黃亞玲 李小意 陳麗 楊毅

為了探究CARK11在ABA介導的生理進程中的具體作用，本研究以擬南芥哥倫比亞生態(tài)型（WT）、CARK11功能缺失突變體cark11和回補激酶喪失CARK11N203A（com-CARK11m）以及過表達轉基因株系（OE-CARK11）為研究對象，探究CARK11在種子萌發(fā)、幼苗形態(tài)構建、主根生長與干旱響應中發(fā)揮的作用. 結果顯示：相比WT，ABA促進了cark11和com-CARK11m的種子萌發(fā)、子葉變綠和主根伸長，而OE-CARK11被抑制. qRT-PCR檢測RAB18和RD29a的表達量，發(fā)現(xiàn)過表達CARK11促進RAB18和RD29a表達；ABA處理后，這種促進作用更強. 干旱實驗發(fā)現(xiàn)，OE-CARK11耐旱性增加，而cark11和com-CARK11m耐旱性弱于WT. 這些結果表明：CARK11作為ABA信號通路的正調控因子抑制擬南芥的種子萌發(fā)、子葉變綠和主根生長；同時在干旱脅迫中具有積極作用；另外CARK11在ABA信號途徑中的功能依賴激酶活性.

蛋白激酶CARK11; 脫落酸; 脫落酸信號通路; 干旱

Q943.2A2023.026004

收稿日期： 2022-05-25

基金項目： 國家自然科學基金（31671455， 31870240）

作者簡介： 黃亞玲（1997-）， 女， 四川綿陽人， 碩士研究生， 研究方向為植物遺傳和分子生物學. Email： huangyaling@stu.scu.edu.cn

通訊作者： 楊毅. E-mail： yangyi528@scu.edu.cn

CARK11 involves in ABA-mediated physiological functions in Arabidopsis

HUANG Ya-Ling， LI Xiao-Yi， CHEN Li， YANG Yi

（Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

In this study， the purpose is to explore the specific role of CARK11 in ABA-mediated physiological processes. Arabidopsis Columbia ecotype（WT）， T-DNA mutant cark11， complementation of kinase-dead CARK11N203A in the background of cark11， （com-CARK11m）， and overexpression transgenic lines（OE-CARK11） were used in this study to determine the roles of CARK11 during seed germination， seedling morphogenesis， primary root growth， and drought tolerance. The results showed that compared with the WT， ABA promoted seed germination， cotyledon greening， and primary root elongation in both cark11 and com-CARK11m， while OE-CARK11 was relatively inhibited. In addition， qRT-PCR data showed that overexpression of CARK11 promoted the expression of RAB18 and RD29a， which were ABA-marked genes， and this facilitation was stronger after ABA treatment. In the drought tolerance assay， the results revealed that OE-CARK11 enhanced drought tolerance， while cark11 and com-CARK11m were weaker than WT. Thus， we conclude that CARK11 acts as a positive regulator in the ABA signaling pathway and inhibits seed germination， cotyledon establishment， primary root growth and drought stress in Arabidopsis. Notably， the function of CARK11 is dependent on kinase activity in the ABA signaling pathway.

CARK11; ABA; ABA signaling; Drought tolerance

1 引 言

面對多變的環(huán)境，植物的固著性使得其無法像動物一樣通過運動等方式趨利避害，因此植物進化出了特有的應對機制，脫落酸（Abscisic acid， ABA）在其中發(fā)揮重要作用. ABA不僅參與響應生物和非生物脅迫，而且還調控著植物的生長發(fā)育. 早在上世紀六十年代即發(fā)現(xiàn)了ABA的存在，目前ABA的研究已經(jīng)相對廣泛而深入，其中2009年ABA受體（Pyrabactin Resistance 1 / PYR1-Like Receptors / Regulatory Components of ABA Receptors， PYR1 / PYLs / RCARs）的發(fā)現(xiàn)是ABA研究領域的突破之一［1， 2］. ABA受體被明確以后，ABA核心信號通路被闡明. ABA受體、蛋白磷酸酶2C（Type 2C protein phosphatases， PP2Cs）和SNF1相關蛋白激酶2（SNF1-Related Protein Kinases2， SnRK2s）是ABA信號通路的核心組件. 當植物受到脅迫時，ABA與RCARs、PP2Cs結合形成三元復合體，PP2Cs酶活受到抑制，釋放了對SnRK2s的抑制作用，SnRK2s磷酸化調控下游因子，最終介導種子萌發(fā)、氣孔關閉、根部生長、非生物脅迫以及衰老等過程［3］.

隨著ABA核心信號通路的闡明，ABA信號網(wǎng)絡的研究逐漸擴大，相關研究還有待于進一步闡明，如核心元件RCARs如何被調控的相關研究仍然未知. 最近研究顯示，胞質ABA受體激酶11（Cytosolic ABA Receptor Kinase 11， CARK11）可以結合并磷酸化RCAR11-14，且CARK11第203位氨基酸天冬酰胺（Asparagine， N）是關鍵磷酸化位點［4］. CARK11是一種類受體胞質蛋白激酶（Receptor-Like Cytoplasmic Protein Kinases， RLCKs），擬南芥中同家族成員還包括CARK1-CARK10. 研究表明CARKs各個成員普遍參與RCARs的調控，并且存在功能冗余［5］. 擬南芥ABA受體分為三個亞家族，第一和第二亞家族都是單體蛋白，分別是RCAR1-4和RCAR5-10，而RCAR11-14是ABA受體的第三亞家族，以二聚體形式存在. 蛋白水平實驗表明，擬南芥CARK11可以磷酸化RCAR11-14并使其解聚，解聚的RCAR11-14才能與ABA結合，從而開啟ABA信號通路［4］. 因此，CARK11調控ABA信號的分子機理基本明確，但是其在ABA相關生長發(fā)育過程中的具體作用尚不清楚. 在小麥等作物中，CARKs家族同源物參與調控ABA信號的研究相對很少，本研究闡明CARK11在擬南芥的種子萌發(fā)、幼苗形態(tài)構建、主根生長以及干旱響應等生理進程中發(fā)揮的作用，可為農業(yè)生產(chǎn)相關研究提供理論基礎.

鑒于CARK11在蛋白水平上參與調控ABA信號轉導，本研究構建并鑒定CARK11的功能缺失突變體cark11、過表達轉基因株系（OE-CARK11 #1和OE-CARK11 #9）和CARK11N203A回補株系（com-CARK11m #1和com-CARK11m #2），通過種子萌發(fā)、子葉變綠、主根伸長、干旱脅迫以及ABA報告基因實時定量實驗，探究CARK11在擬南芥生長發(fā)育以及脅迫反應中發(fā)揮的功能，并進一步分析CARK11在ABA信號通路中的作用.

2 材料與方法

2.1 材 料

T-DNA插入突變cark11（SALK_208681c）購于擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center）. 過表達轉基因株系（OE-CARK11）和CARK11N203A回補株系（com-CARK11m）分別通過浸染擬南芥哥倫比亞生態(tài)型和CARK11突變株后篩選獲得.

2.2 方 法

2.2.1 純合T-DNA插入突變株系的獲得 收取4周齡cark11幼葉1～2片，使用250 μL基因組提取液研磨并高速離心，收取上清液，加入等量異丙醇，充分震蕩后再次高速離心，棄去上清液，并用70%乙醇洗滌沉淀2次，晾干后加入超純水，獲得cark11突變體的基因組. 以獲得的基因組為模板，進行聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction， PCR），鑒定引物見表1，根據(jù)核酸凝膠電泳成像結果分析鑒定純合突變體.

2.2.2 轉基因株系的構建 將CARK11基因編碼序列插入雙元載體pBI121，利用35S啟動子構建過表達載體，提取質粒后轉化進入農桿菌GV3101，然后以擬南芥哥倫比亞生態(tài)型野生型為背景，通過花絮浸染法獲得轉基因株系T0代種子. 在MS培養(yǎng)基中加入50 μg / mL卡那霉素（Kanamycin），將T0代種子鋪于板中篩選出陽性苗，根系深深扎入培養(yǎng)基中的即為陽性，種入土中，收獲T1代種子. 觀察記錄T1代種子陽性率，保留陽性率與陰性率比值為3∶1的株系并種植，然后收獲T2代種子. T2代種子篩選獲得陽性率為100%的株系即為純合的過表達株系，最后還需確定基因表達量，符合預期的株系用于后續(xù)實驗.

將CARK11第203位氨基酸天冬酰胺突變?yōu)楸彼幔ˋlanine， A）（CARK11N203A， CARK11m），獲得目的片段后插入pZH01載體，利用35S啟動子構建回補載體，提取質粒轉入農桿菌GV3101，然后以cark11為背景進行花絮浸染，后續(xù)與上述過表達株系構建操作一致.

2.2.3 種子萌發(fā) 各個株系種子于4 ℃黑暗條件下春化2 d. 配制ABA濃度梯度的MS培養(yǎng)基，ABA終濃度依次為0、0.3、1.0、3.0、10.0 μmol/L，每個濃度培養(yǎng)基各設置三個重復. 在各個培養(yǎng)基中分別點播相同數(shù)量的種子，然后于組培室中平置培養(yǎng)，4 d后統(tǒng)計萌發(fā)的種子數(shù)量. 種子萌發(fā)率（Germination Rate）計算方式為：

種子萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)量/種子總數(shù)

2.2.4 子葉變綠 同于種子萌發(fā)實驗技術，種子分別在MS和加入0.3 μmol/L ABA的MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約1 w后觀察記錄子葉變綠的情況. 子葉綠化率（Greening）的計算方式為：

子葉綠化率=長出綠色子葉的種子數(shù)/種子總數(shù)

2.2.5 主根伸長 先將種子置于MS培養(yǎng)基中垂直培養(yǎng)2～3 d，然后選取根長一致的幼苗分別轉移到ABA濃度為0和20 μmol/L的1/2 MS培養(yǎng)基中，未加ABA的培養(yǎng)基作為對照組，垂直放置培養(yǎng)大約1 w后統(tǒng)計分析主根伸長長度.

2.2.6 干旱脅迫 各個株系撒播于土壤中，設置三個生物學重復，正常生長2 w，然后停止?jié)菜?，干? w后復水，2 d后觀察存活率.

2.2.7 RNA的提取 利用Trizol法提取RNA：收取于MS培養(yǎng)基中平置培養(yǎng)1 w的擬南芥幼苗，加入液氮至研缽中充分研磨樣本，粉末狀樣本置入1 mL Trizol并立即充分混勻，冰置10 min. 低溫高速離心后收取上清液，加入200 μL氯仿混勻，冰置5 min. 再次低溫高速離心后收取上清液，加入500 μL異丙醇混勻，冰置30 min. 低溫高速離心，棄去上清，70%乙醇洗滌沉淀，晾干后加入超純水溶解沉淀，所獲溶液即為RNA，后續(xù)可用于實時定量分析（Real-Time Quantitative PCR， qRT-PCR）.

2.2.8 實時定量分析 以RNA為模板，利用Takara反轉錄試劑盒獲得cDNA，根據(jù)CARK11基因序列設計引物，引物序列委托華大基因公司合成（表2），然后利用Takara實時熒光定量試劑盒對CARK11進行qRT-PCR. 以β-Actin為內參，反應體系為20 μL：10 μL TB Green Premix Ex Taq，上下游引物各1 μL，1 μL cDNA以及7 μL無菌水. 反應程序為：95 ℃預變性2 min，然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸5 s，檢測39個循環(huán). 每個樣本技術重復3次，生物學重復3次，最終通過2-ΔΔt的方法計算相對表達量，GraphPad Prism 9.0繪制結果.

3 結 果

3.1 CARK11基因表達量分析

獲得突變體與轉基因純合株系后，需要進一步進行CARK11基因表達量分析，定量結果呈現(xiàn)為T-DNA插入突變體表達量降低、過表達株系升高、回補株系與野生型水平一致才能進行表型分析. 提取野生型以及各個轉基因株系的RNA后，進行實時熒光定量. 定量結果顯示，在野生型（WT）中CARK11基因相對表達量僅為11左右；但是T-DNA插入突變的cark11的表達量更低，基本接近于0；兩個過表達株系（OE-CARK11 #1和OE-CARK11 #9）的CARK11基因相對表達水平顯著高于野生型，OE-CARK11 #1的CARK11基因表達量大約是野生型的3倍，OE-CARK11 #9甚至達到野生型的6倍；而關鍵磷酸化位點突變的回補株系（com-CARK11m #1和com-CARK11m #2）表達量較野生型稍高，但是遠低于過表達株系（圖1）. 可以確定在cark11和OE-CARK11株系中基因表達量確實如預期降低和升高，而com-CARK11m恢復了cark11的基因表達水平，甚至高于野生型.因此上述五個株系可以用于后續(xù)的功能分析.

3.2 CARK11參與調控ABA介導的種子萌發(fā)

種子萌發(fā)實驗顯示，未加ABA進行處理時，各個株系的萌發(fā)率一致，基本都能夠接近100%，表明種子的生理活性一致. ABA抑制種子萌發(fā)，0.3 μmol/L ABA處理后，野生型的萌發(fā)率明顯降低，約為84%；而cark11突變體萌發(fā)率顯著高于野生型，達到91%；相反，過表達株系OE-CARK11 #1和OE-CARK11 #9的種子萌發(fā)率分別為75%和70%，顯著低于野生型；而回補株系com-CARK11m #1和com-CARK11m #2的萌發(fā)率類似cark11，分別為91%和95%，說明磷酸化位點突變后的CARK11N203A不能挽救突變體的功能缺失（圖2）. 分別用1.0、3.0、10.0 μmol/L ABA處理各個株系，隨著濃度的升高，ABA對各個株系的抑制作用加強，但是在相同濃度下，ABA對功能缺失突變體cark11、com-CARK11m#1和com-CARK11m#2的抑制率仍舊顯著低于野生型；除了高濃度的10.0 μmol/L ABA處理外，OE-CARK11#1和OE-CARK11#9的抑制率高于野生型. 總之，CARK11功能突變體cark11、com-CARK11m#1和com-CARK11m#2在ABA處理后種子萌發(fā)呈現(xiàn)為ABA不敏感，而過表達株系對ABA敏感，表明CARK11作為正調控因子參與調控ABA介導的種子萌發(fā).

3.3 CARK11參與調控ABA介導的幼苗形態(tài)建成

未經(jīng)ABA處理時，WT、cark11、OE-CARK11#1和OE-CARK11#9、com-CARK11m#1和com-CARK11m#2的子葉在MS培養(yǎng)基中生長情況一致，100%都能長出綠色子葉. 當0.3 μmol/L ABA處理時，各株系的子葉綠化率顯著減少，野生型減少為30.8%；功能突變體cark11、com-CARK11m#1和com-CARK11m#2子葉綠化率較野生型更高，分別是41.7%、46.4%和45.9%；而OE-CARK11#1和OE-CARK11#9則顯著低于野生型，綠化率僅17.6%和18.8%（圖3）. 因此，CARK11功能缺失后對ABA處理的子葉變綠過程不敏感，而過表達則超敏感，表明CARK11正調控ABA介導的子葉形態(tài)構建.

3.4 CARK11參與調控ABA介導的主根生長抑制

在1/2MS培養(yǎng)基中，各個株系主根長度一致. 當20 μmol/L ABA處理后，過表達株系主根長度明顯短于野生型，而功能缺失突變體較長（圖4）. 統(tǒng)計伸長率后發(fā)現(xiàn)，野生型的根長僅為1/2 MS培養(yǎng)基的35%，即主根伸長率為35%；cark11、com-CARK11m #1和com-CARK11m #2根伸長率顯著高于野生型，分別為44%、46.8%和42%，表明突變體對ABA不敏感；OE-CARK11#1和OE-CARK11 #9的根伸長率為17.1%和17.75%，對ABA處理呈現(xiàn)敏感狀態(tài)（圖4）. 鑒于ABA抑制主根生長，但是CARK11功能缺失后，ABA抑制主根伸長的作用被抑制，而過表達增強了抑制作用，因此，CARK11正調控ABA信號，從而抑制主根生長.

3.5 ABA信號通路下游基因表達量分析

RAB18和RD29a是ABA信號通路的下游基因，作為ABA信號通路的報告基因. 對RAB18基因表達量進行分析，結果表明：在正常條件下，野生型與cark11的表達水平相似；OE-CARK11 #9和com-CARK11m #1轉基因株系中RAB18表達量則顯著低于野生型. 對幼苗進行50 μmol/L ABA處理后，野生型的RAB18表達水平顯著提高，大約為未經(jīng)處理時的40倍；但是突變體cark11僅提高8倍，顯著低于野生型；過表達OE-CARK11 #9的RAB18表達提高了接近100倍，顯著高于野生型；而回補株系com-CARK11m #1的RAB18表達水平介于突變體和過表達之間，提高了大約20倍（圖5）. 而RD29a的表達水平分析結果顯示：無ABA處理時，功能突變體cark11和com-CARK11m #1的RD29a表達量顯著低于野生型，而過表達則顯著高于野生型，大約是野生型的7倍. ABA處理后RD29a的表達模式類似于RAB18，功能突變體降低，過表達提高（圖5）. 綜上結果表明，CARK11通過增強RAB18和RD29a的表達促進ABA信號通路.

3.6 CARK11正調控擬南芥的干旱脅迫響應

將2 w齡的擬南芥幼苗干旱處理13 d后，各個株系都呈萎蔫狀態(tài)，功能突變體cark11、com-CARK11m #1和com-CARK11m #2甚至較野生型失水更嚴重，但是過表達OE-CARK11 #1和OE-CARK11 #9較野生型失水更少. 復水2 d后觀察植株生長狀況發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)野生型幼苗能恢復干旱處理前的狀態(tài)，存活率大約為75%；突變體植株整體看來仍舊萎蔫，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)存活率僅為2.5%；而過表達的復水狀況較野生型更好，基本100%都能存活（圖6）. 因此，CARK11正調控擬南芥耐干旱脅迫的過程.

4 討 論

ABA核心信號通路在被子植物中是相對保守的，RCARs代表被子植物中的主要ABA受體，無論是對于模式植物擬南芥還是重要作物水稻，當RCARs功能突變后，其種子萌發(fā)、幼苗生長以及氣孔運動等生理進程都會受損［6， 7］. RCARs通過轉錄后修飾可精細響應環(huán)境變化，其中的修飾即包括磷酸化（Phosphorylation），酪氨酸硝化（Tyrosine Nitration）和泛素化（Ubiquitination）. 朱健康研究團隊在2018年鑒定出ABA受體的磷酸激酶TOR（Target of Rapamycin）：在非應激條件下，TOR磷酸化RCAR12第119位的蘇氨酸，抑制RCAR12與ABA的結合，從而負調控ABA信號途徑；在應激條件下，SnRK2s解離TOR復合體，從而解除TOR對ABA信號的抑制［8］. 擬南芥類EL1蛋白（EL1-like Protein， AEL）是一種酪蛋白激酶，AEL功能突變后種子萌發(fā)以及主根生長過程都對ABA處理敏感，因為AEL可以磷酸化ABA受體并促進其泛素化降解，從而抑制ABA響應［9］. 而本實驗室鑒定出的擬南芥激酶CARKs與ABA受體存在普遍的相互作用，其中CARK2-5和CARK11等都可結合并磷酸化第Ⅲ亞家族ABA受體RCAR11-14，第Ⅲ亞家族ABA受體在正常條件下呈二聚體狀態(tài)，但是ABA誘導CARKs磷酸化RCAR11-14使其解聚，暴露與ABA的結合位點，從而正調控ABA信號通路［4］. 因此，通過對ABA受體的磷酸化調節(jié)，植物可以優(yōu)化生長和應激反應的平衡. 本研究顯示，CARK11作為ABA信號通路的正調控因子參與ABA介導的抑制種子萌發(fā)、幼苗形態(tài)構建以及主根伸長的生長發(fā)育過程，并且這些過程依賴于CARK11的磷酸激酶活性.

干旱是影響植物生長和發(fā)育的一種主要滲透脅迫，會導致農作物產(chǎn)量的嚴重損失. ABA信號轉導對于干旱脅迫響應亦十分重要，植物抵御干旱最重要的途徑是葉片氣孔的關閉，保衛(wèi)細胞膨壓和微絲動態(tài)變化是調節(jié)氣孔開閉的關鍵參數(shù)［10， 11］. 植物在遭遇干旱時，葉片中的ABA迅速增加，ABA-RCARs-PP2Cs三元復合物的形成破壞了PP2C和開放氣孔1（Open Stomata， OST1）的結合，從而釋放活性OST1激酶，OST1激活陰離子通道蛋白（Slow Anion Channel Associated 1， SLAC1）使膜去極化，導致氣孔膨壓降低，最終氣孔閉合［12-14］. 在本文中，干旱實驗結果顯示CARK11功能突變后表現(xiàn)為不耐旱，而過表達則相比野生型更耐旱，可能是突變體中氣孔關閉緩慢，水分散失更多，而過表達氣孔關閉非常靈敏，從而相對保留更多的水分，表明CARK11在干旱脅迫響應中的正調控作用. 結合ABA對干旱脅迫的響應，推測CARK11可能通過激活ABA受體誘導ABA信號通路，從而調控氣孔的關閉.

本文結果進一步證明CARK11確實參與ABA通路，通過磷酸化ABA受體的方式介導擬南芥的生長發(fā)育和脅迫反應. 在小麥與水稻等應用作物中，CARKs家族同源物參與調控ABA信號的研究相對很少，因此本文闡明擬南芥CARK11在ABA核心信號通路中發(fā)揮的調控作用為水稻等相關研究提供模板，從而為水稻與小麥等重要作物的種子萌發(fā)、根系生長以及干旱脅迫等研究奠定理論基礎，對于農業(yè)生產(chǎn)具有一定的意義.

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