李文華　劉青華　周志春等

關(guān)鍵詞：馬尾松；松材線蟲；砧木；抗性；松脂組分

中圖分類號：S763.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）04-0001-11

馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）廣泛分布于我國亞熱帶地區(qū)，適應(yīng)性強，在土層深厚的土壤中生長較快，是我國主要的產(chǎn)脂、用材和荒山造林先鋒樹種。其松脂是由分泌細(xì)胞分泌的無色透明次生代謝產(chǎn)物，可以分離成松節(jié)油和松香，主要由萜類物質(zhì)組成，貯藏于松樹的針葉、枝和莖的木質(zhì)部和韌皮部的樹脂道系統(tǒng)中，在針葉樹種的防御體系中有著重要的作用。此外，松脂廣泛應(yīng)用于香料、醫(yī)藥、機械、造紙、油墨等行業(yè)，也是我國重要的工業(yè)原料及可再生環(huán)保資源。

松材線蟲病被稱為松樹的“癌癥”，最快兩個月內(nèi)可導(dǎo)致感染植株死亡。馬尾松常易感染松材線蟲病，但有些松樹（如濕地松、火炬松）卻明顯具有抗病性。據(jù)國家林業(yè)和草原局統(tǒng)計，近30年來，全國因松材線蟲病損失的松樹累計可達(dá)數(shù)十億株，造成直接經(jīng)濟損失和生態(tài)服務(wù)價值損失高達(dá)上千億元，松材線蟲病已成為全球森林生態(tài)系統(tǒng)中最具危險性、毀滅性的病害之一。

松屬植物在遭受生物或非生物刺激時，能夠經(jīng)樹脂道分泌化學(xué)防御物質(zhì)松脂進行自我保護；受到創(chuàng)傷時，其分泌的松脂將傷口封閉，并為入侵生物制造有毒的環(huán)境。已有相關(guān)研究表明，松脂的各類組分功能不同，萜類化合物可以抑制細(xì)菌、真菌和病毒感染，蒎烯類是松樹防御反應(yīng)的重要化合物，單萜類化合物具有良好的殺蟲效果；倍半萜類與松材線蟲病抗性也有緊密聯(lián)系。

嫁接技術(shù)可能對提高植物抗逆境能力和對病蟲害抵抗能力有一定程度改善。不同蘋果砧木影響植物在脅迫環(huán)境下生長受抑制情況，耐性強的砧木可通過調(diào)節(jié)自身生理特征以適應(yīng)脅迫環(huán)境；新疆葡萄不同砧木間也存在抗旱能力差異。本文通過分析不同砧木及不同抗性馬尾松接種松材線蟲后各松脂組分動態(tài)變化，揭示砧木對馬尾松抗松材線蟲病影響及馬尾松對松材線蟲病害的響應(yīng)機制，進一步為防治馬尾松松材線蟲病提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

馬尾松試驗林設(shè)在浙江省臨海市林業(yè)技術(shù)推廣和場圃旅游服務(wù)總站（28°88′N，121°01′E），屬亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，雨量充沛，溫暖濕潤，年平均氣溫17.30℃，全年無霜期242 d，年平均降水量1638.10 mm，年平均日照時數(shù)1936.40h，土壤類型為紅壤。試驗材料取自5年生馬尾松嫁接苗測定林，包括共有16個無性系，馬尾松砧木為浙江馬尾松一代良種‘5410種子園混合種子，依據(jù)前期對砧木接種松材線蟲，砧木全部死亡；濕地松砧木為G-222優(yōu)良種子，對砧木接種松材線蟲，致死率為30%。兩種砧木所用馬尾松穗條均為休寧5（4級）。根據(jù)前期安徽省林業(yè)科學(xué)研究院對馬尾松無性系對松材線蟲病的抗性指數(shù)測定，劃分為1～4級，其中1級為易感，4級為高抗。于2018年選擇高抗無性系休寧5（4級）和易感無性系黃山1（1級）各10株，在試驗前未采過松脂；供試松材線蟲材料為高致病性、高繁殖性線蟲株系‘廣株3B，此種松材線蟲分離種群多次繼代培養(yǎng)的松材線蟲繁殖速度比初代培養(yǎng)的要慢5～6代，繁殖能力下降。試驗所用線蟲為從當(dāng)年新枝中分離出來，并經(jīng)鑒定為‘廣德38，于灰葡萄孢菌落上純培養(yǎng)，保存于4℃冰箱中備用。

1.2試驗方法

1.2.1松材線蟲培養(yǎng)及接種 將灰葡萄孢接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，于28℃霉菌培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)5d。待著色菌落生長到培養(yǎng)皿上蓋后，將所選高致病性松材線蟲材料接種到灰葡萄孢菌落中，在28℃恒溫培養(yǎng)約10 d，使菌落完全被松材線蟲取食。采用貝爾曼漏斗法將松材線蟲分離，12 h后，將其收集在10 mL離心管中，無菌水沖洗3次，并以300 r.min^-1離心5 min，以去除上清液。將所得各離心管中的松材線蟲匯聚混勻，最后制備成每1μL含有50條松材線蟲的懸浮液。

于2018年7月對馬尾松接種松材線蟲（圖1）。分別選取10株馬尾松砧木馬尾松和10株濕地松砧木馬尾松、10株高抗馬尾松和10株易感馬尾松接種松材線蟲懸濁液。參考Liu等處理方法進行接種與樣品采集。所取樣品包括上述40株馬尾松，包括接種前、接種后1、7、15和30 d4個取樣時間點，每株馬尾松取3個重復(fù)。

1.2.2松脂收集及化學(xué)組分分析每個無性系采用3個重復(fù)，從每個試驗區(qū)系統(tǒng)選擇了1～2株生長最佳的健康馬尾松植株進行松脂收集測定，在植株胸徑處劃出一條長約20 cm、寬1～2 mm、深3～4 mm的斜口，采用下降式單刀采脂法收集松脂。將新鮮松脂收集于5 mL聚乙烯管中，在松脂達(dá)到管體積的2/3時，立即封閉管口并放人冰盒中，置于-20℃冰箱中保存待測。

利用氣相色譜·質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）分析和測定松脂各組分含量。樣品制備參考Karanikas的方法，使用Agilent 6890N氣相色譜和Agilent59758質(zhì)譜聯(lián)用，檢測馬尾松的松脂組分含量。獲得的片段通過與NTST08譜庫（National Institute of Standards and Technology，USA）匹配來進行松脂化學(xué)組分的識別，根據(jù)各組分與內(nèi)標(biāo)的面積確定各組分在松脂中的含量。

1.2.3萜類化合物對松材線蟲的影響 以前期所用灰葡萄孢菌落培養(yǎng)的松材線蟲，接種于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用貝爾曼漏斗法將分離出的松材線蟲裝在2 mL離心管中，制成含有500條松材線蟲的1 mL懸濁液。將純度為97%的α-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品、純度為98%的β-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品、純度為98%的長葉烯標(biāo)準(zhǔn)品、純度為97%的檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)品、純度為97%的β-月桂烯標(biāo)準(zhǔn)品及98%的龍腦標(biāo)準(zhǔn)品以一定濃度梯度作用于松材線蟲，在25℃條件下培養(yǎng)24 h；以Triton X-100為對照，技術(shù)重復(fù)3次；選取處理后0.5、6、24 h為時間節(jié)點觀察線蟲致死率。

2結(jié)果與分析

2.1砧木對馬尾松抗性的影響

2.1.1不同砧木馬尾松主要松脂組分及含量 接種松材線蟲后，馬尾松砧木和濕地松砧木馬尾松均無發(fā)病癥狀（圖2d，2e）。對以馬尾松和濕地松為砧木的馬尾松松脂進行GC-MS檢測，選擇與NTST08匹配度高于90%、含量超過0.01%的萜類松脂化學(xué)組分（圖3），結(jié)果表明：兩種砧木馬尾松均檢測出19種松脂組分，其中單萜類6種，倍半萜類7種，二萜類6種（表1）。通過對各松脂組分含量方差分析表明：倍半萜含量在兩種砧木馬尾松間無顯著差異，平均含量約為90.00～130.00 mg·g^-1；單萜含量與二萜含量在兩種砧木馬尾松間存在顯著差異，其中濕地松砧木單萜含量較馬尾松砧木高9.64%，馬尾松砧木二萜含量較濕地松砧木高2.85%。

a.蒎烯含量在單萜中最高，在不同砧木馬尾松間存在顯著差異（p<0.05），且濕地松砧木含量較馬尾松砧木高8.02%。長葉烯、石竹烯和樅酸在不同砧木馬尾松間具有顯著差異（p<0.05），且濕地松砧木石竹烯含量高于馬尾松砧木85.24%、馬尾松砧木長葉烯含量與樅酸含量分別高于濕地松砧木25.22%與39.76%。α-石竹烯、反式-β-金合歡烯和去氫樅酸含量在不同砧木馬尾松間也存在顯著差異（p<0.05）。

β-蒎烯平均含量約為17.10～19.30 mg·g^-1、β-月桂烯平均含量約為0.50～1.70 mg·g^-1、檸檬烯平均含量約為1.50～4.30 mg·g^-1、水芹烯平均含量約為59.00～69.00 mg·g^-1、龍腦平均含量約為10.80～19.00 mg·g^-1，在兩種砧木馬尾松間均無顯著差異。長葉蒎烯、環(huán)長葉烯、灑剔烯、海松酸、山達(dá)海松酸、左旋海松酸／長葉松酸和新樅酸含量在兩種砧木馬尾松間也無顯著差異。

2.1.2不同砧木接種松材線蟲后松脂化學(xué)組分動態(tài)變化兩種砧木馬尾松接種松材線蟲1d后松脂組分中萜類含量略有增加，但均無顯著差異。α-蒎烯、β-蒎烯和龍腦在兩種砧木馬尾松中含量變化規(guī)律相似。對馬尾松砧木馬尾松接種松材線蟲后不同時間松脂化學(xué)組分均值分析（圖4a），結(jié)果表明：β-月桂烯、檸檬烯和新樅酸含量變化規(guī)律為先上升后下降，且在7d最大值15 d最小值；海松酸含量變化規(guī)律為上升趨勢，且在15 d達(dá)最大值；灑剔烯等含量變化無顯著差異。對濕地松砧木馬尾松接種松材線蟲后不同時間松脂化學(xué)組分均值分析（圖4b），結(jié)果顯示：海松酸含量變化規(guī)律為先上升后下降，且7d最大值15 d最小值；灑剔烯含量變化規(guī)律為逐漸上升，且在15 d最大值。β-蒎烯、檸檬烯和新樅酸等含量變化無顯著差異。在兩種砧木馬尾松接種松材線蟲7d時，新樅酸僅在馬尾松砧木中達(dá)最大值，而海松酸僅在濕地松砧木中達(dá)最大值，且萜類組分含量在兩種砧木馬尾松間均無顯著差異。

接種松材線蟲后α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、龍腦、海松酸和新樅酸含量在兩種砧木馬尾松間無顯著差異。β-月桂烯含量在接種松材線蟲1d后馬尾松砧木顯著高于濕地松砧木（p<0.05）（圖5a）；β-月桂烯含量在接種松材線蟲7d后馬尾松砧木顯著高于濕地松砧木（p<0.05）（圖5b）；在接種松材線蟲15 d后各組分含量在馬尾松砧木與濕地松砧木間無顯著差異（圖5c）。

2.2不同抗性馬尾松接種松材線蟲后松脂化學(xué)組分分析

2.2.1不同抗性馬尾松主要松脂組分及含量 接種松材線蟲后，高抗馬尾松無癥狀出現(xiàn)，易感馬尾松在接種后7d即出現(xiàn)針葉枯黃現(xiàn)象，并在接種后30 d時全部枯死（圖2c，2f）。在組織結(jié)構(gòu)上，易感馬尾松組織結(jié)構(gòu)接種松材線蟲1d時有輕微損傷（圖2a，2b）。高抗馬尾松和易感馬尾松松脂共檢測出19種松脂組分，對高抗與易感馬尾松松脂進行GC-MS檢測，選擇與NTST08匹配度高于90%、含量超過0.01%的萜類松脂化學(xué)組分，結(jié)果表明：高抗與易感馬尾松均檢測出19種松脂組分，其中單萜類6種，倍半萜類7種，二萜類6種（表2）。其中，高抗與易感馬尾松松脂組分僅在含量上有差異，方差分析表明：高抗與易感馬尾松倍半萜和二萜含量之間無顯著差異，在松脂中平均含量分別約為80.00～100.00 mg·g^-1和680.00～710.00 mg·g^-1。而在單萜含量中存在顯著差異，其中高抗馬尾松單萜含量比易感馬尾松單萜含量高7.34%。

α-蒎烯含量在單萜中含量最高，在不同抗性馬尾松間存在顯著差異（p<0.05），高抗馬尾松含量較易感馬尾松含量高9.28%。β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、長葉烯在不同抗性馬尾松間有顯著差異（p<0.05），且除β-月桂烯外高抗馬尾松含量分別高于易感馬尾松43.70%、39.37%、4.59%。水芹烯平均含量約為56.00～64.00 mg·g^-1、石竹烯平均含量約為4.00～5.50 mg·g^-1。長葉蒎烯、環(huán)長葉烯、灑剔烯、α-石竹烯、反式-β-金合歡烯、海松酸、山達(dá)海松酸、左旋海松酸／長葉松酸、去氫樅酸、樅酸和新樅酸含量在不同抗性馬尾松間也無顯著差異。

2.2.2不同抗性馬尾松接種松材線蟲后松脂化學(xué)組分動態(tài)變化

高抗與易感馬尾松接種松材線蟲1 d后松脂組分中萜類含量略有增加，但無顯著差異。對高抗馬尾松接種松材線蟲后不同時間松脂化學(xué)組分均值分析（圖6a），結(jié)果顯示：α-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、長葉烯和α-石竹烯含量變化規(guī)律為先上升后下降，且7d達(dá)最大值15 d達(dá)最小值；β-蒎烯和龍腦含量變化規(guī)律先上升后下降，且7d達(dá)最大值0d達(dá)最小值；海松酸和去氫樅酸含量變化規(guī)律為逐漸上升，且15 d達(dá)最大值。對易感馬尾松接種松材線蟲后不同時間松脂化學(xué)組分均值分析（圖6b），結(jié)果顯示：含量先上升后下降且7d達(dá)最大值15 d達(dá)最小值的為新樅酸；含量為7d達(dá)最大值Od達(dá)最小值的為反式-β-金合歡烯；含量呈上升趨勢15 d達(dá)最大值的為海松酸和去氫樅酸；含量7d達(dá)最小值15 d達(dá)最大值的為水芹烯和環(huán)長葉烯；含量呈下降趨勢15 d達(dá)最小值的為α-石竹烯和樅酸。

α-蒎烯和β-蒎烯含量在接種松材線蟲1d后高抗馬尾松顯著高于易感馬尾松（p<0.05）（圖7a）；α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯與長葉烯含量在接種松材線蟲7d后高抗馬尾松顯著高于易感馬尾松（p<0.05）（圖7b）；在接種松材線蟲15 d后各組分在高抗與易感馬尾松間無顯著差異（圖7c）。

2.3萜類對松材線蟲的影響

參考馬尾松松脂化學(xué)組分的主要萜類化合物含量，檢測松脂中主要萜類化學(xué)物對松材線蟲的抑制作用。根據(jù)所測松脂組分含量及劉青華等研究中馬尾松松脂萜類的平均含量，設(shè)置不同濃度梯度的α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯和長葉烯溶液，研究相應(yīng)萜類對松材線蟲的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、長葉烯、β-月桂烯和龍腦溶液的松材線蟲平均存活率隨著化合物濃度和處理時間的增加而逐漸下降（圖8）。在α-蒎烯梯度濃度溶液中，150 mg·g^-1濃度下處理24 h松材線蟲全部死亡，而在500 mg·g^-1濃度下處理0.5 h即造成松材線蟲全部死亡（圖8A）。在β-蒎烯梯度濃度溶液中，不同濃度溶液處理0.5 h后松材線蟲致死率達(dá)約50%，處理24 h后松材線蟲致死率趨于100%（圖8B）。在長葉烯梯度濃度溶液中，10 mg·g^-1濃度下處理0.5 h松材線蟲達(dá)80%致死率（圖8C）。在檸檬烯梯度濃度溶液中，3.60mg·g^-1濃度下處理0.5 h后松材線蟲致死率趨于100%（圖8D）。在β-月桂烯梯度濃度溶液中，1.20 mg·g^-1濃度下處理24 h松材線蟲致死率達(dá)約50%，2.40 mg·g^-1濃度下處理24 h松材線蟲致死率達(dá)約85%（圖8E）。在龍腦梯度濃度溶液中，13.00 mg·g^-1濃度下處理24 h松材線蟲致死率達(dá)約50%.50.00 mg·g^-1濃度下處理24 h松材線蟲致死率達(dá)約80%（圖8F）。

3討論

不同砧木馬尾松和不同抗性馬尾松樹干木質(zhì)部松脂中共檢出19種組分，與古研等和張振洪等檢出的組分基本一致。α-蒎烯、β-蒎烯、長葉烯、水芹烯、灑剔烯、海松酸、左旋海松酸／長葉松酸、脫氫樅酸、樅酸和新樅酸為松脂中含量較高的組分。

不同砧木馬尾松松脂組分含量響應(yīng)松材線蟲變化差異較小。松材線蟲入侵松屬植物后，刺激分泌纖維素酶等細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，類毒液過敏原蛋白等激發(fā)寄主產(chǎn)生防御反應(yīng)，進而在接種后的7 d左右引起萜烯類次級代謝產(chǎn)物的大量積累。本研究中，在兩種砧木馬尾松接種松材線蟲7d時，新樅酸僅在馬尾松砧木中達(dá)最大值，而海松酸僅在濕地松砧木中達(dá)最大值，且萜類組分含量在兩種砧木馬尾松間均無顯著差異。馬尾松對松材線蟲抗性可能與砧木無關(guān)，馬尾松更易感染松材線蟲病可能由于自身不斷進化，形成更適宜松材線蟲寄生的群體組成結(jié)構(gòu)。

馬尾松響應(yīng)松材線蟲入侵進行的主動防御造成萜烯類物質(zhì)大量增加，而不同抗性馬尾松接種松材線蟲后松脂組分變化情況有所不同?？剐灾笖?shù)越高，產(chǎn)脂量越高，其單萜含量越高。高抗馬尾松中α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、龍腦、長葉烯與α-石竹烯含量在接種7 d時達(dá)最大值，含量動態(tài)變化呈先上升后下降趨勢。易感馬尾松中反式-β-金合歡烯、去氫樅酸與新樅酸含量在接種7d時達(dá)最大值。接種松材線蟲7d時，α-蒎烯、β-蒎烯、長葉烯與檸檬烯含量在高抗馬尾松與易感馬尾松之間存在顯著差異（p<0.05），且均為高抗馬尾松顯著高于易感馬尾松。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲入侵后，馬尾松釋放的揮發(fā)性物質(zhì)主要為α-蒎烯、β-蒎烯和長葉烯三種蒎烯類物質(zhì)；Kuroda等研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲入侵黑松后，單萜的含量明顯增加，其中α-蒎烯含量增加到健康松樹的2～4倍，β-蒎烯和幾種其他的單萜含量是健康松樹的2～3倍；本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。

通過將α-蒎烯、β-蒎烯、長葉烯、檸檬烯、β-月桂烯與龍腦萜類組分對松材線蟲進一步梯度濃度試驗表明：α-蒎烯溶液隨濃度升高對松材線蟲毒害作用越大，而150 mg·g^-1濃度下處理24 h松材線蟲全部死亡。β-蒎烯溶液不同濃度溶液處理0.5 h后松材線蟲即達(dá)到約50%致死率，對松材線蟲抑制作用與溶液濃度無關(guān)。長葉烯溶液隨濃度升高對松材線蟲抑制作用越大，10 mg·g^-1濃度下處理0.5 h松材線蟲達(dá)到80%致死率。檸檬烯溶液在3.60 mg·g^-1濃度下處理0.5 h后松材線蟲存活率趨于100%。β-月桂烯1.20 mg·g^-1濃度下處理24 h松材線蟲致死率約50%。龍腦13.00 mg·g^-1濃度下處理24 h松材線蟲致死率達(dá)約50%，且致死率升高較慢。上述結(jié)果與Liu等對馬尾松研究結(jié)果相同，α-蒎烯、β-蒎烯、長葉烯和檸檬烯在低濃度下即可抑制松材線蟲的存活，是馬尾松萜烯類主要防御成分；Niu等對馬尾松研究發(fā)現(xiàn)也得出相似結(jié)論，α-蒎烯、β-蒎烯等單萜類化合物在低濃度下具有抑制松材線蟲繁殖的作用。

4結(jié)論

馬尾松和濕地松樹干木質(zhì)部松脂中共檢測出19種松脂組分，α-蒎烯、β-蒎烯、水芹烯、反式-β-金合歡烯、海松酸、山達(dá)海松酸、左旋海松酸／長葉松酸、去氫樅酸、樅酸和新樅酸在松脂中含量占比較高。松材線蟲入侵樹體后，萜烯類次生代謝產(chǎn)物在7d后大量積累并發(fā)生顯著變化。α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、龍腦、海松酸和新樅酸含量在不同砧木馬尾松接種松材線蟲7 d時達(dá)最大值，其組分含量在兩種砧木間無顯著差異性，由此可得，砧木對馬尾松松材線蟲抗性并無影響。接種松材線蟲7d時α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、龍腦、長葉烯、α-石竹烯、反式-β-金合歡烯和新樅酸含量在不同抗性馬尾松間動態(tài)變化有所不同，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、長葉烯為抗性馬尾松顯著高于易感馬尾松（p<0.05）；α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯與長葉烯低濃度下抑制松材線蟲活性，與馬尾松抗性有關(guān)，是馬尾松萜烯類主要防御成分。