張柏權(quán) 李中瀚 殷旖珂

為避免誘導(dǎo)基因穩(wěn)定表達(dá)的Tet-On誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)溢漏表達(dá)，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便且高效的外源基因穩(wěn)定誘導(dǎo)表達(dá)， 本研究擬在Tet-On調(diào)控的轉(zhuǎn)錄水平基礎(chǔ)上，將基于穩(wěn)定配體Shield-1的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域FK506結(jié)合蛋白引入目的基因的N端，從蛋白水平控制其本底表達(dá)水平.為驗(yàn)證該系統(tǒng)的效果，本研究以熒光蛋白TdTomato為報(bào)告基因，經(jīng)流式分析結(jié)果證明優(yōu)化后的體系較原體系的溢漏表達(dá)在蛋白水平上降低7倍左右.將該系統(tǒng)應(yīng)用于基于小鼠胚胎干細(xì)胞的體外牙向分化模型，在誘導(dǎo)因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1的協(xié)同作用下，誘導(dǎo)表達(dá)牙齒發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Hand2提高了牙向分化誘導(dǎo)的完成度.

PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)； Tet-on誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)； 溢漏表達(dá)； 不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域； 穩(wěn)定配體Shield-1

Q28A2023.036004

收稿日期： 2022-08-15

基金項(xiàng)目： 國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31900900）

作者簡(jiǎn)介： 張柏權(quán)（1997-）， 男， 陜西西安人， 碩士研究生， 主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究. E-mail： 248857314@qq.com

通訊作者： 殷旖珂．E-mail： ytyike@outlook.com

Establishment and application of a low-leakage Tet-On inducible overexpression system based on the PiggyBac transposition system

ZHANG Bai-Quan， LI Zhong-Han， YIN Yi-Ke

（College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064）

In order to avoid the leakage expression of the Tet-on inducible expression system and to achieve easy， stable and efficient expression of exogenous gene when induced at a specific time， this study planned to add the destabilizing domain FK506-binding protein， regulated by the stable ligand Shield-1， to the N-terminal of the target gene to control its background expression at the protein level. To verify the performance of this system， the fluorescent protein TdTomato was used as the reporter gene in this study. The results of flow analysis showed that the leakage expression in the optimized system was reduced about 7 times compared with the original one at the protein level. This system was applied to the in vitro odontogenic induction system based on mouse embryonic stem cells. Under the synergistic effect of the inducible factor Dox and the stable ligand Shield-1， the induced overexpression of tooth development-related transcription factor Hand2 could improve the completion of odontogenic induction.

PiggyBac transposition system; Tet-On inducible overexpression system; Leakage expression; Destabilizing domain; Stable ligand Shield-1

1 引 言

在發(fā)育生物學(xué)中，某些關(guān)鍵基因在特定時(shí)間段的表達(dá)，是實(shí)現(xiàn)體外組織器官再生的關(guān)鍵步驟，利用Cre-loxP、Tet-On等系統(tǒng)可在體外實(shí)現(xiàn)特定基因的定時(shí)表達(dá)［1-4］.其中，Cre-loxP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)開啟是不可逆的［2， 5］.而Tet-On系統(tǒng)憑借其添加或去除誘導(dǎo)因子Dox實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)起始或停止這一優(yōu)勢(shì)，而被廣泛使用［3， 6］.通常情況下，在Tet-On過(guò)表達(dá)系統(tǒng)中，持續(xù)表達(dá)的rtTA處于游離狀態(tài)，不會(huì)結(jié)合誘導(dǎo)型tetO啟動(dòng)子，無(wú)法起始目標(biāo)基因的表達(dá)；而在添加了四環(huán)素誘導(dǎo)因子（Doxycycline， Dox）后，Dox結(jié)合rtTA并改變其構(gòu)象，使其結(jié)合于tetO啟動(dòng)子上，進(jìn)而起始目標(biāo)基因的表達(dá)［6， 7］.如添加誘導(dǎo)因子Dox實(shí)現(xiàn)基于Tet-On系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子Nanog的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells）的分化誘導(dǎo)［4］.

慢病毒感染或PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)外源基因穩(wěn)定整合與表達(dá)［8， 9］.其中慢病毒感染包含慢病毒生產(chǎn)這一關(guān)鍵步驟，耗時(shí)長(zhǎng)［8］.而步驟簡(jiǎn)單，操作便利的PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，僅需將轉(zhuǎn)座酶PBase與包含目的基因的載體共同轉(zhuǎn)染進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞群，即可通過(guò)轉(zhuǎn)座酶PBase高效且穩(wěn)定地將位于反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeats sequences， ITRs）間的目的片段，以“剪切-粘貼”的方式，整合至基因組的TTAA序列之間，實(shí)現(xiàn)基因片段的穩(wěn)定插入［9， 10］，如通過(guò)PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)Nanog表達(dá)元件在細(xì)胞基因組中的整合［4］.因此，基于PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的Tet-On誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，可以方便快捷的構(gòu)建研究目的基因的體外細(xì)胞模型，且在誘導(dǎo)因子Dox存在時(shí)，可以穩(wěn)定地起始目的基因的過(guò)表達(dá)［3， 6， 7］.

然而，該系統(tǒng)也存在一定的缺點(diǎn).即在沒有誘導(dǎo)因子Dox存在時(shí)，處于靜息狀態(tài)的系統(tǒng)，仍有少量目的基因的表達(dá)，該現(xiàn)象稱之為溢漏（leakage）［3， 7］，而該現(xiàn)象可能會(huì)對(duì)體外分化造成嚴(yán)重影響.為了減少溢漏現(xiàn)象，并增強(qiáng)體系的精確度，本研究擬在目的基因的N端引入不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域（destabilizing domain， DD），即含F(xiàn)36V和L106P突變的FK506結(jié)合蛋白（FK506 binding protein， FKBP），其與穩(wěn)定配體（stabilizing ligand）Shield-1具有更高的結(jié)合穩(wěn)定性［11］.添加不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域后，在缺乏誘導(dǎo)因子Dox時(shí)，系統(tǒng)溢漏表達(dá)的mRNA經(jīng)核糖體翻譯后，形成攜帶FKBP的融合蛋白，該蛋白在缺乏其穩(wěn)定配體時(shí)Shield-1時(shí)，會(huì)處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，從而經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system）途徑快速降解，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)溢漏表達(dá)在蛋白水平的降低.因此，當(dāng)添加誘導(dǎo)因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1時(shí)，Dox將起始融合蛋白的mRNA的轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定配體Shield-1結(jié)合翻譯后的融合蛋白使其處于穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能［11-13］.

人的牙齒不具有再生能力，牙齒再生有望實(shí)現(xiàn)牙齒生理功能的全面恢復(fù) ［14］.現(xiàn)階段，尚無(wú)基于小鼠胚胎干細(xì)胞體外從頭再生的先例.受過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Sox9和Foxc1可以在體外再生唾液腺的啟發(fā)［15］，本研究擬通過(guò)優(yōu)化后的誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)體系，過(guò)表達(dá)牙齒發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，探究其對(duì)于牙向分化誘導(dǎo)的作用.在脊椎動(dòng)物中，Hand2在顱面部神經(jīng)嵴發(fā)育至下頜過(guò)程的間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并決定下頜的發(fā)育命運(yùn)［16-18］，在神經(jīng)嵴中，Hand2基因突變將影響下頜以及相關(guān)結(jié)構(gòu)的發(fā)育［17］，過(guò)表達(dá)Hand2將改變上頜的發(fā)育命運(yùn)，使之獲得下頜的發(fā)育命運(yùn)［16］.本實(shí)驗(yàn)室RNA-seq數(shù)據(jù)分析顯示胚胎發(fā)育E10.5天的牙胚的間充質(zhì)細(xì)胞中，Hand2呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài).然而從本實(shí)驗(yàn)室建立的小鼠胚胎干細(xì)胞體外牙向分化數(shù)據(jù)分析，Hand2的表達(dá)水平較低.因此，本研究擬結(jié)合上述誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，將Hand2作為目標(biāo)基因，探究該系統(tǒng)的應(yīng)用前景并及Hand2對(duì)于牙向分化誘導(dǎo)的作用.

綜上，本文優(yōu)化了現(xiàn)有的基于PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的Tet-On誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，并證明在目的基因的N端添加不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域后，以TdTomato熒光蛋白為報(bào)告基因，在無(wú)誘導(dǎo)因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1時(shí)，體系的溢漏表達(dá)在蛋白水平上降低7倍左右；且在誘導(dǎo)因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1的協(xié)同作用下，可以實(shí)現(xiàn)熒光蛋白TdTomato的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)；并且，將該體系應(yīng)用在基于小鼠胚胎干細(xì)胞的體外分化模型中，擬胚體分化的第8～12 d，添加Dox和Shield-1可以提高轉(zhuǎn)錄因子Hand2和下游靶基因Pitx1的表達(dá)程度［16］，Pitx1在胚胎發(fā)育過(guò)程中，是擬發(fā)育成牙上皮的細(xì)胞群的標(biāo)志基因之一［19］，證明過(guò)表達(dá)Hand2可以提高牙向分化誘導(dǎo)的完成度.本文首次實(shí)現(xiàn)基于PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，通過(guò)不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域降低溢漏表達(dá)的Tet-On誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的建立.該系統(tǒng)為解析發(fā)育過(guò)程中的重要事件提供了高效且精確的研究手段，也為研究特定基因在發(fā)育過(guò)程中如何指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)和分化決策提供重要方法.

2 材料和方法

2.1 材 料

小鼠原代胚胎干細(xì)胞單克隆細(xì)胞系6#-13，E.coli HST08 Competent Cells（Takara，9128），DMEM basic（Gibco，C11995500BT），F(xiàn)etal Bovine Serum（Hyclone，SH30396.03），GlutaMAX（Gibco，335050-061），MEM NEAA（Gibco，11140-050），Pen-Strep（Gibco，15140-122），Recombination Human Lif（Novoprotein，C017），β-Mercaptoethanol（Gibco，M3148），Trizol（Sigma，T9424），氯仿（成都長(zhǎng)聯(lián)化工，XK13-201-00213-016），異丙醇（Fisher chemical，A451），質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN，DP103），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，RR047A），PBS（Gibco，C10010500BT），Gelatin from porcine skin（Sigma，G1890-100G），Lipofectamine 3000 Transfection Kit（Invitrogen，L3000-015），Dox（TAKARA，631311），Shield-1（MCE，HY-112210），0.25% Trypsin-EDTA（Gibco，25200072），ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（諾唯贊，C113）

2.2 方 法

2.2.1 載體構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)室提供基于PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的Tet-On過(guò)表達(dá)TdTomato的質(zhì)粒，PiggyBac-Tet-On-TdTomato，并攜帶Puro抗性基因.提取小鼠E10.5的牙胚的RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，使用高保真酶擴(kuò)增出Hand2序列.以HEK293FT細(xì)胞的基因組為模板，使用高保真酶擴(kuò)增出DD序列.通過(guò)ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，以同源重組的方式完成載體PiggyBac-Tet-On-DD-TdTomato和PiggyBac-Tet-On-DD-Hand2的構(gòu)建.隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板、菌落PCR鑒定、搖菌、提質(zhì)粒、測(cè)序等操作獲得目的質(zhì)粒.

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 配置維持6#-13細(xì)胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基，配方為409.45 mL DMEM，75 mL FBS，5 mL Pen-Strep，5 mL GlutaMAX，5 mL NEAA， 500 μL β-Mercaptoethanol和50 μL Lif.傳代過(guò)程為：0.1%的gelatin處理培養(yǎng)板20 min；棄培養(yǎng)基，添加胰酶，37 ℃消化3 min，ES培養(yǎng)基中和，1500 r/min離心3 min后棄上清，使用ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按合適比例傳代至處理后的細(xì)胞培養(yǎng)板中，并補(bǔ)充ES培養(yǎng)基至2 mL，隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).Dox的工作濃度為1μg/mL.觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況的曝光時(shí)間為100ms（-Dox）和5ms（+Dox）.

2.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染使用Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑盒，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，其中空載質(zhì)粒、質(zhì)粒PiggyBac-Tet-On-DD-Hand2、質(zhì)粒PiggyBac-Tet-On-DD-TdTomato或質(zhì)粒PiggyBac-Tet-On-TdTomato分別與PiggyBac轉(zhuǎn)座酶PBase進(jìn)行轉(zhuǎn)染，且質(zhì)粒的摩爾比為1∶1.轉(zhuǎn)染兩天后的細(xì)胞群開始藥篩，每1 mL培養(yǎng)基加入0.1 μL濃度為10 mg/mL的Puromycin.藥篩傳代3次后，獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行細(xì)胞凍存，并用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)

2.2.4 熒光定量 RNA的提取按照Trizol法進(jìn)行操作，提取后的RNA使用NanoDrop檢測(cè)濃度，做好標(biāo)記，置于-80 ℃冰箱保存；反轉(zhuǎn)錄使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒，并按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作.完成反轉(zhuǎn)錄的cDNA添加無(wú)DNase的水進(jìn)行稀釋，置于-20 ℃冰箱保存；根據(jù)需要合成qPCR實(shí)驗(yàn)所需的引物；實(shí)驗(yàn)體系參考Vazyme的SYBR qPCR Master Mix的說(shuō)明書進(jìn)行配置，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，GAPDH為內(nèi)參.

qPCR引物：

GAPDH F：GCACAGTCAAGGCCGAGAAT

GAPDH R：GCCTTCTCCATGGTGGTGAA

TdTomato F：GTGAGCAAGGGCGAGGAGGTCATCAAAGAG

TdTomato R：CTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGTACAGGA

Hand2 F：CCGACACCAAACTCTCCAA

Hand2 R：GATCCATGAGGTAGGCGATG

Pax9 F：CTCCATCACCGACCAAGG

Pax9 R：CCCTTCTCCAATCCATTCAC

Lhx8 F：GAAGTGGAGAACGGTAATGGG

Lhx8 R：TGTTGTCCTGAGCGAACTGT

Pitx1 F：ACTCCTACAACAACTGGGCG

Pitx1 R：GGGCCGAGAACATGGATTGA

2.2.5 流式分析 收集樣品于15mL離心管中，用PBS洗3次，隨后加入0.25%的Trypsin-EDTA消化5 min，用移液器吹打至散開，隨后再37 ℃消化2 min，加入3倍體積的培養(yǎng)基中和胰酶，并加入適量DNase，吹打至無(wú)細(xì)胞團(tuán)，500 g離心3 min，去上清，用PBS重懸細(xì)胞并用細(xì)胞篩過(guò)濾至流式管中.流式細(xì)胞儀按照說(shuō)明書的指示調(diào)整至正常工作狀態(tài)，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

3 結(jié)果與分析

3.1 誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)載體的優(yōu)化原理和應(yīng)用方法

基于PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的Tet-On誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，在沒有誘導(dǎo)因子Dox的存在下，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍能起始目的基因（gene of interests，GOI）的表達(dá)，這種現(xiàn)象稱為溢漏（leakage）［3， 7］.為降低系統(tǒng)的溢漏，本研究擬在目的基因的N端的引入不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域，即FK506結(jié)合蛋白，使新的目的基因表達(dá)元件經(jīng)核糖體翻譯后，形成融合蛋白.理論上，優(yōu)化后的系統(tǒng)有兩種工作狀態(tài)：一，在無(wú)誘導(dǎo)因子和穩(wěn)定配體存在時(shí)，溢漏表達(dá)的融合蛋白因攜帶不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域會(huì)經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑被快速降解；二，在誘導(dǎo)因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1同時(shí)存在時(shí)，系統(tǒng)可以穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)融合蛋白，不被降解，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能，如圖1a所示.而該系統(tǒng)通過(guò)轉(zhuǎn)座酶（PBase）識(shí)別誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)（inducible overexpression system，IOS）兩端的反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITR），并將其穩(wěn)定整合于細(xì)胞基因組中，后經(jīng)藥物篩選，可獲得包含穩(wěn)定整合誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞群，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如圖1b所示.

3.2 不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域顯著降低誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的溢漏表達(dá)

本研究基于小鼠原代胚胎干細(xì)胞株6#-13，分別構(gòu)建轉(zhuǎn)染空載（空白對(duì)照組）、PiggyBac-Tet-On-TdTomato（對(duì)照組）或PiggyBac-Tet-On-DD-TdTomato（實(shí)驗(yàn)組）的細(xì)胞群，后經(jīng)藥物篩選，獲得穩(wěn)定整合誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞群.細(xì)胞群在培養(yǎng)24 h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察其熒光蛋白表達(dá)情況.同等曝光時(shí)間下，不添加誘導(dǎo)因子Dox時(shí)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組熒光信號(hào)低，證明不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域DD可以降低系統(tǒng)的溢漏表達(dá)，如圖2a所示；同等曝光時(shí)間下，在添加誘導(dǎo)因子Dox時(shí)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組熒光信號(hào)低，證明體系雖過(guò)表達(dá)融合蛋白，但大部分融合蛋白被迅速降解，如圖2b所示；RT-qPCR結(jié)果顯示，無(wú)論是否存在誘導(dǎo)因子Dox，實(shí)驗(yàn)組的TdTomato在mRNA表達(dá)水平上，始終低于對(duì)照組五倍左右，如圖2c所示.因此，不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域不影響體系目的基因在mRNA水平上的表達(dá).流式分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的TdTomato在蛋白水平上表達(dá)差異較大，溢漏表達(dá)降低7倍左右，如圖2d所示.其中，空白對(duì)照組始終無(wú)熒光信號(hào).以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域的引入，能夠大幅度從蛋白水平上降低系統(tǒng)的溢漏現(xiàn)象.

3.3 穩(wěn)定配體 Shield-1可以恢復(fù)目的蛋白的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)

本研究在細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中加入相同濃度的誘導(dǎo)因子Dox和不同濃度的穩(wěn)定配體Shield-1，以恢復(fù)含不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域（DD）的融合蛋白的穩(wěn)定過(guò)表達(dá).細(xì)胞在傳代24 h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察其熒光蛋白表達(dá)情況.在相同曝光時(shí)間下，實(shí)驗(yàn)組TdTomato的熒光信號(hào)隨著Shield-1的濃度增加而逐漸變強(qiáng)，而對(duì)照組TdTomato的熒光信號(hào)不隨Shield-1的濃度改變，證明優(yōu)化后的體系，具有依賴于穩(wěn)定配體Shield-1濃度的蛋白穩(wěn)定表達(dá)的特征，如圖3a所示；流式分析的結(jié)果證明，500 nmol/L的Shield-1足以恢復(fù)實(shí)驗(yàn)組的TdTomato在蛋白水平上的穩(wěn)定表達(dá)，已達(dá)到TdTomato穩(wěn)定表達(dá)的閾值，如圖3b所示.其中，空白對(duì)照組始終無(wú)熒光信號(hào).綜上，經(jīng)優(yōu)化后的體系可以在Dox和Shield-1的協(xié)同作用下，過(guò)表達(dá)目的基因.

3.4 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hand2可以提高牙向分化誘導(dǎo)的完成度

為了探究轉(zhuǎn)錄因子Hand2對(duì)牙向分化誘導(dǎo)的作用，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)PiggyBac-Tet-On-DD-Hand2的6#-13細(xì)胞群，稱為6#-13（Hand2 OE）（OE， overexpression），如圖4a所示.添加誘導(dǎo)因子Dox可以實(shí)現(xiàn)Hand2在mRNA水平上的過(guò)表達(dá)，如圖4b所示.由于牙齒發(fā)育需牙上皮細(xì)胞和牙間充質(zhì)細(xì)胞協(xié)同作用［20， 21］，故分化體系內(nèi)，只需部分細(xì)胞過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hand2，因此，我們將未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的6#-13細(xì)胞群（對(duì)照組）與6#-13（Hand2 OE）細(xì)胞群按數(shù)量比1∶1混合，形成6#-13（Hand2 OE + WT） （WT， wild type）（實(shí)驗(yàn)組），并采用圖4c所示的實(shí)驗(yàn)方案開展實(shí)驗(yàn)，即在體外分化的8～12 d，添加Dox和Shield-1起始Hand2的穩(wěn)定過(guò)表達(dá).經(jīng)體外牙向誘導(dǎo)分化處理，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組形成的擬胚體在外觀上基本無(wú)差異，均為表面光滑的球體，如圖4d所示.收集第12 d的擬胚體并抽提RNA，經(jīng)RT-qPCR，證明實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子Hand2在RNA水平和蛋白水平上的過(guò)表達(dá)，其中，Hand2在蛋白水平上的過(guò)表達(dá)反映為其下游靶基因Pitx1的RNA表達(dá)水平提升，如圖4e所示.本實(shí)驗(yàn)室建立的小鼠胚胎干細(xì)胞體外牙向分化數(shù)據(jù)分析顯示，作為牙上皮細(xì)胞的標(biāo)志基因之一的Pitx1表達(dá)量較低［19］.在小鼠牙胚發(fā)育過(guò)程中，表達(dá)Pax9和Lhx8的細(xì)胞將擬發(fā)育成牙間充質(zhì)細(xì)胞［19］，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組依然維持高水平的Pax9和Lhx8的表達(dá)，如圖4e所示，證明優(yōu)化后的過(guò)表達(dá)體系不會(huì)對(duì)原有的牙向分化體系產(chǎn)生影響.綜上，我們認(rèn)為，優(yōu)化后的誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)體系可以成功應(yīng)用于，基于小鼠胚胎干細(xì)胞的體外分化模型的研究，且過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hand2可以提高了體外牙向分化誘導(dǎo)的完成度.

4 討 論

PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以高效、快捷地構(gòu)建穩(wěn)定整合外源基因片段的細(xì)胞群，Tet-On誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)則可以在特定時(shí)間，通過(guò)添加誘導(dǎo)因子Dox實(shí)現(xiàn)目的基因的過(guò)表達(dá)，并發(fā)揮其作用，去掉誘導(dǎo)因子Dox的12～24 h內(nèi)，目的基因的過(guò)表達(dá)會(huì)被關(guān)閉，系統(tǒng)恢復(fù)靜息狀態(tài)［3］.無(wú)論是細(xì)胞分化模型還是疾病模型，基于該系統(tǒng)建立的研究體系均有良好的表現(xiàn)，為研究某一基因的功能及其相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要的研究手段［4， 6］.但是，該系統(tǒng)存在的溢漏表達(dá)，使得基于此系統(tǒng)產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度降低，故大量文獻(xiàn)嘗試對(duì)包含不同氨基酸突變的誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，尋找低溢漏表達(dá)的誘導(dǎo)型系統(tǒng)［7］.本文通過(guò)在目的基因N端引入不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域，欲從蛋白水平上降低誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)體系溢漏表達(dá).由TdTomato熒光報(bào)告蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域的引入，能夠大幅度從蛋白水平上降低系統(tǒng)的溢漏現(xiàn)象，因此，該系統(tǒng)對(duì)于目的基因的表達(dá)控制更加精準(zhǔn)，具有更高的應(yīng)用價(jià)值. 為進(jìn)一步研究該系統(tǒng)在實(shí)際中的應(yīng)用，本研究在基于小鼠胚胎干細(xì)胞的體外牙向分化誘導(dǎo)體系中，探究了轉(zhuǎn)錄因子Hand2對(duì)牙向分化的誘導(dǎo)作用.由于Hand2也可以促進(jìn)中胚層來(lái)源的心臟的發(fā)育［18］，基于低溢漏表達(dá)的誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)體系，可以避免Hand2在擬胚體的外胚層發(fā)育誘導(dǎo)過(guò)程（day0-day8）中的潛在影響.利用該系統(tǒng)，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hand2使擬胚體在原分化體系的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了更多的牙齒發(fā)育相關(guān)基因的高表達(dá)，使其更貼近于小鼠原代牙胚相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì).原分化體系其他低表達(dá)的牙齒發(fā)育相關(guān)基因可以通過(guò)該體系實(shí)現(xiàn)基因的高表達(dá)，富集多種牙齒發(fā)育相關(guān)基因的擬胚體有望首次實(shí)現(xiàn)小鼠牙齒的體外從頭再生.在體外發(fā)育生物學(xué)研究過(guò)程中，多數(shù)情況下，需要嚴(yán)格控制目的基因只在特定的時(shí)期進(jìn)行表達(dá)，因此，低溢漏表達(dá)的誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)體系的建立十分必要，基于該體系產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有更高的可信度.

本文將不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域FKBP蛋白引入基于PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的誘導(dǎo)型Tet-On過(guò)表達(dá)體系，建立了低溢漏表達(dá)的誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)體系，一定程度上提高了系統(tǒng)的準(zhǔn)確度，基于該系統(tǒng)所做的研究產(chǎn)生的成果也將更有說(shuō)服力.對(duì)優(yōu)化的誘導(dǎo)型表達(dá)體系的合理應(yīng)用，可以加速對(duì)發(fā)育生物學(xué)研究中重要事件的解析，也為疾病模型、分化模型等研究提供了重要的手段，推動(dòng)干細(xì)胞研究向臨床應(yīng)用方面的轉(zhuǎn)化.

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引用本文格式：

中 文：? 張柏權(quán)， 李中瀚， 殷旖珂. 基于PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的低溢漏誘導(dǎo)型Tet-On過(guò)表達(dá)體系的建立及應(yīng)用［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)：? 自然科學(xué)版， 2023， 60：? 036004.

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