陸 芮, 劉 健, 林 燕

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)簡稱線蟲,作為一種模式生物,已經被應用于肥胖相關脂肪沉積的研究中。線蟲具有飼養(yǎng)條件簡單、生命周期較短、體積小、通體透明以及遺傳操作便利等優(yōu)點[1]。由于線蟲的身體是透明的,利用親脂染料(油紅O[2]、尼羅紅、蘇丹黑等)與脂滴特異性結合,可以直接觀察到線蟲體內脂肪的儲存。在線蟲中,脂質是以脂滴的形式儲存在腸道和皮下的細胞中[3]。由于脂滴是由單層磷脂膜包被的球形結構[4],通過綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記的脂滴特異性膜蛋白DHS-3,也可以直接觀察線蟲脂肪沉積水平[5]。此外,作為脂肪沉積研究模型,線蟲中還存在著大量與哺乳動物脂質代謝相關的同源基因,保守地調控了線蟲脂肪代謝與能量穩(wěn)態(tài)。其中,與溶酶體活性直接相關的AMP-激活蛋白激酶(哺乳動物簡稱為AMPK,線蟲簡稱為AAK-2)和雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)等信號通路關鍵地調控了線蟲脂肪沉積[6-9]。

溶酶體作為一種高酸性的細胞器,含有多種水解酶,降解無功能的細胞器和蛋白質等物質維持細胞穩(wěn)態(tài)。然而,除降解功能外,溶酶體還參與多種細胞過程,包括營養(yǎng)感受、分泌、質膜修復、細胞信號轉導和能量代謝調控等[10]。有報道指出,溶酶體感應細胞營養(yǎng)狀態(tài),激活溶酶體-細胞核信號,調節(jié)營養(yǎng)缺乏反應和能量代謝。在饑餓狀態(tài)下,肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)被募集到溶酶體膜上。作為核心細胞能量和營養(yǎng)感受器,AMPK被LKB1活化于溶酶體表面。此外,LKB1導致mTORC1與溶酶體的解離,抑制其活性,進而導致mTORC1依賴的轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)磷酸化降低,促進其跨核轉運,從而激活溶酶體生物合成和脂質分解代謝相關基因表達[11-14]。在營養(yǎng)充足狀態(tài)下,mTORC1定位于溶酶體膜上,抑制TFEB的核定位,降低溶酶體生物發(fā)生和自噬[14-16]。因此,溶酶體參與了饑餓狀態(tài)下的營養(yǎng)感知和脂質分解代謝。但是,關于溶酶體是否參與了營養(yǎng)過剩導致的脂肪合成的作用還不明確。

本文在標準線蟲生長培養(yǎng)基(nematode growth medium,NGM)中補充1 mmol/L葡萄糖或0.02 mmol/L棕櫚酸來誘導線蟲的脂肪沉積。利用油紅O染色和LysoTracker Green染色檢測線蟲脂肪沉積和溶酶體活性的變化。利用溶酶體抑制劑氯喹和溶酶體生物合成關鍵轉錄因子hlh-30(哺乳動物TFEB的同源基因)的突變體抑制線蟲溶酶體活性。利用線蟲溶酶體營養(yǎng)感應和脂代謝相關信號關鍵分子aak-2、daf-15、rsks-1的突變體發(fā)現,溶酶體通過mTORC1信號通路影響線蟲能量營養(yǎng)過剩所導致的脂肪沉積。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生型(N2)線蟲,線蟲突變體RT258(unc119(ed3)Ⅲ;pwls50)、LIU1(ldrIs1[dhs-3p∶∶dhs-3∶∶GFP+unc-76(+)])、hlh-30(tm1978)、aak-2(ok524)、daf-15(ok1412)和rsks-1(ok1255),均購于國際線蟲中心(CaenorhabditisGenetic Center,CGC)。

1.2 主要試劑

膽固醇、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、油紅O、棕櫚酸、鏈霉素、左旋咪唑等均購于Sigma-Aldrich試劑公司;LysoTracker Green、瓊脂糖均購于Invitrogen試劑公司;甘油、氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、無水乙醇、1,2丙二醇、次氯酸鈉、膽固醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、葡萄糖、甲醛等試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 線蟲生長培養(yǎng)基的配置

在本實驗中,除非特別注明,蠕蟲是在20 ℃的標準條件下培養(yǎng)的[17]。

標準NGM的配制。稱取3 g氯化鈉、2.5 g蛋白胨和17 g瓊脂粉,加入蒸餾水至1 L并混勻,121 ℃滅菌30 min。滅菌結束后,向上述培養(yǎng)基中加入過濾除菌的25 mL磷酸鉀緩沖液(pH 值為6.0)、1 mol/L氯化鈣、1 mol/L硫酸鎂和5 g/L膽固醇(溶劑為無水乙醇試劑)各1 mL,混合均勻。待溶液冷卻到60 ℃,加入1 mL的 30 g/L鏈霉素,混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中,靜置凝固后備用。

補充葡萄糖NGM的配制。待上述標準NGM溶液溫度降至60 ℃左右時,將1 mL過濾除菌的1 mol/L葡萄糖母液,加入到1 L培養(yǎng)基中,混合均勻后,倒入培養(yǎng)皿中,靜置凝固后備用。

補充棕櫚酸NGM的配置。在上述標準NGM配制過程中,稱取0.005 g的棕櫚酸粉末,加入到NGM中,121 ℃滅菌30 min,冷卻凝固后備用。

1.3.2 線蟲的培養(yǎng)

將進入產卵期1～2 d的線蟲,用約1 mL M9緩沖液洗至1.5 mL的離心管內,多次清洗以除凈大腸桿菌,最后保留700 μL。在上述離心管中,加入300 μL現配的裂解液(5 mol/L氫氧化鈉與5%次氯酸鈉的體積比為1∶2)混勻。靜止2 min后,反復震蕩2～3次,直至2/3的線蟲裂解,6 000 r/min離心1.5 min,棄上清。裂解的卵用M9緩沖液洗3次后,于M9緩沖液中20 ℃孵化至L1期幼蟲。將L1時期線蟲,分別轉移到具有OP50大腸桿菌的標準NGM、補充葡萄糖或棕櫚酸的NGM板上,于20 ℃培養(yǎng)至成蟲。

1.3.3 線蟲的油紅O染色

按照標準方法進行油紅O染色,并稍加修改[3]。稱取0.5 g油紅O粉末溶于100 mL 1,2-丙二醇中,以配置0.5%油紅O染液,靜置1周后使用。染色前,油紅O溶液通過0.22 μm濾膜過濾。

用M9緩沖液,將成蟲從NGM板上沖洗到離心管中。在離心管中,加入1 mL M9緩沖液和50 μL 10%甲醛,-80 ℃放置10 min,反復凍融3次(第3次在冰上解凍1 h)。完全融化后,用預冷的M9緩沖液洗滌3次。最后,用1,2-丙二醇脫水5min,離心除去1,2-丙二醇,再加入1.5 mL油紅O染液,37 ℃恒溫,染色4 h。染色后,分別用98%、85%的1,2-丙二醇和M9緩沖液洗滌,滴加在2%的瓊脂糖墊上成像。至少對30只線蟲成像,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics)定量油紅O陽性面積比率。油紅O陽性面積比率指線蟲經過親脂性染料油紅O染色所呈紅色區(qū)域占整只線蟲面積的比率。

1.3.4 線蟲的溶酶體綠色熒光染色

LysoTracker Green染色按照標準方法進行,但略有修改[18]。將LysoTracker Green染料與過夜培養(yǎng)的OP50菌液以1∶1 000的比例混合,均勻涂布在NGM板上,37 ℃避光過夜。將L1時期線蟲置于NGM培養(yǎng)基上,20 ℃避光培養(yǎng)至成蟲。最后,將成蟲用50 μmol/L左旋咪唑麻醉,置于2%瓊脂糖墊上,使用尼康ECLIPSE E600顯微鏡對至少30只線蟲成像,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics)定量綠色熒光面積比率。綠色熒光面積比率指線蟲經過LysoTracker Green染色所呈綠色熒光區(qū)域占整只線蟲面積的比率。

1.3.5 線蟲DHS-3∶∶GFP熒光拍照及定量

將DHS-3融合綠色熒光(DHS-3∶∶GFP)成蟲用50 μmol/L左旋咪唑麻醉,置于2%瓊脂糖墊上,使用尼康ECLIPSE E600顯微鏡對至少30只線蟲進行了成像,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics)定量綠色熒光面積比率。綠色熒光面積比率指線蟲脂滴特異性膜蛋白DHS-3融合GFP表達面積占整只線蟲面積的比率。

1.3.6 統(tǒng)計學處理

文中所有的數據均為(平均值±標準差),不同的樣本兩兩比較采用t檢驗,多組比較采用one-way ANOVA和two-way ANOVA,使用Prism 5.0版(GraphPad Software,CA,USA)進行統(tǒng)計分析。無營養(yǎng)物補充與葡萄糖或棕櫚酸補充比較,*、**、***分別表示P<0.05、P<0.01、P<0.001時結果具有統(tǒng)計學意義。無抑制劑與氯喹處理比較、N2組與hlh-30(tm1978)比較,#、##、###分別表示P<0.05、P<0.01、P<0.001時結果具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 營養(yǎng)物對線蟲脂肪沉積的影響

為了研究營養(yǎng)物補充對線蟲脂肪沉積的影響,本文在標準NGM中補充1 mmol/L葡萄糖或0.02 mmol/L棕櫚酸來誘導L1時期線蟲,并觀察其脂肪沉積。本文利用油紅O染色發(fā)現,葡萄糖或棕櫚酸的補充增加了N2線蟲的脂肪沉積水平,如圖1a所示。為了進一步驗證上述結果,使用脂滴蛋白DHS-3∶∶GFP標記的線蟲LIU1檢測營養(yǎng)物對脂肪沉積的誘導作用,觀察到補充葡萄糖或棕櫚酸增加了DHS-3∶∶GFP的表達,如圖1b所示。結果表明,補充葡萄糖或棕櫚酸顯著增加了線蟲的脂肪沉積。

圖1 葡萄糖或棕櫚酸補充對線蟲脂肪沉積的影響

2.2 營養(yǎng)物對線蟲溶酶體數量和酸化的影響

溶酶體是一種高度酸化的細胞器,富含脂肪酶、核酸酶和蛋白酶等多種水解酶。這些溶酶體水解酶在pH=5.0時活性最佳[19]。LysoTracker Green是嗜酸性熒光探針,能通透細胞膜,用于活細胞內酸性細胞器的標記和示蹤[20]。因此,LysoTracker Green是一種溶酶體綠色熒光探針,可以用于活細胞溶酶體特異性熒光染色。為了明確溶酶體在營養(yǎng)過剩狀態(tài)下的感應作用,本文利用LysoTracker Green染色檢測葡萄糖或棕櫚酸補充對N2線蟲溶酶體數量和酸化的影響,如圖2a所示。由圖2a可知,營養(yǎng)物補充后,隨著脂肪沉積的增加,線蟲的綠色熒光面積顯著增大,表明營養(yǎng)物的補充增加了溶酶體的數量和酸化。本文利用溶酶體膜蛋白LMP-1融合綠色熒光(LMP-1∶∶GFP)標記的線蟲RT258來監(jiān)測溶酶體數量變化,也獲得了相似的結果,如圖2b所示。因此,溶酶體活性可能調控了營養(yǎng)物誘導的線蟲脂肪沉積。

圖2 補充葡萄糖或棕櫚酸對線蟲溶酶體數量和酸化的影響

2.3 溶酶體對線蟲脂肪沉積的影響

本文研究溶酶體活性抑制對營養(yǎng)物誘導的線蟲脂肪沉積的影響,如圖3所示。由圖3a可知,在N2線蟲中,氯喹(100 μmol/L)的處理顯著抑制了葡萄糖或棕櫚酸所導致的溶酶體數量和酸化的增加。

由圖3d可知,氯喹的處理也顯著抑制了葡萄糖或棕櫚酸所誘導的線蟲脂肪沉積增加。與上述結果相似,在RT258線蟲中,利用氯喹抑制溶酶體活性,也顯著降低了營養(yǎng)物誘導的脂肪沉積,如圖3b、圖3e所示。

在線蟲中,堿性螺旋環(huán)螺旋轉錄因子HLH-30(helix-loop-helix transcription factor)是TFEB的同源蛋白,其響應細胞的營養(yǎng)狀況,調控溶酶體生物合成和脂解相關基因表達[21]。

圖3 溶酶體抑制對營養(yǎng)物誘導的線蟲脂肪沉積的影響

本文利用hlh-30突變體降低溶酶體的生物合成,結果發(fā)現,相對于N2線蟲,hlh-30突變體顯著抑制了葡萄糖或棕櫚酸所誘導的溶酶體數量和酸化的增加,降低了線蟲的脂肪沉積,如圖3c、圖3f所示。因此,溶酶體活性關鍵地調控了營養(yǎng)物誘導的線蟲脂肪沉積。

2.4 mTORC1信號通路對線蟲脂肪沉積的影響

在線蟲中,一些保守的信號通路(如AMPK和mTORC1)已被證實參與了溶酶體營養(yǎng)狀態(tài)的感應和線蟲脂肪沉積的調控[8-9]。為了探究溶酶體調控線蟲脂肪沉積所依賴的信號通路,本文利用這些信號通路關鍵分子的突變體aak-2(ok524)(AMPK信號相關)、daf-15(ok1412)(mTORC1信號相關)和rsks-1(ok1255)(mTORC1信號相關)進行更深入的研究。結果發(fā)現,與N2線蟲相比,aak-2(ok524)、daf-15(ok1412)和rsks-1(ok1255)突變體的溶酶體數量和酸化水平及其脂肪沉積都是降低的。與對照組N2線蟲相似,補充葡萄糖或棕櫚酸顯著增加了aak-2(ok524)突變體中溶酶體的數量和酸化,并且增加其脂肪沉積,如圖4所示。然而,在daf-15(ok1412)和rsks-1(ok1255)突變體中補充葡萄糖或棕櫚酸對溶酶體的數量、酸化以及脂肪沉積均沒有顯著作用。

這些現象與溶酶體抑制劑氯喹處理和hlh-30(tm1978)突變體抑制溶酶體活性、降低營養(yǎng)物誘導的線蟲脂肪沉積的結果相似,進一步說明溶酶體參與了調控營養(yǎng)物誘導的脂肪沉積。結果表明,溶酶體通過mTORC1信號通路影響線蟲能量營養(yǎng)過剩所導致的脂肪沉積。

圖4 mTORC1信號通路介導溶酶體對線蟲脂肪沉積的影響

3 結 論

本文將1 mmol/L葡萄糖或0.02 mmol/L棕櫚酸補充到標準NGM中誘導線蟲脂肪沉積。溶酶體作為營養(yǎng)再生中心,在感應細胞內外營養(yǎng)物質和細胞內的能量檢測中發(fā)揮重要作用,隨著脂肪沉積的增加,線蟲溶酶體數量和酸化水平也顯著增強,結果說明溶酶體可能參與了營養(yǎng)物誘導的線蟲脂肪沉積。

本文利用溶酶體抑制劑氯喹和溶酶體生物合成關鍵轉錄因子hlh-30(tm1978)的突變體,確定抑制溶酶體活性能夠降低線蟲脂肪的沉積。并利用aak-2(ok524)、daf-15(ok1412)和rsks-1(ok1255)等多種突變體發(fā)現,溶酶體通過mTORC1信號通路影響線蟲能量營養(yǎng)過剩所導致的脂肪沉積。

細胞處于饑餓狀態(tài)下,細胞內溶酶體生物合成相關的主要調節(jié)因子TFEB跨核轉運,進入細胞核內,促進溶酶體的生物合成,增加脂質分解代謝相關基因表達[22]。在營養(yǎng)限制的情況下,肝細胞中的脂滴通過與溶酶體直接的穩(wěn)定接觸,將蛋白質和脂質轉移到溶酶體中進行降解,從而維持肝內脂質平衡[23]。因此,溶酶體感應細胞的饑餓狀態(tài),并參與了細胞的脂質分解代謝。但是,關于溶酶體參與營養(yǎng)過剩導致脂肪合成的作用還不明確。本研究在線蟲中發(fā)現溶酶體活性在體內調控營養(yǎng)過剩導致脂肪沉積的作用及其分子機制,豐富了溶酶體在營養(yǎng)感應中的功能研究。