劉泉　曹征征　崔潞晴　郭凱旋　張凡　戴夢紅

摘要：細菌可以通過多種方式產(chǎn)生對抗菌藥物的耐藥性，其中最為常見的方式之一為獲得攜帶有耐藥基因的質粒。耐藥質粒可以在菌株之間轉移，導致耐藥性的廣泛傳播，因此消除耐藥質粒是緩解細菌耐藥擴散的關鍵。本綜述介紹了基于物理、化學以及生物學的細菌耐藥質粒消除方法的研究進展，并闡述了質粒消除的機理，為今后探尋安全有效地消除耐藥質粒的研究方法提供參考。

關鍵詞：耐藥性；質粒；質粒消除；消除機制；抗生素；耐藥基因

中圖分類號：R378? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2023）03-0185-07

Strategies to Combat Bacterial Resistance： Plasmid Curing

Liu Quan，? ?Cao Zheng-zheng，? ?Cui Lu-qing，? ?Guo Kai-xuan，? ?Zhang Fan，? ?Dai Meng-hong

（The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

Abstract： acteria can develop resistance to antimicrobial drugs in a variety of ways， among which the most common way is to obtain plasmids carrying resistance genes. Therefore， strengthening the research on the elimination methods of resistant plasmids becomes critical to alleviate the increasing severity of bacterial drug resistance. In this review， the research progress of plasmid elimination methods based on physics， chemistry and biology is introduced， and the mechanism of plasmid curing is described， which will provide reference for the research methods of safe and effective plasmid curing in the future.

Key words： antimicrobial resistance; plasmids; plasmid curing; curing mechanism; antibiotic; antibiotic resistance gene

抗生素耐藥性是全世界范圍內一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，目前已被視為“同一健康”中的重點之一。長期抗生素的濫用導致了嚴重的環(huán)境污染問題，不斷促進耐藥菌甚至超級細菌的產(chǎn)生。一項新的研究發(fā)現(xiàn)在2018年至2000年間，全球抗生素使用量增加了46%[1]。在動物身上不適當?shù)厥褂每股匾彩菍е驴股啬退幮陨仙脑蛑?。?jù)估計，抗生素消費總量的三分之二用于動物生產(chǎn)[2]。2013年，全球動物生產(chǎn)中的抗生素使用量為13.1萬噸，預計2030年將增加到20萬噸[3]。導致抗生素耐藥多樣性和持久性存在的另一個關鍵因素是抗生素耐藥基因。它們通常位于質粒上，質粒是具有自主復制能力的環(huán)狀DNA片段。耐藥性質粒通常是接合型質粒，不僅能夠啟動自身的轉移，還能帶動其他質粒的轉移[4]。非接合型質粒，不能自我傳播，但是能夠在接合型質粒轉移基因的誘導下被轉移到特定宿主；這種轉移既可以垂直進行，也可以通過水平轉移進行[5]。

作為一種新型環(huán)境污染物，抗生素耐藥基因先于抗生素的發(fā)現(xiàn)而廣泛存在于自然環(huán)境中[6]。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，土壤已成為重要的耐藥基因儲存庫，土壤中的耐藥基因能夠通過受污染作物和地下水系統(tǒng)進入食物鏈，對人類健康造成潛在威脅[7]。養(yǎng)殖場、河流湖泊、醫(yī)療廢水也都是耐藥基因的主要儲存庫，促進了耐藥基因在環(huán)境中的傳播。對臨床治療產(chǎn)生威脅的耐藥基因包括編碼超廣譜β-內酰胺酶的基因（例如CTX-M）、碳青霉烯酶耐藥基因（例如OXA、KpC和NDM）、黏菌素耐藥基因（例如mcr-1）和替加環(huán)素耐藥基因（例如tetX3、tetX4）。CTX-M型耐藥菌已經(jīng)在全球范圍內被分離出來，其發(fā)病率急劇增加，并仍處上升趨勢。blaCTX-M基因本身是高度可變的，現(xiàn)已確認了207多種CTX-M變種[8]。NDM-1于2008年首次從一名在印度新德里住院的患者分離出的肺炎克雷伯菌株中發(fā)現(xiàn)[9]，隨后NDM-1陽性菌株在全球范圍內被發(fā)現(xiàn)。blaNDM基因的廣泛傳播很大程度上是由某些質粒介導的，尤其是IncX3型質粒[10]。由于NDM酶的不斷進化，目前已發(fā)現(xiàn)了24種NDM變種，這對臨床管理和公共衛(wèi)生構成重大挑戰(zhàn)[11]。2016年，首次在中國的人源和動物源的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分離株中報道了mcr-1[12]。大多數(shù)攜帶mcr-1的質粒是可轉移的，IncI2、IncHI2和IncX4是攜帶mcr-1的主要質粒類型[13-14]。多黏菌素，被認為是抵抗多重耐藥革蘭陰性菌感染的最后一道防線。但攜帶黏菌素和碳青霉烯耐藥基因的菌株仍在世界范圍內繼續(xù)傳播，是臨床治療的重大挑戰(zhàn)和對公共衛(wèi)生的重大威脅。

內源質粒可以自發(fā)地從細菌中丟失，但其丟失效率很低[15]，且大部分內源質粒在細胞內是穩(wěn)定存在的。因此，開發(fā)新的策略來限制質粒介導的抗生素耐藥性的傳播是至關重要的。質粒消除是指從細菌中去除質粒的過程。質粒消除有可能去除菌群中的耐藥基因，同時保留完整的細菌群落，因此其可作為對抗抗生素耐藥性的策略。研究發(fā)現(xiàn)可以采用物理、化學、生物學的方法來提高耐藥質粒在細菌中的丟失效率，從而達到消除耐藥質粒，恢復細菌對抗生素敏感性的目的。本文對質粒的消除方法進行了分類和總結，并對質粒的消除機理進行了介紹。

1 物理消除方法

物理消除法是質粒消除方法中最簡單的方法，其操作方便，且對細菌自身基因組的損害較小，不存在突變風險。主要是采用高溫、高壓、微波、紫外線照射等方式來消除耐藥質粒。Mesas等[16]通過使用高壓電穿孔方法誘導細菌內質粒丟失，結果顯示質粒pRS2在電穿孔后以33.3%的頻率丟失，質粒pRS3在電穿孔后以25%的頻率丟失。推測利用高壓消除細菌內質粒的原理為高電壓可以擊穿細菌的細胞壁和細胞膜，使質粒流出，導致細菌質粒丟失。Klassen等[17]將羅伯茨放線菌（Wingea robertsiae）CBS6693暴露于254 nm的紫外線下100～360 s，結果顯示菌株中線性質粒pWR1A和pWR1B均消失，推測細菌質?？赡芙?jīng)紫外線照射而消失。Berzin等[18]利用2.45 GHZ微波處理細菌，結果顯示梭氏菌（Clostridium）MT962質粒pMT351被消除，且消除效率達到42%～47%。物理消除法可用于去除拷貝數(shù)較低或化學試劑難以進入細胞的細菌質粒。

2 化學消除方法

2.1 化學試劑

2.1.1 表面活性劑

十二烷基磺酸鈉（SDS）是最常用的一種表面活性劑，利用其消除質粒主要有兩種機制：一是使內源質粒從細胞膜上的附著位點脫離，抑制質粒的正常復制，最終導致質粒在分裂過程中丟失；二是當SDS到達細胞質后，通過將蛋白質解離成單個亞基從而干擾細胞新陳代謝，部分與質粒復制有關的蛋白失去活性，導致質粒的丟失[19]。朱美秋等[20]利用高溫-SDS法對菌株LBA4404中的質粒進行消除實驗，經(jīng)處理后的菌株內質粒被完全消除。Paul等[21]利用濃度分別為8%，10%及12%的SDS對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中編碼金屬β-內酰胺酶抗性的blaNDM-1和blaVIM-2質粒進行清除，結果顯示SDS成功清除細菌內質粒，且消除效率達到100%。SDS作為一種陰離子消除劑，具有消除質粒的功能，但由于具有高毒性和誘變性質，故臨床很少使用。

2.1.2 嵌合染料及其他

嵌合染料消除劑主要包括吖啶黃、吖啶橙、溴化乙錠（EB）等，其作用機制是它們可以優(yōu)先與細菌內質粒結合，隨即嵌入到DNA雙鏈中，在質粒上形成切口，阻礙質粒的正常復制，從而造成質粒的丟失。在沙門菌[22]、銅綠假單胞菌[23]和鮑曼不動桿菌[24]中已經(jīng)證明溴化乙錠可以消除細菌內源質粒。Saranathan等[24]利用稀釋至亞抑菌濃度（320～5120 μg/mL）的溴化乙錠對鮑曼不動桿菌進行質粒消除試驗，結果顯示細菌內質粒丟失，并發(fā)現(xiàn)質粒丟失后菌株恢復了對兩種以上抗生素的敏感性，表明鮑曼不動桿菌的耐藥性與菌株自身攜帶的質粒有關。Sa?lam等[25]利用吖啶黃消除法對植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進行質粒消除，結果顯示菌株內質粒在80 μg/mL濃度下被成功消除。Dhanarani等[26]將鏈球菌（Streptococcus）、微球菌（Micrococcus）分別置于含有75、100 μg/mL吖啶橙的營養(yǎng)肉湯中，并在37 ℃下培養(yǎng)24 h，檢測到細菌內含有的4.2 kb及5.1 kb大小的質粒被成功消除。EB的質粒消除效率通常比較高，且對多種細菌有效，但由于EB具有強大的誘變活性，并且具有明顯的毒性和致癌性，因此其實際應用很少。此外，結晶紫[27]、萘啶酸[28]也都具有質粒消除作用。

2.2 化學藥物

2.2.1 吩噻嗪類

雜環(huán)有機化合物例如吩噻嗪，已廣泛用于人類醫(yī)學，最初是作為抗蠕蟲藥，現(xiàn)在多用于精神病的治療。吩噻嗪類藥物已被證明對某些細菌和質粒具有活性[29-30]。Spengler等[31]利用吩噻嗪類化合物及其衍生物針對大腸埃希菌（Escherichia coli）K12LE140攜帶的質粒進行消除實驗，證明吩噻嗪具有消除質粒的能力。推斷當此類化合物作用于細菌質粒時，使質粒出現(xiàn)切口，該過程導致質粒解螺旋，從而影響質粒進行正常復制[32-34]。Costa等[35]將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Meticillin-resistant Staphylococcus aureus）HPV107置于含有氯丙嗪的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)細菌內含有的大小為30 kb的質粒消失。Molnár等[36]發(fā)現(xiàn)在異丙嗪和丙咪嗪的存在下，從藤黃微球菌（Micrococcus luteus）中分離出來的DNA促旋酶活性受到抑制。說明吩噻嗪類化合物可以通過阻斷DNA促旋酶的活性使質粒復制受阻。有研究發(fā)現(xiàn)一些質子泵抑制劑增強了吩噻嗪類化合物對大腸埃希菌K12LE140的質粒消除效果[37]，表明質子泵抑制劑可以增強質粒消除藥物的活性。

2.2.2 抗菌藥物

一些抗菌藥物在較高濃度時可以抑制細菌生長，但在亞抑菌濃度時可以消除細菌內攜帶的耐藥質粒。Brandi等[38]選擇3株含有相同抗性基因的三種不同質粒（pT713、pJLL144、pRK2）的大腸埃希菌菌株進行質粒消除試驗。實驗結果表明，在37 ℃條件下，抗生素可導致部分質粒的丟失。在曲伐沙星濃度為10 μg/mL時，觀察到質粒pJLL144丟失，消除效率達到50%。當曲伐沙星在一半的最小抑菌濃度下，大約30%的質粒pRK2丟失。最后，對從曲伐沙星處理的細胞中提取的質粒pT713進行了定量PCR，觀察到該質粒在最小抑菌濃度條件下?lián)p失了大約50%，結果表明曲伐沙星可作為細菌質粒消除的一種有效方法。新生霉素作為拓撲異構酶抑制劑也可以有效治療許多革蘭陽性細菌的質粒，包括糞腸球菌[39]、植物乳桿菌[40]、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌[41]等。此外，頭孢菌素類藥物對細菌的耐藥質粒也有一定的消除能力[42]。

三氯生，作為一種廣譜抗菌劑，被廣泛應用于消毒劑、化妝品、香皂等中，在低濃度時具有抑菌作用，而在高濃度時具有殺菌作用。Riber等[43]將三氯生嵌入到有機硅水凝膠的互穿聚合物網(wǎng)絡中可以促進細菌群體中的質粒丟失。該研究發(fā)現(xiàn)，使用遠低于最小抑菌濃度的三氯生可以導致大腸埃希菌中質粒pMIB4的丟失，且隨著三氯生濃度的增加，細菌中質粒丟失顯著增加，但高濃度的三氯生會使細菌形成適應性反應，導致其對三氯生產(chǎn)生耐藥性，這表明三氯生在未來治療和醫(yī)療目的的應用中存在局限性。

2.3 納米顆粒

近年來，納米顆粒被認為是對抗細菌耐藥性的潛在工具[44]。銅和鉑納米顆粒有助于消除耐藥質粒，因為它們與超螺旋質粒DNA或參與復制、轉錄和重組過程的拓撲異構酶相互作用，最終導致質粒的消除[45-46]。另一種類型的納米顆粒，有機納米顆粒，通過影響質粒DNA的完整性和結合能力顯示出對耐藥菌的治療活性[47]。Bharathan等[48]研究了果膠包裹的鉑納米顆粒（PtNPs）的質粒消除效應。實驗結果表明，在斑馬魚感染模型中，果膠包裹的鉑納米顆粒在體外和體內均能導致大腸埃希菌U3790質粒的丟失，從而導致美羅培南和頭孢曲松的MIC顯著降低。在10 μmol/L濃度下觀察到質粒消除現(xiàn)象，在20 μmol/L濃度下，PtNPs引起質粒的有效丟失。且實驗證明，該納米顆粒是無毒的。機理研究表明，納米顆粒與細胞表面相互作用，擾亂了細胞內膜的完整性，并且可以引起質粒DNA的裂解，進而導致質粒丟失，使多重耐藥細菌在體內恢復對抗菌劑的敏感性。

盡管金屬納米顆粒是另一種對抗細菌耐藥性的武器，但由于金屬在動物飼料添加劑和消毒劑生產(chǎn)等領域的使用，細菌也能夠對納米顆粒產(chǎn)生耐藥性。由于納米顆粒使用劑量較低，盡管它們對身體無害，然而，納米顆粒在人體內長時間存在可能會造成生物積累[49]。因此，需要對納米顆粒的長期毒性和致癌性進行進一步的研究。

2.4 中草藥

中藥作為一種天然藥物，來源廣泛，安全性高，毒副作用小。且許多中草藥不僅具有抑菌、殺菌作用，還被發(fā)現(xiàn)具有逆轉細菌耐藥性的作用。劉彥晶等[50]以亞抑菌濃度的黃芩醇提劑和水煎劑作為消除劑對乙酸鈣不動桿菌的NDM-1質粒進行消除試驗，結果顯示，黃芩醇提劑和水煎劑均可導致質粒的丟失，其中醇提劑的消除效率更高。彭苗苗[51]以七種單味中藥黃連、柴胡、大黃、魚腥草、板藍根、穿心蓮及黃柏對臨床分離的豬源大腸埃希菌進行耐藥質粒消除試驗。實驗發(fā)現(xiàn)，七種單味中藥均具有耐藥質粒消除作用，且黃連的消除效果最佳。綜上所述，中草藥可以在體外有效地消除質粒，然而由于中草藥具有復雜的成分，還需要更多的研究來確認其作用機制，及確定有無毒性和體內有效性。

3 生物消除方法

3.1 轉座子消除

利用轉座子消除質粒的基本原理是通過插入細菌攜帶的質粒，引入具有自殺特性的基因。例如，消除攜帶抗性基因的質粒，其突變株應表現(xiàn)為對此抗性敏感等。目前應用于質粒消除研究的轉座子包括Tn5[52]、Tn5-rpsL[53]、Tn10[54]和Tn1-amp[55]等。胡國元等[56]用Tn5-mob-sacB 標記根瘤菌攜帶的質粒，使其獲得對蔗糖敏感的基因。將菌株置于含有7%蔗糖的培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)，經(jīng)過篩選獲取質粒丟失的突變菌株。

3.2 質粒不相容性消除

質粒不相容性是指同一種或者親緣關系相近的兩種質粒不能在同一細胞中同時穩(wěn)定存在的現(xiàn)象。通過引入另一個相同復制子，干擾菌株中原始質粒的復制，使質粒在多次傳代過程中造成丟失。質粒不相容已廣泛用于質粒消除，可成功消除芽孢桿菌屬中的一些質粒，如蘇云金芽孢桿菌[57]和炭疽芽孢桿菌[58]。Tian等[59]通過構建不相容質粒pBV02，后將其導入貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）NSZ-YBGJ001中，在含25 μg/mL卡那霉素的培養(yǎng)基中連續(xù)多次傳代，最終消除質粒pBV01。Kamruzzaman等[60]利用質粒不相容性，構建了與編碼抗毒素和復制子的基因相結合的干擾質粒。在干擾質粒的存在下，可以有效消除體外培養(yǎng)腸桿菌科細菌中編碼blaIMP-4和blaCMY-2基因的質粒，以及小鼠腸道內定殖的大腸埃希菌中的目標質粒，使整個腸道微生物群可以恢復對抗生素的敏感性，而不會產(chǎn)生任何新的抗生素耐藥性。該研究表明，利用不相容質粒，可以在體外和小鼠腸道中實現(xiàn)安全、徹底消除細菌的抗生素耐藥性。這種方法的質粒消除效率高，且避免了使用化學消除方法時產(chǎn)生的毒性，但其主要缺點是在質粒消除前必須詳細了解菌株靶質粒的復制類型[61-62]，適用于對菌株靶質粒信息較清楚的質粒消除實驗。且目前尚不清楚該方法是否適用于不同宿主物種中的微生物群，因此需要進行深入的研究，以克服該系統(tǒng)的局限性。

3.3 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)消除法

近年來，科研人員已經(jīng)探索了CRISPR/Cas系統(tǒng)作為質粒消除的可行性。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌體內一種天然免疫系統(tǒng)，是重要的基因編輯工具之一?？股乜剐约毦梢酝ㄟ^使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)特異性切割抗性基因或質粒來恢復其對抗生素的敏感性。Hao等[63]開發(fā)了一種新型的CRISPR/Cas9介導的pCasCure質粒消除系統(tǒng)，以消除臨床腸桿菌目細菌分離物中的碳青霉烯酶基因和質粒。該系統(tǒng)將pCasCure質粒轉移到臨床耐藥腸桿菌分離株中，靶向目標質粒后，可高效去除碳青霉烯酶基因和質粒，并使其恢復對碳青霉烯的敏感性。Wang等[64]通過建立pMBLcas9-sgRNA質粒成功消除了臨床大腸埃希菌分離株14EC007中的2個原生質粒，從而使分離株14EC007對多黏菌素和羧芐青霉素重新敏感。

CRISPR-Cas系統(tǒng)在臨床治療方面有著巨大潛力，但目前的開發(fā)仍處于初級階段，進一步的工作需要將CRISPR/Cas元件整合到一個最佳的輸送系統(tǒng)中，使其適用于臨床應用。噬菌體被認為是遞送CRISPR-Cas元件的理想載體，但這種方法仍存在一些局限性。大多數(shù)噬菌體的宿主范圍較窄[65-66]，且將較大的CRISPR-Cas元件整合到噬菌體基因組中可能會影響噬菌體自身的復制和組裝[67]。其次，噬菌體可以傳遞宿主的DNA片段，在噬菌體介導的水平基因轉移下，將會引發(fā)傳播毒力因子或耐藥基因的安全問題[68]。一些研究試圖使用接合法將CRISPR/Cas9質粒遞送到受體細菌中，但是轉移效率都較低。目前，雖然大多數(shù)研究證明了CRISPR系統(tǒng)可用于體外消除耐藥質粒，但其體內的有效性尚未得到驗證。此外，如何將其運輸?shù)郊毎麅炔≡w的靶點是另一個重大挑戰(zhàn)。

4 展望

抗生素耐藥性是對公共健康和環(huán)境的重大威脅，尋找有效和安全的消除質粒的方法對減輕細菌耐藥性至關重要。雖然已知的一些消除耐藥質粒的方法不適用于臨床耐藥細菌感染的治療，但可以應用于環(huán)境污染處理。例如，可以將質粒消除劑應用于養(yǎng)殖場、醫(yī)療廢水、土壤中，減少耐藥基因對環(huán)境中的污染，從而減緩耐藥性的傳播?？梢苿釉谀退幓虻墨@取和傳播中起著關鍵作用，因此控制耐藥性的一種方法就是限制可移動元件的轉移。盡管有很多基于物理、化學方法到基于不相容性或CRISPR/Cas的方法可以消除質粒，但是目前還沒有一個較好的可供體內使用的消除質粒的方法，因此需要進一步的研究以發(fā)現(xiàn)安全有效的方法來消除質粒，并在未來的臨床應用中防止抗生素耐藥基因的傳播。

參 考 文 獻

Browne A J， Chipeta M G， Haines-Woodhouse G， et al. Global antibiotic consumption and usage in humans， 2000-18： a spatial modelling study[J]. Lancet Planet Health， 2021， 5（12）： e893-e904.

Zhang Q Q， Ying G G， Pan C G， et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China： source analysis， multimedia modeling， and linkage to bacterial resistance[J]. Environ Sci Technol， 2015， 49： 6772-6782.

Van Boeckel T P， Glennon E E， Chen D， et al. Reducing antimicrobial use in food animals[J]. Science， 2017， 357： 1350-1352.

Frost L， Leplae R， Summers A， et al. Mobile genetic elements： the agents of open source evolution[J]. Nat Rev Microbiol， 2005， 3： 722-732.

Bennett? P M. Plasmid encoded antibiotic resistance： acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria[J]. Br J? Pharmacol， 2008，153（Suppl.1）： S347-S357.

Pruden A， Arabi M， Storteboom H N. Correlation between upstream human activities and riverine antibiotic resistance genes[J]. Environmental Science? Technology， 2012， 46（21）： 11541-11549.

Udikovic Kolic N， Wichmann F， Broderick N A， et al. Bloom of resident antibiotic-resistant bacteria in soil following manure fertilization[J]. Proceedings National Academy? Sciences USA， 2014， 111： 15202-15207.

Naas T， Oueslati S， Bonnin RA， et al. Beta-lactamase database （BLDB） – structure and function[J]. Enzyme Inhib Med Chem， 2017， 32：917-919.

Yong? D， Toleman M A， Giske C G， et al. Characterization of a new metallo-lactamase gene， blaNDM-1， and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53：5046 -5054.

Wu W， Feng Y， Tang G， et al. NDM metallo-β-lactamases and their bacterial producers in health care settings[J]. Clin Microbiol Rev， 2019， 32（2）： e00115-18.

Dortet? L， Poirel? L， Nordmann? P. Worldwide dissemination of the NDM-type carbapenemases in Gram-negative bacteria[J]. Biomed Res Int， 2014：249856.

Liu Y Y， Wang Y， Walsh T R， et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China： a microbiological and molecular biological study [J]. Lancet Infect Dis， 2016， 16（2）： 161-168.

Shen Y， Zhou H， Xu J， et al. Anthropogenic and environmental factors associated with high incidence of mcr-1 carriage in humans across China[J]. Nat Microbiol， 2018， 3（9）： 1054-1062.

Wang? R， van Dorp L， Shaw L P， et al. The global distribution and spread of the mobilized colistin resistance gene mcr-1[J]. Nat Commun， 2018， 9（1）： 1179.

Laubt T， Malkus P， Paulsson J. New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability[J]. Plasmid， 2013， 70（3）：353-361.

Mesas J M， Rodriguez? M C， Alegre M T. Plasmid curing of Oenococcus oeni[J]. Plasmid， 2004， 51（1）： 37-40.

Klassen R， Meinhardt? F. Linear plasmids pWR1A and pWR1B of the yeast Wingea robertsiae are associated with a killer phenotype[J]. Plasmid， 2002， 48（2）： 142-148.

Berzin V， Kiriukhin M， Tyurin M. “Curing” of plasmid DNA in acetogen using microwave or applying an electric pulse improves cell growth and metabolite production as compared to the plasmid-harboring strain[J]. Archives of Microbiology， 2013， 195（3）： 181-188.

El-Mansi? M， Anderson K J， Inche? C A， et al. Isolation and curing of the Klebsiella pneumoniae large indigenous plasmid using sodium dodecyl sulphate [J]. Research in Microbiology，? 2000， 151（3）： 201-208.

朱美秋，杜克久. LBA4404中的質粒消除與篩選[J]. 河北林業(yè)科技， 2014， （2）： 1-4.

Paul? D， Chanda D D， Chakravarty A， et al. An insight into analysis and elimination of plasmids encoding metallo-β-lactamases in Pseudomonas aeruginosa[J]. J Global Antimicrobial Resistance， 2020， 21： 3-7.

Aksoy D， ?en E. Determination of the role of Salmonella enterica plasmids in antibiotic susceptibility and Caenorhabditis elegans pathogenicity [J]. Mikrobiyoloji bulteni， 2018， 52（1）： 80-88.

Yeldho D， Rebello S， Jisha M S. Plasmid-mediated biodegradation of the anionic surfactant sodium dodecyl sulphate， by Pseudomonas aeruginosa S7 [J]. B Environ Contam Tox， 2011， 86（1）： 110-113.

Saranathan R， Sudhakar P， Karthika R U， et al. Multiple drug resistant carbapenemases producing Acinetobacter baumannii isolates harbours multiple R-plasmids [J]. Indian Journal of Medical Research， 2014， 140（2）： 262-270.

Saglam H， Karahan A G. Plasmid stability of potential probiotic lactobacillus plantarum strains in artificial gastric juice， at elevated temperature， and in the presence of novobiocin and acriflavine[J]. Archives? microbiology， 2021， 203（1）： 183-191.

Dhanarani T S， Shankar C， Park J， et al. Study on acquisition of bacterial antibiotic resistance determinants in poultry litter [J]. J? Poultry Science， 2009， 88（7）： 1381-1387.

Voros A， Simm R， Kroeger? J K， et al. Gene transcription from the linear plasmid pBClin15 leads to cell lysis and extracellular DNA-dependent aggregation of Bacillus cereus ATCC 14579 in response to quinolone-induced stress [J]. Microbiology， 2013， 159（11）： 2283-2293.

Sun Y， Liu Q， Chen S， Song Y， et al. Characterization and plasmid elimination of NDM-1-producing Acinetobacter calcoaceticus from China [J]. PLoS One，? 2014， 9（9）： e106555.

Amaral? L， Viveiros M， Molnar J. Antimicrobial activity of phenothiazines [J]. In Vivo， 2004， 18（6）： 725-731.

Ordway D， Viviros M， Leandro? C， et al. Clinical concentrations of thioridazine kill intracellular multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2003， 47（3）： 917-922.

Spengler E R G， Molnar A， Schei Z Z， et al. The mechanism of plasmid curing in bacteria[J]. Current Drug Targets， 2006， 7： 823-841.

Molnar J. Antiplasmid activity of tricyclic compounds[J]. Methods and findings in experimental and clinical pharmacology， 1988， 10（7）： 467-474.

Molnar J， Foldeak S， Nakamura M J， et al. Antiplasmid activity： loss of bacterial resistance to antibiotics[J]. APMIS. Supplementum， 1992， 30： 24-31.

Molnar J， Mandi Y， Foldeak S. Drug-receptor interaction on plasmid elimination by phenothiazines and imipramine in Escherichia coli[J]. Acta microbiologica Academiae Scientiarum Hungaricae， 1982， 29（1）： 17-25.

Costa S S， Ntokou E， Martins A， et al. Identification of the plasmid-encoded qacA efflux pump gene in meticillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） strain HPV107， a representative of the MRSA Iberian clone [J]. Int J Antimicrob Ag， 2010， 36（6）： 557-561.

Molnar J， Bathon N， Csik V， et al. Interaction between tricyclic psychopharmacons and some antibiotics[J]. Acta microbiologica Academiae Scientiarum Hungaricae， 1995， 42： 277-285.

Wolfart K， Spengler G， Kawase M， et al. Synergistic interaction between proton pump inhibitors and resistance modifiers： promoting effects of antibiotics and plasmid curing[J]. In Vivo， 2006， 20（3）： 367-72.

Brandi L， Falconi M， Ripa S. Plasmid curing effect of trovafloxacin [J]. FEMS Microbiology Letters， 2000， 184（2）： 297-302.

Mchugh G L， Swartz M N. Elimination of plasmids from several bacterial species by novobiocin [J]. Antimicrob Agents Chemother， 1977， 12（3）： 423-6.

Huys G， Dhaene K， Swings J. Genetic basis of tetracycline and minocycline resistance in potentially probiotic Lactobacillus plantarum strain CCUG 43738 [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2006， 50（4）：1550-1551.

Gado I， Toth I， Szvoboda G. Curing of plasmid pE194 with novobiocin and coumermycin A1 in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus [J]. Zentralblatt fur Bakteriologie， 1987， 265（1-2）： 136-145.

高楓，梁繼新，劉保勤，等.頭孢類藥物對人體大腸桿菌耐藥性質粒消除作用的探討[J].河南醫(yī)藥信息，2001， （18）：14-15.

Riber L， Burmolle M， Almm M， et al. Enhanced plasmid loss in bacterial populations exposed to the antimicrobial compound irgasan delivered from interpenetrating polymer network silicone hydrogels [J]. Plasmid， 2016， 87-88.

Bavya M C， Vimal Rohan K， Gaurav G B， et al. Synergistic treatment strategies to combat resistant bacterial infections using schiff base modified nanoparticulate - hydrogel system [J]. Mat Sci Eng C-Mater， 2019， 95： 226-235.

Lakshmi V V， Sridhar P， Khan B T， et al. Mixed-ligand complexes of platinum（Ⅱ） as curing agents for pBR322 and pBR329 （ColE1） plasmids in Escherichia coli [J]. J General Microbiology， 1988， 134（7）： 1977-1981.

Antonoglou O， Lafazanis K， Moudikoudis S， et al.? Biological relevance of CuFeO2 nanoparticles： antibacterial and anti-inflammatory activity， genotoxicity， DNA and protein interactions [J]. Mat Sci Eng C-Mater， 2019， 99： 264-274.

Bozkir A， Saka O M. Chitosan-DNA nanoparticles： effect on DNA integrity， bacterial transformation and transfection efficiency [J]. J? Drug Targeting， 2004， 12（5）： 281-288.

Bharathan S， Sundaramoopthy N S， Chandrasekaran H， et al. Sub lethal levels of platinum nanoparticle cures plasmid and in combination with carbapenem， curtails carbapenem resistant Escherichia coli [J]. Scientific Reports， 2019， 9（1）： 5305.

Hasan A， Morshed M， Memic A， et al. Nanoparticles in tissue engineering： applications， challenges and prospects [J]. International Journal of Nanomedicine， 2018， 13： 5637-5655.

劉彥晶， 張雅潔， 紀雪， 等. 中藥黃芩對NDM-1乙酸鈣不動桿菌的抑菌及質粒消除的研究[J].中國藥學雜志， 2017， 52（12） ： 1018-1022.

彭苗苗. 中藥對豬源大腸桿菌耐藥性消除作用的研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學， 2017.

Barretoe F， Staliotto R， Baldanig I. Curing of a non-symbiotic plasmid of the Rhizobium tropici strain CIAT 899 affected nodule occupancy and competitiveness of the bacteria in symbiosis with common beans[J]. European J Soil Biology， 2012， 50： 91-96.

Imre A， Olasz F， Kiss J. A novel transposon-based method for elimination of large bacterial plasmids [J]. Plasmid， 2006， 55（3）： 235-241.

Crosa J H， Hodges LL， Schiewe M H. Curing of a plasmid is correlated with an attenuation of virulence in the marine fish pathogen Vibrio anguillarum[J]. Infect? Immun， 1980， 27（3）： 897-902.

Ni B， Du Z， Guo Z， et al.? Curing of four different plasmids in Yersinia pestis using plasmid incompatibility[J]. Letters in Applied Microbiology， 2008， 47： 235-240.

胡國元， 周俊初. 華癸中生根瘤菌質粒消除方法研究進展[J].化學與生物工程， 2006， 3：7-9.

Wang P， Zhu Q， Shang H， et al. Curing of plasmid pBMB28 from Bacillus thuringiensis YBT-020 using an unstable replication region[J]. J Basic Microbiology， 2016， 56（2）： 206-210.

Wang? H， Liu? X， Feng? E， et al. Curing the plasmid pXO2 from Bacillus anthracis A16 using plasmid incompatibility[J]. Curr Microbiol， 2011， 62：703–709.

Tian H， Liu B， Yang J， et al. Genetic transformation system for Bacillus velezensis NSZ-YBGJ001 and curing of the endogenous plasmid pBV01[J]. Biotechnol Lett. 2021， 43（8）： 1595-1605.

Kamruzzaman M， Shoma S， Thomas C M， et al. Plasmid interference for curing antibiotic resistance plasmids in vivo[J].PLoS One， 2017， 12： e0172913.

Liu X， Wang D， Wang H， et al. Curing of plasmid pXO1 from Bacillus anthracis using plasmid incompatibility[J]. PloS One， 2012， 7（1）： e29875.

Cao M， Geng W， Liu L， et al. Glutamic acid independent production of poly-γ-glutamic acid by Bacillus amyloliquefaciens LL3 and cloning of pgsBCA genes[J]. Bioresource Technology， 2011， 102（5）： 4251-4257.

Hao M， He Y， Zhang H， et al. Crispr-cas9-mediated carbapenemase gene and plasmid curing in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2020， 64（9）： e00843-20.

Wang P， He D， Li B， et al. Eliminating mcr-1-harbouring plasmids in clinical isolates using the CRISPR/Cas9 system[J].? J Antimicrobial Chemotherapy， 2019， 74（9）： 2559-2565.

Dupont K， Vogensen F K， Neve H， et al. Identification of the receptor-binding protein in 936-species lactococcal bacteriophages[J]. Appl. Environ Microbiol， 2004， 70， 5818–5824.

Chatterjee S， Rothenberg E. Interaction of bacteriophage l with its E. coli receptor， LamB[J]. Viruses， 2012， 4， 3162–3178.

Hua J， Huet A， Lopez C A， et al. Capsids and genomes of jumbo-sized bacteriophages reveal the evolutionary reach of the HK97 fold[J]. MBio， 2017， 8： e01579-01517.

Pirnay J P， Blasdel B G， Bretaudeau L， et al. Quality and safety requirements for sustainable phage therapy products[J]. Pharm Res， 2015， 32（7）： 2173-2179.

收稿日期：2022-09-22

基金項目：“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1600100）。

作者簡介：劉泉，碩士研究生，主要從事抗菌藥耐藥研究。

*通訊作者：戴夢紅，副教授，主要從事抗菌藥耐藥研究。