劉佳慧 呂紅 林娟

本研究的目的是從生態(tài)環(huán)境獨(dú)特而復(fù)雜的西藏林芝地區(qū)的土壤樣品中挖掘所蘊(yùn)藏的特殊淀粉酶微生物資源.采用淀粉酶功能篩選的方法獲得一株低溫堿性淀粉酶生產(chǎn)菌株，編號(hào)為3F1.其酶活最適條件為10 ℃、pH 10.2.通過(guò)16S rDNA序列分析法鑒定該菌株為蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides），并將其命名為Bm3F1.通過(guò)發(fā)酵條件的逐步優(yōu)化，最終確定其最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.5%可溶性淀粉，培養(yǎng)基初始pH 7.2，裝液量10 mL/250 mL，菌體接種量9.0%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間18 h，經(jīng)優(yōu)化后可將菌株的酶活提升至13.58 U/mL. 表明從西藏林芝地區(qū)分離的Bm3F1具有在低溫和堿性條件下產(chǎn)較高酶活淀粉酶的特性.

低溫堿性淀粉酶; 蕈狀芽孢桿菌; 分離篩選; 發(fā)酵條件優(yōu)化

Q93A2023.026001

收稿日期： 2022-05-09

基金項(xiàng)目： 上海市科技攻關(guān)項(xiàng)目 （19DZ2282100）; 西藏大學(xué)-復(fù)旦大學(xué)生物多樣性與全球變化聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介： 劉佳慧 （1997- ）， 女， 上海人， 碩士研究生， 研究方向?yàn)槲⑸锘钚晕镔|(zhì)挖掘. E-mail： 19210700068@fudan.edu.cn

通訊作者： 林娟. E-mail： linjuan@fudan.edu.cn; 呂紅. E-mail： honglv@fudan.edu.cn

Isolation and screening of psychrophilic and alkaline amylase-producing Bacillus mycoides strain 3F1 and the optimum fermentation for enzyme production

LIU Jia-Hui， L Hong， LIN Juan

（School of Life Science， State Key Laboratory of Genetic Engineering， Tibet University-Fudan University Joint Laboratory for Biodiversity and Global Change， Fudan University， Shanghai 200438， China）

This study is intended to explore the microbial resource contained in the soil samples of Nyingchi， Tibet， which has a unique and complex ecological environment. A psychrophilic and alkaline amylase-producing strain was obtained by the amylase functional screening method， numbered 3F1. The optimum conditions of amylase activity were 10 ℃ and pH 10.2. According to the 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis result， this strain was classified as Bacillus mycoides and named Bm3F1. Through the gradual optimization of fermentation conditions， the optimum fermentation condition for Bm3F1 was determined as follows： fermentation medium was supplemented with 1.5% soluble starch， the initial pH was 7.2， the liquid volume was 10 mL/250 mL， the bacterial inoculum was 9.0%， and the fermentation temperature and time were 30 ℃ and 18 hours， respectively. Under the optimum conditions， the amylase activity from Bm3F1 could be increased to 13.58 U/mL. The results showed that Bm3F1 isolated from Nyingchi， Tibet， has the characteristics of producing high activity amylase under low temperature and alkaline conditions.

Psychrophilic and alkaline amylase; Bacillus mycoides; Isolation and screening; Fermentation condition optimization

1 引 言

淀粉酶全稱(chēng)為葡聚糖水解酶，屬于一種水解酶類(lèi)，能催化淀粉、糖原和糊精等多糖化合物中的糖苷鍵，將其水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖.在淀粉為原料的工業(yè)生產(chǎn)中，淀粉酶作為最重要的一種水解酶，可參與液化（liquefaction）和糖化（saccharification）等加工過(guò)程.例如生淀粉降解酶（Raw starch degrading enzymes， RSDE）在淀粉糊化階段可直接用于降解生淀粉顆粒，具有顯著的節(jié)省能源和簡(jiǎn)化工序等效益［1］.目前淀粉酶已經(jīng)成為用途最廣、產(chǎn)量最大的一種酶制劑，占整個(gè)酶制劑市場(chǎng)的30%，可用于食品飼料加工、燃料酒精工業(yè)、紡織退漿過(guò)程、生物制藥等等行業(yè)［2， 3］.

微生物發(fā)酵法作為目前淀粉酶大規(guī)模生產(chǎn)的主要途徑.其發(fā)酵方式主要分為深層發(fā)酵法（Submerged fermentation， SmF）和固態(tài)基質(zhì)發(fā)酵法（Solid substrate fermentation， SSF）.前者適于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，后者適于真菌發(fā)酵生產(chǎn)［4］.工業(yè)上廣泛使用的細(xì)菌來(lái)源淀粉酶主要來(lái)自芽孢桿菌屬（Bacillus），如枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. 1icheniformis）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilus）、凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和嗜堿芽孢桿菌（B. alkalophilic）等.在真菌來(lái)源淀粉酶方面，曲霉屬（Aspergillus）中的米曲菌（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）、泡盛曲霉（A. awamori）、煙曲霉（A. fumigatus）、黃曲霉（A. flavus）和白曲霉（A. kawachii），以及青霉菌屬（Penicillium）中的擴(kuò)展青霉（P. expansum）、微紫青霉（P. janthinellum）、棕褐青霉（P. brunneum）、婁地青霉（P. roqueforti）、癭青霉（P. fellutanum）、沙門(mén)柏干酪青霉（P. camemberti）、產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum）和奧爾森青霉（P. olsonii）等都可作為淀粉酶生產(chǎn)的真菌來(lái)源［4， 5］.

雖然目前研究顯示具有分泌胞外淀粉酶的生產(chǎn)菌株眾多，但是特定性能淀粉酶生產(chǎn)菌株則相當(dāng)有限.這些淀粉酶在特殊反應(yīng)條件下如高溫、低溫或強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理下依然能夠保持較高的酶活.這較常規(guī)淀粉酶具有更為廣闊的應(yīng)用前景.例如，嗜冷交替單胞菌（Alteromonas haloplanctis）所生產(chǎn)的低溫淀粉酶（AHA）具有高靈活性的多肽鏈可在較低溫度條件下（0～20 ℃）進(jìn)行酶促反應(yīng)［6， 7］.此類(lèi)在低溫條件下仍具有較高酶活的淀粉酶，在生物工程領(lǐng)域可用于解決現(xiàn)代能源危機(jī)，具有較高的應(yīng)用經(jīng)濟(jì)價(jià)值［8］.另外，堿性淀粉酶可以耐受強(qiáng)堿環(huán)境，在環(huán)境pH值為 8.0～10.0時(shí)仍具有催化活性.該特性具有抵抗惡劣的工業(yè)加工條件，使其在工業(yè)應(yīng)用中展現(xiàn)出較好的優(yōu)越性.由于當(dāng)下具有各種特性的淀粉酶生產(chǎn)菌株大多都是從特殊或極端的自然環(huán)境樣本中進(jìn)行篩選和獲取的，故而本研究選取生態(tài)環(huán)境獨(dú)特而復(fù)雜的西藏林芝地區(qū)作為采樣地，通過(guò)挖掘當(dāng)?shù)厮N(yùn)藏的微生物資源，期望篩選獲得具有良好特性的產(chǎn)淀粉酶菌株.在此基礎(chǔ)上通過(guò)一系列的發(fā)酵條件優(yōu)化提高生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶量，以最終實(shí)現(xiàn)當(dāng)?shù)匚⑸镔Y源由簡(jiǎn)單發(fā)現(xiàn)到高值化應(yīng)用的轉(zhuǎn)換.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 樣品來(lái)源 樣品采自西藏林芝市波密縣如納村的玉米作物土壤.在采集時(shí)去除2 cm的表土后取距離地面2～15 cm土層的混合樣裝入樣品袋，于4 ℃保存.

2.1.2 培養(yǎng)基 ?種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：胰酪胨17.0 g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L， pH值調(diào)至7.3±0.2;

淀粉酶篩選培養(yǎng)基［9］：可溶性淀粉2.0 g/L，胰酪胨15.0 g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L， pH值調(diào)至7.3±0.2.

2.2 方 法

2.2.1 淀粉酶生產(chǎn)菌株的篩選 稱(chēng)取2 g土壤樣品裝入盛有22.5 mL無(wú)菌水的三角瓶中，充分振蕩后靜置15～20 min作為原始菌液.待上清液與沉淀分層后，吸取上清液制備成10-1、10-2和10-3三個(gè)濃度梯度的稀釋液.分別吸取100 μL稀釋液涂布于淀粉酶篩選培養(yǎng)基平板上，于28 ℃倒置培養(yǎng)，每隔16 h觀(guān)察一次菌落生長(zhǎng)情況，待長(zhǎng)出明顯菌落后采用碘熏蒸法［10］進(jìn)行淀粉酶生產(chǎn)菌落的顯色初篩.選擇具有明顯透明水解圈的菌落轉(zhuǎn)接至淀粉酶篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)分離，于28 ℃培養(yǎng)16 h后用碘熏蒸法進(jìn)行驗(yàn)證與復(fù)篩，用以獲得形狀、大小、顏色相一致的純種單菌落［11， 12］.挑取單菌落接種于含有1 mL種子培養(yǎng)基的2 mL EP管中，于28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)16 h后進(jìn)行編號(hào)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的種子液.

2.2.2 初始發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以1.0%接種量接種于含有5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的15 mL試管中，培養(yǎng)基初始pH 7.3±0.2，于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)16 h.發(fā)酵結(jié)束后，取2 mL發(fā)酵液于12 000 r/min離心20 min后吸取上清液作為粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定.

2.2.3 淀粉酶活力的測(cè)定 測(cè)定方法：采用3， 5-二硝基水楊酸法，即DNS法測(cè)定淀粉酶的酶活［13， 14］.取80 μL粗酶液與720 μL 1.0%可溶性淀粉溶液（用20 mmol/L、pH 5.2的醋酸鈉緩沖液配制）混合，在28 ℃、pH 5.2條件下反應(yīng)15 min后，迅速加入800 μL的DNS顯色劑，沸水浴10 min后用冰水混合物冷卻至穩(wěn)定.在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以去離子水作為空白對(duì)照組，并且每個(gè)樣品做三個(gè)平行組.

最適反應(yīng)溫度測(cè)定條件：在pH 5.2條件下設(shè)定五個(gè)反應(yīng)溫度值（4、10、28、50和65 ℃），以確定酶活的最適溫度.

最適pH的測(cè)定條件：在28 ℃條件下設(shè)定五個(gè)反應(yīng)pH值（3.2、4.2、5.2、9.2、10.2和11.2），以確定酶活的最適pH.

酶活計(jì)算：一個(gè)酶活單位（U）定義為：在酶活測(cè)定條件下，1 mL粗酶液每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol/L葡萄糖所需要的酶量.

酶活計(jì)算公式如下：

酶活=A×V1×103t×V2×180（μmol·L-1/mL·min）

式中，A是水解產(chǎn)生葡萄糖濃度（mg/mL）;V1是反應(yīng)總體積（mL）;103是單位換算倍數(shù);t是反應(yīng)時(shí)間（min）;V2是粗酶液體積（mL）;180為葡萄糖分子量.

2.2.4 菌株鑒定 形態(tài)學(xué)觀(guān)察：在淀粉酶篩選培養(yǎng)基平板上觀(guān)察菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后在100倍光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察菌體形態(tài)特征.

生理生化指標(biāo)鑒定：挑取純培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行一些系列的細(xì)菌生理生化試驗(yàn)，如過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原性試驗(yàn)和Voges-Proskauer （V-P）試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)流程可參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［15］.

分子生物學(xué)鑒定：采用16S rDNA基因測(cè)序法進(jìn)行細(xì)菌的種屬鑒定，利用通用引物（27-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492-R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和Vazyme 2× Phanta Max Master Mix高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增.取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀(guān)察1500 bp左右的目標(biāo)條帶.將成功擴(kuò)增的樣品進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果通過(guò)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）和EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ezbiocloud.net/identify）進(jìn)行序列比對(duì)以確定種屬［16］.

2.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化 發(fā)酵優(yōu)化采用的是逐步優(yōu)化的方法，初始發(fā)酵培養(yǎng)條件與2.2.2所述相同，酶活測(cè)定條件為在2.2.3中確定的最適溫度和pH條件下測(cè)定.

（1） 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)條件下，改變發(fā)酵時(shí)間，每隔6h進(jìn)行無(wú)菌取樣測(cè)定細(xì)菌濃度（OD600），通過(guò)觀(guān)察菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線(xiàn)，以確定該菌株的產(chǎn)酶模型以及最佳發(fā)酵時(shí)間.

（2） 培養(yǎng)基作用底物類(lèi)型和濃度的優(yōu)化

在（1）的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同作用底物類(lèi)型（可溶性淀粉、普魯蘭多糖、蔗糖、麥芽糖），底物質(zhì)量濃度均為10 g/L;選取最適底物類(lèi)型，通過(guò)改變最適底物濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%），確定最適底物濃度.

（3） 培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化

在（1）和（2）的基礎(chǔ)上，通過(guò)改變培養(yǎng)基初始pH值（4.2、5.2、6.2、7.2、8.2、9.2和10.2），以確定最佳初始pH;

（4） 裝液量的優(yōu)化

在（1）（2）（3）的基礎(chǔ)上，在250mL三角瓶中分別加入不同的培養(yǎng)基裝液量（3、10、25、50、100和150 mL），以確定最佳裝液量.

（5） 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

在（1）（2）（3）（4）的基礎(chǔ)上，分別于不同溫度條件（20、25、30、35、40和45 ℃）進(jìn)行培養(yǎng)，以確定最佳發(fā)酵溫度;

（6） 菌體接種量的優(yōu)化

在（1）（2）（3）（4）（5）的基礎(chǔ)上，改變菌體接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%），以確定最佳接種量.

3 結(jié)果與分析

3.1 低溫堿性淀粉酶生產(chǎn)菌株的篩選和鑒定

從采集到的土壤樣品中，通過(guò)功能活性篩選法在248個(gè)可培養(yǎng)單菌落中分離得到24株可在其菌落周?chē)纬擅黠@水解圈的淀粉酶生產(chǎn)菌株.產(chǎn)淀粉酶菌株占總菌株的9.68%.通過(guò)探究溫度和pH對(duì)分離菌株酶活的影響，獲得一株在低溫和堿性條件下仍具有較高淀粉酶活性的菌株，其編號(hào)為3F1.測(cè)定結(jié)果如圖1所示，在pH 5.2條件下，其酶活在10 ℃時(shí)可達(dá)最高值，約為0.79 U/mL（圖1A）;在28 ℃條件下，其酶活在pH 10.2時(shí)可達(dá)最高值，約為0.88 U/mL（圖1B）.因此，3F1菌株作為一株低溫堿性淀粉酶生產(chǎn)菌株，其酶活的最適溫度為10 ℃和最適pH為10.2.

隨后對(duì)3F1菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀(guān)察.結(jié)果顯示，該菌株在28 ℃培養(yǎng)16 h后的菌落形態(tài)特征表現(xiàn)為：直徑大小約為1.48 mm，形態(tài)大致為圓形，顏色呈現(xiàn)乳白色，質(zhì)地易挑起，表面無(wú)光澤，不透明，無(wú)隆起且邊緣不規(guī)則.挑取該菌落進(jìn)行革蘭氏染色后在100倍光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，該菌株為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性.生理生化性質(zhì)分析顯示： 3F1菌株過(guò)氧化氫酶、明膠液化和硝酸鹽還原性以及V-P試驗(yàn)均呈陽(yáng)性.通過(guò)16S rDNA序列比對(duì)和分析，初步鑒定3F1菌株屬于蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides），進(jìn)而我們將其命名為Bacillus mycoides strain 3F1，簡(jiǎn)稱(chēng)Bm3F1.

3.2 菌株Bm3F1的發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

3.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 為了確定Bm3F1在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌生長(zhǎng)情況與胞外淀粉酶酶活高低之間的關(guān)系，我們每隔6 h取樣測(cè)定細(xì)胞濃度和酶活，繪制了該菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線(xiàn)，以探究其產(chǎn)酶模型和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活的影響，結(jié)果如圖2所示.在Bm3F1發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程中，第三次取樣即18 h前，該菌株處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，其胞外酶活也隨著細(xì)胞的快速生長(zhǎng)而不斷上升，并在18 h時(shí)達(dá)到最高值，約為0.96 U/mL.因此，在18 h內(nèi)Bm3F1的產(chǎn)酶模型為同步合成型.隨后，第四次取樣即24 h后，該菌株生長(zhǎng)明顯減緩，進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，其胞外酶活呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì).第五次取樣即30 h時(shí)其酶活低至0.42 U/mL.綜上，Bm3F1菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間為18 h.

3.2.2 培養(yǎng)基作用底物類(lèi)型和濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響發(fā)酵培養(yǎng)基中成分的變化會(huì)影響菌株的產(chǎn)酶能力.通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同淀粉酶作用底物類(lèi)型，即可溶性淀粉（直鏈淀粉）、普魯蘭多糖（支鏈淀粉）、蔗糖和麥芽糖（雙糖），以探究底物類(lèi)型對(duì)于菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示.不同作用底物類(lèi)型對(duì)Bm3F1產(chǎn)淀粉酶有不同程度的影響，其中在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加可溶性淀粉時(shí)，所產(chǎn)酶活性最高，其次是普魯蘭多糖.據(jù)此可初步確定該菌株生產(chǎn)的淀粉酶屬于誘導(dǎo)型，即在發(fā)酵培養(yǎng)基環(huán)境中存在催化底物時(shí)，該酶可以高效合成并分泌到胞外，并且該淀粉酶種類(lèi)屬于直鏈淀粉酶.又通過(guò)對(duì)可溶性淀粉濃度的梯度設(shè)置，以確定最優(yōu)底物濃度，結(jié)果如圖4所示.當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中可溶性淀粉的濃度為1.5%時(shí)，Bm3F1的酶活最高，約為3.07 U/mL.綜上，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.5%可溶性淀粉可顯著提高Bm3F1的產(chǎn)酶能力.

3.2.3 培養(yǎng)基初始pH和裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)基初始pH值不僅會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)還會(huì)改變酶類(lèi)活性.通過(guò)設(shè)定培養(yǎng)基初始pH梯度以考察初始pH對(duì)生產(chǎn)菌株酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5.Bm3F1在培養(yǎng)基初始pH值為4.2～7.2時(shí)，其淀粉酶活性隨pH值的升高而顯著增強(qiáng)；當(dāng)pH值為7.2～10.2時(shí)，其酶活雖呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，但相對(duì)穩(wěn)定；當(dāng)初始pH值為7.2時(shí)，其酶活達(dá)到最高值，約為3.52 U/mL.因此，選擇培養(yǎng)基初始pH 7.2.在確定最佳初始pH值后，我們需要進(jìn)一步探究培養(yǎng)基裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，因?yàn)檠b液量可反映菌株發(fā)酵過(guò)程中對(duì)溶氧量的需求，直接影響菌株生長(zhǎng)情況.在250 mL三角瓶中裝入不同體積的培養(yǎng)基，以考察裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6.裝液量為10 mL/250mL時(shí)，Bm3F1菌株的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，其酶活可達(dá)8.29 U/mL；而裝液量為25 mL/250 mL～150 mL/250 mL時(shí)，菌株的酶活逐漸減小，說(shuō)明該菌株在發(fā)酵過(guò)程中需要較高的溶氧量.因此，我們選擇10 mL/250 mL為培養(yǎng)基最適裝液量.綜上，培養(yǎng)基初始pH 7.2和裝液量10 mL/250 mL可使Bm3F1菌株的酶活進(jìn)一步提高.

3.2.4 發(fā)酵溫度和菌體接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵溫度會(huì)顯著影響細(xì)菌生長(zhǎng)狀況、代謝過(guò)程以及所產(chǎn)酶蛋白穩(wěn)定性.通過(guò)設(shè)定發(fā)酵溫度梯度以考察發(fā)酵溫度對(duì)生產(chǎn)菌株酶活的影響，結(jié)果如圖7所示. Bm3F1在發(fā)酵溫度為20～30 ℃時(shí)， 其淀粉酶活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)發(fā)酵溫度為30～45 ℃時(shí)，其酶活呈現(xiàn)顯著的遞減趨勢(shì).當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，其酶活達(dá)到最高值，約為9.58 U/mL.因此，選擇發(fā)酵溫度30 ℃.在確定最佳發(fā)酵溫度后，我們需要進(jìn)一步探究菌體接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，因?yàn)榻臃N量對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)速率以及培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分消耗速率息息相關(guān).通過(guò)設(shè)定接種量梯度以考察菌體接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖8所示.當(dāng)Bm3F1菌體接種量為1.0%～9.0%時(shí)，其淀粉酶活性隨著接種量的升高而增強(qiáng)，當(dāng)接種量大于9.0%時(shí)，其酶活均下降.當(dāng)接種量為9.0%時(shí)，其酶活達(dá)到最高值，約為13.58 U/mL.綜上，我們確定Bm3F1的最佳發(fā)酵溫度和最適菌體接種量分別為30 ℃和9.0%.

3.2.5 優(yōu)化前后酶活對(duì)比 通過(guò)對(duì)上述發(fā)酵條件的逐一優(yōu)化，最終確定了Bm3F1菌株的最佳發(fā)酵條件，即發(fā)酵時(shí)間為18 h、在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.5%可溶性淀粉、培養(yǎng)基初始pH為7.2、裝液量為10 mL/250 mL、發(fā)酵溫度為30 ℃以及菌體接種量為9.0%.分別采用初始和最佳發(fā)酵條件對(duì)Bm3F1菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并在10 ℃、pH 10.2條件下測(cè)定該菌株在優(yōu)化前后的淀粉酶活性，其結(jié)果顯示，逐步優(yōu)化后的最終酶活可達(dá)13.58 U/mL，是優(yōu)化前0.93 U/mL的14.60倍.

4 討 論

本文從西藏林芝地區(qū)的土壤樣品中篩選獲得一株產(chǎn)低溫堿性淀粉酶蕈狀芽孢桿菌Bm3F1（Bacillus mycoides strain 3F1），其酶活最適條件為10℃、pH 10.2.有詳細(xì)的文獻(xiàn)記載蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）是一種耐寒性菌種，通?？梢栽? ℃或者更低溫度下生存［17， 18］.據(jù)此，我們推測(cè)Bm3F1菌株自身的適冷生存性賦予了其體內(nèi)所產(chǎn)酶類(lèi)的低溫活性.在寒冷惡劣的環(huán)境下，各種選擇壓力使得微生物不斷進(jìn)化適應(yīng)，促使其體內(nèi)產(chǎn)生獨(dú)特的酶系統(tǒng)來(lái)適應(yīng)生存環(huán)境.另外，芽孢桿菌屬（Bacillus）來(lái)源淀粉酶通常用于堿性pH條件［19］.例如2017年Simair等［20］分離獲得一株堿性淀粉酶生產(chǎn)菌株Bacillus sp. BCC 01-50，其酶活的最適pH為9.0.相比之下，本文獲得的Bm3F1菌株所產(chǎn)淀粉酶在堿適應(yīng)性上更具備優(yōu)勢(shì)（pH 10.2）.再如2018年Arabaci等［21］分離獲得一株產(chǎn)低溫堿性淀粉酶菌株Bacillus subtilis N8，其酶活最適條件為25 ℃、pH 8.0.相較而言，本文獲得的低溫堿性淀粉酶似乎具有更強(qiáng)的低溫活性（10 ℃）和堿適應(yīng)性（pH 10.2）.

為了進(jìn)一步挖掘Bm3F1生產(chǎn)菌株的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和潛能，我們通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化來(lái)提高其產(chǎn)酶能力.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)淀粉酶的活性受到培養(yǎng)基作用底物類(lèi)型和濃度、發(fā)酵時(shí)間和溫度、培養(yǎng)基初始pH和裝液量以及菌體接種量的影響.其中我們發(fā)現(xiàn)Bm3F1在發(fā)酵培養(yǎng)18 h后，其產(chǎn)酶活性開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì).這是由于隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期以后，一方面可能停止生產(chǎn)淀粉酶，另一方面可能所合成的其他蛋白酶將部分淀粉酶降解，或者已分泌的胞外淀粉酶被離子螯合而失活.我們還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基初始pH和裝液量對(duì)Bm3F1菌株產(chǎn)淀粉酶能力具有明顯影響.這是由于初始pH值不僅可通過(guò)改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性和穩(wěn)定性來(lái)影響菌體對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)成分的吸收以及阻礙產(chǎn)物酶蛋白的分泌，而且可通過(guò)影響發(fā)酵培養(yǎng)基成分的離子化程度使發(fā)酵液中的酶類(lèi)活性發(fā)生變化.培養(yǎng)基裝液量則通過(guò)影響發(fā)酵培養(yǎng)基的溶氧量直接影響菌株的生長(zhǎng)速度.最后，我們發(fā)現(xiàn)Bm3F1菌株的發(fā)酵溫度低于30 ℃不利于菌體生長(zhǎng)而影響其產(chǎn)酶過(guò)程，可導(dǎo)致胞外淀粉酶積累量較低.而較高溫度（35℃～45℃）則使菌株的產(chǎn)酶效果更差，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)代謝過(guò)程；高溫條件還會(huì)影響發(fā)酵液中淀粉酶的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致酶活性顯著降低.例如在45 ℃時(shí)酶活僅有0.98 U/mL.此外，我們發(fā)現(xiàn)Bm3F1菌體接種量為1.0%時(shí)酶活最低.這可能是由于接種量過(guò)小導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)速度較低，產(chǎn)酶活性也隨之下降；而過(guò)高的接種量如11%～15%使得發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞濃度過(guò)高，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分快速消耗，最終導(dǎo)致菌體細(xì)胞提前衰老死亡，影響了淀粉酶的胞外積累.

本研究結(jié)果表明，采用了優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件對(duì)Bm3F1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其淀粉酶活性最終可達(dá)13.58 U/mL，較優(yōu)化前提高了13.60倍.該菌株經(jīng)優(yōu)化后的酶活距離工業(yè)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)仍然具有一定差距，我們期望在未來(lái)實(shí)驗(yàn)中可通過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行誘變選育來(lái)進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶量以提升其工業(yè)應(yīng)用的潛能.

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