劉 仔,張 麗,鄺惠珍,李俊杰

(東莞市中醫(yī)院藥學(xué)部,廣東 東莞 523127)

一項(xiàng)基于5000萬(wàn)人口全國(guó)城鎮(zhèn)職工基本醫(yī)療保險(xiǎn)數(shù)據(jù)的調(diào)查顯示,在我國(guó)≥25歲人群中HF的年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率是1.10%,預(yù)估現(xiàn)有患病人數(shù)達(dá)1210萬(wàn),每年新發(fā)病患者300萬(wàn)[1]。美國(guó)一項(xiàng)對(duì)來(lái)自254家醫(yī)院39982名HF患者進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)調(diào)整生存分析發(fā)現(xiàn),射血分?jǐn)?shù)下降的心衰(EF≤40%)、射血分?jǐn)?shù)臨界的心衰(EF 41%to 49%)、射血分?jǐn)?shù)保留的心衰HFpEF住院患者5年死亡率分別是75.3%、75.7%、75.7%[2]。降低HF患者死亡率、穩(wěn)定病情、提高生存質(zhì)量成為臨床關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

HF現(xiàn)有治療藥物主要是腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑(ACEI/ARB/ARNI)、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑、利尿劑等。雖然心衰治療現(xiàn)代理念和手段在不斷進(jìn)步,但在西醫(yī)治療基礎(chǔ)上,針對(duì)不同心衰階段的不同證型加用中醫(yī)治療,可有效改善慢性心衰患者臨床癥狀和生活質(zhì)量,維持心功能,減少再住院率[3]。

本研究以全面系統(tǒng)收集整理HF相關(guān)靶點(diǎn)為切入點(diǎn),基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法,尋找潛在中藥及活性化合物,構(gòu)建疾病-靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò),探討中醫(yī)藥治療HF的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),以期為臨床治療HF及相關(guān)藥學(xué)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 心力衰竭相關(guān)作用靶點(diǎn)收集

登錄GeneCard、OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)平臺(tái),以“heart failure”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,獲得HF相關(guān){Wang,2021#1}靶點(diǎn),并使用UniProt匹配靶點(diǎn)全稱。

1.2 候選化合物篩選及靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

檢索TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[4]收集與HF靶點(diǎn)相關(guān)的化合物信息。根據(jù)ADME參數(shù)及Lipinski規(guī)則對(duì)候選化合物進(jìn)行篩選。通過(guò)查詢文獻(xiàn)對(duì)刪除的化合物活性進(jìn)行逐一確認(rèn),補(bǔ)充相關(guān)活性化合物。以上所得化合物視為候選化合物。使用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-候選化合物網(wǎng)絡(luò)。

1.3 中藥篩選及靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

檢索TCMSP收集含有候選化合物的中藥,構(gòu)建化合物-中藥網(wǎng)絡(luò),結(jié)合靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape3.8.0構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)以確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),初步評(píng)估中藥及相關(guān)化合物對(duì)HF的調(diào)節(jié)作用。

1.4 中藥類別及性味歸經(jīng)分析

查詢2020版《中華人民共和國(guó)藥典》[5]、第3版《全國(guó)中草藥匯編》[6]、全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材第十一版《中藥學(xué)》獲取“1.3”項(xiàng)下中藥類別及性味歸經(jīng)信息,并進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。在上述資料中無(wú)相關(guān)信息時(shí)不予統(tǒng)計(jì)該藥。

1.5 靶點(diǎn)-候選化合物分子對(duì)接

選取“靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)”中度值排名前5位的核心靶點(diǎn)作為受體,與網(wǎng)絡(luò)中的核心成分進(jìn)行分子對(duì)接。

查詢RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.pdbus.org/),選取5種蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。使用AutoDock Tools 1.5.6及PyMOL 2.3對(duì)蛋白晶體、化合物進(jìn)行刪除原始配體、去水、加氫等前處理,保存為.pdbqt格式文件。運(yùn)用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)受體與化合物配體的結(jié)合模式和結(jié)合能值。

2 結(jié)果

2.1 心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)

通過(guò)GeneCard、OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得HF相關(guān)靶點(diǎn)54、133、65、109個(gè),將靶點(diǎn)去重處理并經(jīng)UniProt規(guī)范,獲得HF相關(guān)靶點(diǎn)323個(gè),查詢TCMSP有對(duì)應(yīng)化合物的靶點(diǎn)有69個(gè),經(jīng)ADME及Lipinski規(guī)則篩選后所得化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)有35個(gè),分別是ADRA2C、ADRB1、ADRB2、PTGS2、SCN5A、CHRM4、KCNH2、IL6、LTA4H、TNF、NR3C2、BIRC5、CXCL2、CYP1A1、CYP3A4、GJA1、HIF1A、HSF1、MAPK1、MMP2、MMP3、PPARG、TP53、XDH、CYP2C9、EDN1、ECE1、BMPR2、CD36、CES1、ACLY、NOX1、FOSL1、OLR1、SLC12A1,將它們定義為潛在靶點(diǎn)。

2.2 候選化合物及靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)檢索TCMSP平臺(tái),323個(gè)HF靶點(diǎn)中有69個(gè)能關(guān)聯(lián)到中藥成分,關(guān)聯(lián)化合物共計(jì)4090個(gè)。關(guān)聯(lián)化合物經(jīng)過(guò)ADME參數(shù)及Lipinski規(guī)則篩選,并通過(guò)查詢文獻(xiàn)補(bǔ)充4個(gè)活性化合物,共篩選得到891個(gè)候選化合物。構(gòu)建潛在靶點(diǎn)與候選化合物的靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò),得到度值前9的化合物為槲皮素、丹參酮ⅡA、木犀草素、胡椒堿、卡維丁、異胡椒脂堿、牡丹草堿、育亨賓堿、隱丹參酮,這些化合物可作用于多個(gè)HF相關(guān)靶點(diǎn)而具有較強(qiáng)活性,可考慮對(duì)其進(jìn)一步深入研究。度值排前9的靶點(diǎn)為PTGS2、SCN5A、ADRB2、KCNH2、NR3C2、CHRM4、ADRA2C、ADRB1、LTA4H,分別對(duì)應(yīng)735、395、267、163、133、87、45、43、35個(gè)化合物,與HF發(fā)生機(jī)制相關(guān)性較高,可作為進(jìn)一步研究的主要靶點(diǎn)。

2.3 匹配中藥及靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)

891個(gè)候選化合物在TCMSP平臺(tái)關(guān)聯(lián)得到445味中藥,根據(jù)關(guān)聯(lián)關(guān)系構(gòu)建化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)。其中度值前11的中藥為甘草、丹參、鉤藤、黃芩、延胡索、板藍(lán)根、降香、半枝蓮、苦參、白屈菜、苦地丁,分別含候選化合物65、43、29、27、26、22、22、21、21、19、19個(gè)。通過(guò)候選化合物橋接作用統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)≥24的中藥有21個(gè),分別為銀杏葉、延胡索、白果、半枝蓮、大棗、甘草、紅芪、黃柏、黃連、金盞菊花、沒(méi)藥、木蝴蝶、青蒿、沙棘、山楂葉、土茯苓、菟絲子、夏枯草、香附、洋金花、皂角刺,推測(cè)這21種中藥對(duì)HF有干預(yù)作用,可為臨床遣方用藥及試驗(yàn)研究提供支撐信息。

對(duì)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)≥24的中藥及其關(guān)聯(lián)化合物、靶點(diǎn)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖1。圖中節(jié)點(diǎn)大小與度值正相關(guān),圓形代表化合物,菱形代表靶點(diǎn),六邊形代表中藥。

圖1 靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)圖(中藥關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)≥24)

2.4 中藥類別及性味歸經(jīng)

對(duì)445味中藥的類別及性味歸經(jīng)進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示潛在可干預(yù)HF的中藥類別以清熱藥(17.3%)、補(bǔ)虛藥(11.6%)、化痰止咳平喘藥(10.6%)、解表藥(8.5%)、利水滲濕藥(7.9%)、活血化瘀藥(7.0%)、理氣藥(7.0%)為主,上述七類中藥累計(jì)占比69.9%。藥味頻率較高者為苦、辛、甘,藥性寒溫并重。歸經(jīng)方面,肝經(jīng)占比最高(47.0%),其次為肺經(jīng)(38.0%)、胃經(jīng)(30.8%),具體頻次見(jiàn)圖2。

圖2 干預(yù)心力衰竭中藥歸經(jīng)分布

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

30個(gè)核心成分(Degree≥6)與5個(gè)核心靶點(diǎn)PTGS2(PDB ID:5IKQ)、SCN5A(PDB ID:4DCK)、ADRB2(PDB ID:6PS2)、KCNH2(PDB ID:6SYG)、NR3C2(PDB ID:3VHV)的對(duì)接得分見(jiàn)對(duì)接得分熱圖3。

圖3 干預(yù)心力衰竭潛在核心成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接得分熱圖

150組對(duì)接組合中,有99組為靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)中的組合,其中有60組Affinity<-7.0 kcal/mol,對(duì)接得分最高的是PTGS2-alpha-berbine(-10.0 kcal/mol),得分最低的是KCNH2-leonticine(-5.4 kcal/mol),網(wǎng)內(nèi)99個(gè)組合平均對(duì)接得分-7.5 kcal/mol,表明潛在核心成分與核心靶點(diǎn)之間可能有較好的對(duì)接活性。51組網(wǎng)外組合中,有20組Affinity<-7.0 kcal/mol,Affinity前3位的是NR3C2-luteolin(-9.1 kcal/mol)、NR3C2-6-Methoxyflavone(-9.1 kcal/mol)、NR3C2-fisetin(-9.0kcal/mol)。

綜合考慮分子對(duì)接Affinity值及成分在網(wǎng)絡(luò)中的度值,選擇其中4組進(jìn)行可視化展示,見(jiàn)圖4。

A:PTGS2與quercetin分子對(duì)接模型

3 討論

中醫(yī)用藥講究臨證化裁,加上中藥成分具有復(fù)雜性,對(duì)人體疾病的調(diào)節(jié)往往是多靶點(diǎn)、多通路的,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可系統(tǒng)、整體、高效的分析疾病與藥物涉及靶點(diǎn)的相關(guān)性,有助于揭示中醫(yī)藥治療心衰的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

本文對(duì)HF靶點(diǎn)進(jìn)行了較為全面的收集整理,篩選出35個(gè)潛在靶點(diǎn),其中能關(guān)聯(lián)較多候選化合物的靶點(diǎn)有PTGS2、SCN5A、ADRB2、KCNH2、NR3C2、CHRM4、ADRA2C、ADRB1等,已有研究表明這些靶點(diǎn)與HF之間存在相關(guān)性。例如由PTGS2編碼的環(huán)氧合酶2(COX2)在非缺血性HF患者中具有高表達(dá)水平[7]。SCN5A編碼的電壓門(mén)控鈉離子通道(Nav1.5)是心臟中表達(dá)的主要電壓門(mén)控鈉通道,該通道通過(guò)產(chǎn)生快速鈉內(nèi)流啟動(dòng)心臟動(dòng)作電位,Nav1.5功能障礙與包括HF在內(nèi)的多種先天性或獲得性心臟病相關(guān)[8]。

本研究在全面收集整理HF靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上,篩選出能作用于較多HF靶點(diǎn)的化合物有槲皮素、丹參酮ⅡA、木犀草素、隱丹參酮等。有研究表明,槲皮素可能通過(guò)SIRT5促進(jìn)IDH2的去琥珀酸化,維持線粒體穩(wěn)態(tài),保護(hù)炎癥狀態(tài)下的小鼠心肌細(xì)胞,并改善心肌纖維化,從而降低HF的發(fā)生率[9]。丹參酮ⅡA通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和激活A(yù)MPK-mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬保護(hù)心肌細(xì)胞并改善心臟功能,抑制氧化應(yīng)激改善HF大鼠的心功能障礙和纖維化[10]。

為更深一步評(píng)估上述核心靶點(diǎn)及成分之間的結(jié)合活性,本研究利用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接技術(shù)做了進(jìn)一步驗(yàn)證。所選取的度值排名靠前的核心靶點(diǎn)與核心成分的分子對(duì)接結(jié)果顯示,大多數(shù)靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的成分和靶點(diǎn)之間有著強(qiáng)結(jié)合力,進(jìn)一步驗(yàn)證了本文構(gòu)建的靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)具有一定的預(yù)測(cè)意義,可為進(jìn)一步研究中藥治療HF的有效成分提供參考。

通過(guò)構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò),得到了能映射較多HF靶點(diǎn)的銀杏葉、延胡索、白果、半枝蓮等21種中藥,推測(cè)這些中藥對(duì)HF具有干預(yù)作用。

在中藥類別分析部分有意思的是,頻次靠前中藥還出現(xiàn)了清熱藥、解表藥,并且清熱藥占比最高,這些清熱藥、解表藥在治療HF方面是否真正具有臨床應(yīng)用價(jià)值及如何讓HF患者獲益尚值得進(jìn)一步研究。性味歸經(jīng)方面,潛在可干預(yù)HF的中藥藥味以苦、辛、甘為多,歸經(jīng)以肝、肺經(jīng)為主。性味歸經(jīng)頻數(shù)分析結(jié)果與中醫(yī)治療HF時(shí)使用益氣養(yǎng)陰或益氣溫陽(yáng)固本,活血、利水、化痰治標(biāo)的治療大法相一致,可為進(jìn)一步解釋中醫(yī)藥治療HF的作用機(jī)制提供參考。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、數(shù)據(jù)挖掘及分子對(duì)接等研究方法,較為系統(tǒng)的探討了中醫(yī)藥治療HF可能的物質(zhì)基礎(chǔ)及用藥規(guī)律,可為臨床治療HF及相關(guān)藥學(xué)研究提供參考。但因?yàn)楸狙芯繑?shù)據(jù)基本來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)及通過(guò)軟件計(jì)算所得,后續(xù)可嘗試選取映射靶點(diǎn)多的中藥,通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)其發(fā)揮抗HF作用的物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理作用、量效關(guān)系等作進(jìn)一步研究。