、光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）單位面積有活性反應(yīng)中心數(shù)量RCo/CS、單位反應(yīng)中心吸收的能量ABS/RC、單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量TRo/RC，單位反應(yīng)中心用于將電子從Q-A傳遞到PQ的能量ETo/RC、單位反應(yīng)中心用于將電子從Q-A傳遞到PSI的能量REo/RC、單位反應(yīng)中心以熱能形式耗散的能量Dlo/RC、葉片性能指數(shù)PIABS。計算方法參考文獻(xiàn)。

快速葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)測定完成后，選取同一葉片繼續(xù)黑暗適應(yīng)15 min后，采用前述Mini調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x，變更測量位置，測定葉肉部分的穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒猓瑑x器參數(shù)設(shè)置不變。按照儀器內(nèi)置的NPQ2程序（光周期200 s，每隔20 s測量1次，共10次；暗周期390 3，每隔60 s測量1次，共7次）自動計算出最大量子產(chǎn)額QYmax和非光化學(xué)猝滅系數(shù)NPQ。

1.3.3氣體交換指標(biāo)測定 葉綠素?zé)晒鉁y定后，在同一葉片采用光合儀（LCpro-T，ADC，英國）測定氣體交換參數(shù)。儀器參數(shù)為：白色光源，光強(qiáng)300 umol·m-2·s-1，開放氣路，空氣流速200umol·s-1，環(huán)境CO2濃度443±12 umol·mol-1，葉片溫度25±0.2℃。測量開始后，每隔30 s記錄1次數(shù)據(jù)，將20 min內(nèi)的最大值記為光合速率Pn、蒸騰速率E、氣孔導(dǎo)度9s和胞間CO2濃度Ci。水分利用效率WUE南Pn與E的比值計算得出。

1.4數(shù)據(jù)處理

依據(jù)各項指標(biāo)測定時的SRWC，將數(shù)據(jù)分為8個分組：

SRWC≥24.5%（標(biāo)記為SRWC-26%），

24.5%>SRWC≥21.5%（標(biāo)記為SRWC-23%）.

21.5%>SRWC≥18.5%（標(biāo)記為SRWC-20%）.

18.5%>SRWC≥15.5%（標(biāo)記為SRWC-17%）.

15.5%>SRWC≥12.5%（標(biāo)記為SRWC-14%）.

12.5%>SRWC≥9.5%（標(biāo)記為SRWC-11%）.

9.5%>SRWC≥6.5%（標(biāo)記為SRWC-8%）.

SRWC<6.5%（標(biāo)記為SRWC-5%）。

采用方差分析和數(shù)據(jù)平滑統(tǒng)計指標(biāo)間的差異和變化趨勢，數(shù)據(jù)平滑方式為LOESS，平滑閾值0.7。以SRWC 26%分組作為對照（CK）。使用R語言4.0.2（R Core Team，2020）和Origin（Origin Lab Corporation，2019）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。數(shù)據(jù)分析前利用R語言的MASS和car程序包對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，必要時進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以滿足數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性要求，對不滿足方差齊性的指標(biāo)采用R語言的userfriendlyscience程序包進(jìn)行Games-Howell方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1漸進(jìn)式干旱對葉傾角的影響

隨著SRWC下降，葉傾角逐漸減小（R2=0.97，P<0.001）。當(dāng)SRWC下降至17%時，葉傾角與對照相比顯著減?。◤?.2°±0.4°降低至-8.4°±0.7°），當(dāng)SRWC降至5%時，葉傾角達(dá)到最小值（-68.5°±6.7°）（P<0.01）（見圖3）。

2.2漸進(jìn)式干旱對葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的影響

隨著SRWC下降，VK、VL、ABS/RC、Dlo/RC和TRo/RC均呈增加趨勢，其中ABS/RC在SRWC-5%時顯著增加到CK的116.7%，表明隨著干旱程度加劇，放氧復(fù)合體和PSII反應(yīng)中心內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移逐漸受到干擾，PSII單位面積反應(yīng)中心吸收、耗散和捕獲的光能逐漸增加。RC/CSo、ETo/RC、REo/RC和PIABS均隨SRWC下降而下降，當(dāng)SRWC為5%時，RC/CSo和PlASS較CK分別顯著減少了20.2%和36.6%，穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)QYmax隨著SRWC降低而上升，而NPQ隨之先增后降，均與CK無顯著差異（圖4）。

2.3漸進(jìn)式干旱對氣體交換參數(shù)的影響

隨著SRWC降低，Pn、E、9s和Ci先升高，后逐漸降低。E和g。在SRWC-23%時分別升高至CK的134.6% （P<0.01）和138.6%（P<0.05）。g。從SRWC-14%開始顯著降低，Pn、E和Ci從SRWC-11%時開始顯著降低。WUE隨SRWC降低而減少，SRWC-8%時極顯著降低至CK的15.0%（圖5）。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)漸進(jìn)式干旱過程中，葉傾角在SRWC為17%時顯著減小，至5%達(dá)到最小值；葉綠素?zé)晒鈪?shù)中PSII有活性的反應(yīng)中心數(shù)量、PSII與PSI之間的能量傳遞和PSII光化學(xué)活性逐漸下降，但最大量子產(chǎn)額與非光化學(xué)猝滅所受影響較小；氣體交換參數(shù)在SRWC低于20%時開始受到影響，低于11%時影響顯著。

3.1遼東櫟幼樹葉片光合系統(tǒng)的干旱響應(yīng)

將不同土壤含水量對應(yīng)的光合作用參數(shù)進(jìn)行[0，1]標(biāo)準(zhǔn)化（圖6），從光合機(jī)構(gòu)的結(jié)構(gòu)變化、物質(zhì)交換、能量流動3方面分析遼東櫟幼樹葉片光合系統(tǒng)對干旱的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其存在明顯的4個階段：第1階段（26%>SRWC>20%），無脅迫發(fā)生，A、E、Ci、g。持續(xù)上升；第2階段（20%>SRWC>14%），中度干旱脅迫，A、E、Ci、g。持續(xù)下降，WUE基本保持穩(wěn)定；第3階段（14%>SRWC>8%），重度干旱脅迫，WUE、PIA8S、REo/RC開始大幅度下降。第4階段（SRWC<8%），極度干旱脅迫，A、E、Ci、9s趨近于0。其響應(yīng)機(jī)制如下所述。

通常認(rèn)為，干旱脅迫會影響氣孔開放程度、氣體交換和PSII運行效率。無干旱脅迫時，SRWC下降導(dǎo)致了遼東櫟幼樹氣孔導(dǎo)度（9s）和PSII光化學(xué)活性（PIABS）上升，葉傾角和PSII單位面積有活性反應(yīng)中心數(shù)量（RC/CSo）略有升高，雖然PSII單位面積反應(yīng)中心吸收（ABS/RC）和耗散的光能（Dlo/RC）下降，但葉片光合能力仍然維持較高水平，表明此階段尚未發(fā)生干旱脅迫。此階段還觀察到，單位反應(yīng)中心用于將電子從Q-A傳遞到PSI的能量（REo/RC）下降。已有研究表明，干旱脅迫會導(dǎo)致PSI受體側(cè)的電子傳遞和量子產(chǎn)額下降。鑒于此，REo/RC降低可能源于該參數(shù)對土壤含水量降低相對敏感。當(dāng)感應(yīng)到土壤含水量下降后，PSII立即通過降低向PSI傳輸?shù)碾娮有?，以避免未及時固定的電子與氧分子結(jié)合形成活性氧（ROS）。

中度干旱脅迫時，遼東櫟幼樹關(guān)閉的氣孔增多，但光合機(jī)構(gòu)的能量流動未受明顯影響，僅阻礙了CO2（Pn和Ci）和水（E）的物質(zhì)交換，因此WUE仍維持較高水平。這一階段的典型表現(xiàn)是9s顯著下降和PSII的正常運轉(zhuǎn)，這可能因為氣孔限制被啟動的SRWC閾值較非氣孔限制高。該現(xiàn)象印證了前人關(guān)于氣孔導(dǎo)度對干旱發(fā)生的敏感程度比葉綠素?zé)晒鈪?shù)高的論斷。此階段還觀察到WUE逐漸增加，類似現(xiàn)象已有報道，可能由于作為一種相對溫和的干旱脅迫反應(yīng)，自然狀態(tài)下會頻繁發(fā)生氣孔關(guān)閉，WUE對此已經(jīng)脫敏。為了確保有充足的電子在PSII和PSI之間傳遞能量，所以WUE不降反增。

重度干旱脅迫時，盡管PSII的能量吸收（ABS/RC）和熱耗散（Dlo/RC）開始增加，但在能量傳輸方面，PSII光化學(xué)活性（PIABS）及傳遞到PSI受體側(cè)的能量（REo/RC）開始下降；在物質(zhì)交換方面，水和CO2的流通進(jìn)一步受到抑制；在結(jié)構(gòu)方面，RC/CSo、葉傾角、9s急劇減少。這一階段主要的變化是光合機(jī)構(gòu)結(jié)構(gòu)和能量流通的改變，源于非氣孔降低了植物的光合能力。具體而言：首先，葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化明顯，表明PSII結(jié)構(gòu)遭到破壞，因為重度干旱導(dǎo)致PSII捕獲的光能與CO2還原利用的光能失衡，多余的電子與氧分子結(jié)合形成ROS，極易造成類囊體膜上的蛋白復(fù)合物受損；其次，WUE開始下降，這一現(xiàn)象可能與抗旱能力的種間差異有關(guān)；第三，葉片萎蔫逐漸加速，主要由于水份缺乏致使細(xì)胞膨脹壓力下降。

極度干旱脅迫時，結(jié)構(gòu)方面，葉片迅速下垂，RC/CSo和氣孔導(dǎo)度趨近于零；在物質(zhì)交換方面，葉片與環(huán)境間的H2O和CO2流動逐漸停止；在能量方面，PSII吸收和耗散的能量增加，而能量傳遞卻迅速下降至0（PIABS和REo/RC）。此階段葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化最為明顯，反映出極度干旱脅迫對葉片光合機(jī)構(gòu)造成了嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致PSII受體和供體側(cè)的電子供應(yīng)失衡。在此階段還觀察到ABS/RC急速上升，Manaa等人也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，這可能是植物的脅迫應(yīng)激反應(yīng)，緩解PSII反應(yīng)中心的大量關(guān)閉和電子轉(zhuǎn)運速率的大幅下降。

在水分緊缺的情況下，植株幼苗的耗水量減少，可以維持較高的WUE。本研究發(fā)現(xiàn)，SRWC介于14%至26%之間時，WUE、光合作用的固碳能力（Pn）和PSII的光利用效率（PIABS）均沒有顯著變化，表明中度干旱對遼東櫟幼樹的水分利用效率和生產(chǎn)力沒有明顯影響。當(dāng)缺少灌溉水時，適度減少用水量仍然能獲得較高的遼東櫟幼樹生長量。

3.2干旱敏感性指標(biāo)評價

遼東櫟幼樹葉傾角對土壤干旱的響應(yīng)存在階段性差異，將葉傾角與光合參數(shù)的變化趨勢匹配（圖7），可發(fā)現(xiàn)：當(dāng)葉傾角為-14.0°±1.7°時，氣孔閉合量增加；當(dāng)葉傾角為-43.2°±10.3°時，WUE顯著降低，此時需要灌溉；當(dāng)葉傾角為-68.5°±6.7°時，光合機(jī)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，此時必須立即灌溉。通過葉傾角檢測干旱脅迫程度的方法具有觀測便捷、成本較低的優(yōu)勢，但需要考慮拍照時風(fēng)速對葉傾角的干擾。

評估干旱脅迫程度的常用方法為監(jiān)測SRWC，但測量程序繁瑣費時。利用植物生理指標(biāo)檢測干旱脅迫具有測量速度快和結(jié)果精準(zhǔn)的優(yōu)勢。已有研究將ABS/RC、DlO/RC、RC/CSo和PIABS做為檢測植物干旱脅迫程度的指標(biāo)。我們的研究發(fā)現(xiàn)遼東櫟幼樹葉片的這些參數(shù)在重度和極端干旱脅迫下變化明顯，可作為嚴(yán)重干旱脅迫發(fā)生的預(yù)警指標(biāo)。

4結(jié)論

綜上所述，遼東櫟幼樹葉片遭受漸進(jìn)式干旱脅迫時，光合系統(tǒng)的氣體交換變化最顯著，其次是葉傾角，最后是PSII的電子傳遞和能量耗散。干旱脅迫下光合系統(tǒng)的響應(yīng)可劃分為4個階段：（1）無干旱脅迫，葉片結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，物質(zhì)交換正常；（2）中度干旱脅迫，葉傾角降低、氣孔的結(jié)構(gòu)開始閉合，水和CO2的物質(zhì)交換逐漸減少，但尚能高效的利用土壤水分；（3）重度干旱脅迫，結(jié)構(gòu)變化持續(xù)，物質(zhì)交換和能量流動受阻，土壤水分利用效率降低；（4）極度干旱脅迫，光合系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)變化、物質(zhì)交換和能量流通均趨于停止。據(jù)此，本研究篩選出灌溉的預(yù)警指標(biāo)一葉傾角，以及葉片的致死預(yù)警指標(biāo)－RCo/CS、ABS/RC、Dlo/RC、PIABS。這一結(jié)論可為制定遼東櫟育苗的高效灌溉方案提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。