陳維,陳玉珍,方子文,楊林幅,王國燮,徐海平,牙紅連,彭浩強,蒙蘭青

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科,廣西 百色 533000)

腦卒中是常見的腦血管疾病,分為缺血性卒中和出血性卒中,其中缺血性卒中占80%[1],其發(fā)病機制復雜,不僅對中樞神經系統(tǒng)有影響,而且還影響胃腸道,如胃腸動力改變、便秘或大便性狀改變、腸道黏膜受損等腸道結構功能損害[2]。胃腸道不僅受自身腸道信號調節(jié),同時也受到中樞神經的調控;腸腦軸是腸道和大腦之間的雙向信號傳遞和關聯,在缺血性腦卒中的進展中腸腦軸具有重要作用,其中腸道屏障也是不可或缺的[3],因此保護腸道結構和功能對缺血性卒中治療具有重要意義。

三七總皂苷是中草藥三七的主要活性成分,實驗及臨床研究表明,三七總皂苷通過抗炎、抗氧化,保護血腦屏障等作用改善缺血性腦卒中再灌注損傷[4-5],發(fā)揮腦保護作用。三七總皂苷在缺血性腦卒中治療中是否作用于腸道,保護腸道結構,改善腸道功能,目前少見報道。為此,本試驗將探討三七總皂苷對缺血性腦卒中后腸道結構和功能的影響,為三七總皂苷治療缺血性腦卒中提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性SD大鼠(體重250～300 g,SPF級別)購自長沙天勤[動物合格證號:SCXK(湘)2019-0014]。將大鼠飼養(yǎng)在維持12 h光照/黑暗循環(huán),環(huán)境溫度保持在(24±2) ℃,濕度(55±15)%的屋子里,所有大鼠每天可自由飲水和進食,在實驗開始前適應性的喂養(yǎng)大鼠7 d。

1.2動物卒中模型和分組 將36只SPF級SD大鼠隨機分為3組:假手術組、模型組和治療組,3組繼續(xù)分為7 d和14 d兩個亞組,每個亞組6只。將大鼠麻醉后,頸正中切開皮膚,分離肌肉及筋膜,分離右側頸總動脈和頸內外動脈,結扎頸總動脈遠端及頸外動脈近分叉口處,在頸總動脈開小口放入線栓栓塞頸內動脈,固定線栓,縫合頸部皮膚,2 h后取出線栓,觀察大鼠。假手術組只開頸部皮膚,分離頸總動脈和頸內外動脈,不穿刺,然后縫合頸部皮膚。治療組腹腔注射三七總皂苷(100 mg/kg劑量,每天1次,分別給藥7 d和14 d),其他兩組給予相同劑量的生理鹽水。每天記錄大鼠的體重和神經評分,神經功能評分按照Longa評分[6]:0分,無缺陷,活動正常,或提尾倒掛時大鼠雙前肢對稱伸向地面;1分,提尾時不能完全伸展病灶對側前肢;2分,行走向對側轉圈;3分,站立不穩(wěn)、向偏癱側傾倒;4分,不能主動行走,意識喪失。1～3分視為制模成功。

1.3組織學檢查 取出大鼠小腸1 cm,用多聚甲醛固定并包埋在石蠟中,切成3 μm切片,然后用蘇木素和伊紅染色,在光學顯微鏡下由病理醫(yī)生在不知情的情況下評分,小腸黏膜損傷以Chiu’s為評分標準[7]。黏膜損傷的Chiu病理評分量表用于評估每個1 mm的10個切片的組織學改變程度,然后取平均值。量表由0～5的值組成,其中0為正常小腸黏膜絨毛;1為在絨毛中軸出現腸黏膜上皮下的間隙,常常伴隨毛細血管充血;2為來自固有膜的腸黏膜上皮抬高以及腸上皮下間隙的擴張;3為大片腸黏膜上皮抬高,絨毛向兩側倒伏,偶有裸露的絨毛尖端;4為裸露的絨毛有外露的固有層和擴張的毛細血管,可看到固有膜細胞成分構成增加;5為固有膜蛻變或被消化,出血或潰瘍形成。

1.4免疫組織化學 切取3 μm的切片在60 ℃烘箱烘烤1～2 h,再經過二甲苯(10 min)-二甲苯(10 min)-二甲苯(10 min)-無水酒精(5 min)-90%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min),取出切片用蒸餾水沖洗1 min,置于PBS緩沖液中。檸檬酸鈉緩沖液中進行高溫抗原修復(100 ℃,20 min),修復后冷卻至常溫,用PBS洗滌(3 min×3次),滴加內源性過氧化物酶阻斷劑,室溫孵育10 min,用PBS洗滌,將配制好的一抗滴加在組織上放置于4 ℃過夜,用PBS洗滌(3 min×3次),滴加酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物,37 ℃孵育20 min;用PBS洗滌(3 min×3次),用新鮮配置的DAB室溫孵育5 min,自來水沖洗,蘇木素染色液孵育20 s;分化、沖洗返藍;脫水、透明、中性樹脂封片,光學顯微鏡觀察(×200),隨機選取6個視野并拍照,棕色顆粒即為陽性表達。Image pro-plus軟件測定每個視野下的棕色顆粒的光密度(OD)值,計算平均值。

2 結果

2.1大鼠神經評分和體重監(jiān)測的變化 記錄每只大鼠不同天數的體重及神經評分,并繪制成圖,造模成功大鼠的神經功能評分維持在較高水平且體重呈下降趨勢;治療組與模型組比較,用藥后大鼠神經功能評分降低,神經功能改善且體重下降改善,見圖1。

注:Sham為假手術組,MCAO為模型組,PNs為三七總皂苷組 (n=6)。

2.2腸道病理學的變化 通過蘇木素和伊紅染色后觀察腸道病理學變化(放大倍數×100),結果顯示,在假手術組中,大鼠小腸絨毛排列整齊,上皮完整。模型組在7 d和14 d的腸道破壞、受損且恢復不佳,用藥后大鼠的腸道絨毛數量和形態(tài)都有所恢復,見圖2。在病理科醫(yī)生不知情的情況下進行評分,記錄每個圖片的分值并進行統(tǒng)計學計算,7 d和14 d模型組與假手術組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);治療組和模型組在7 d和14 d分別進行比較,差異亦具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

注:Sham為假手術組,MCAO為模型組,

2.3腸道Occludin和ZO-1蛋白表達量的變化情況 對腸道切片進行免疫組織化學,檢測緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的蛋白含量,Occludin蛋白主要在黏膜絨毛下連續(xù)均勻分布,假手術組Occludin蛋白分布均勻、連續(xù),模型組分布減少,治療后Occludin蛋白表達增加;ZO-1主要在腸上皮細胞中,假手術組中ZO-1分布均勻,模型組可見ZO-1蛋白表達減弱,分布不均,三七總皂苷治療后,ZO-1蛋白表達信號增強,見圖3。在不同時間點,模型組和假手術組比較,差異具有統(tǒng)計學意義;在不同時間點治療組和模型組兩兩比較,差異具有統(tǒng)計學意義,見表2。

表1 不同時間點大鼠腸道HE染色Chiu評分

3 討論

腸道是人體最大的消化系統(tǒng),包含消化、代謝調節(jié)和免疫等功能[8],同時腸也是創(chuàng)傷后應激的核心器官,在某些嚴重應激事件(燒傷、中暑、創(chuàng)傷、腦事件和移植等)中,可能會引發(fā)一系列腸道事件,包括腸道黏膜破壞、屏障功能障礙、腸道細菌和內毒素移位以及上消化道出血[2]。有實驗表明,缺血性中風不僅會改變腸道微生物,還會增加腸道屏障的滲透性[3]。

缺血性腦卒中后,自主神經系統(tǒng)失調降低腸動力,破壞腸黏膜屏障的完整性[9],導致卒中預后不良[10]。同時腸道微生物與腸道屏障密切接觸,腸道細菌在腸上皮的黏膜層棲息,當黏膜層破壞時會導致致病菌的入侵,在破壞腸道屏障同時激活腸道淋巴細胞,啟動免疫反應,進一步破壞腸道屏障。細菌的代謝物也會對腸道屏障產生影響,當缺血性腦卒中發(fā)生后腸道的致病菌增多并伴代謝產物的變化,而細菌代謝產物也參與了中風后腸道屏障的破壞[11]。腸屏障主要分為機械屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障[12],腸上皮細胞及細胞之間的緊密連接構成腸道的物理屏障。腸道的緊密連接形成蛋白質膜是細胞間連接的一個重要形式,是構成黏膜機械屏障的最重要結構,調節(jié)哺乳動物細胞間離子和溶質的擴散。緊密連接包括跨膜蛋白,如Claudin、Occludin和連接黏附分子-A(JAM-A),以及細胞內斑塊蛋白,如閉塞帶(ZOs)和扣帶蛋白[9,13]。Occludin是跨膜蛋白的胞內結構域,與細胞質斑塊蛋白相關,為緊密連接提供了結構支架。緊密連接中的支架分子包括ZOs和Cinglin。Occludin和許多Claudin亞型與ZOs(ZO-1,ZO-2,ZO-3)的N端的多結構域結合,而ZO的C端區(qū)域與肌動蛋白細胞骨架相互作用,而細胞骨架與緊密連接結構的關聯對緊密連接功能的調節(jié)和維持至關重要[14]。

注:Sham為假手術組,MCAO為模型組,PNs為三七總皂苷組 (n=6)。

表2 大鼠腸道不同時間段Occludin和ZO-1蛋白的組織免疫化學OD值

緊密連接對于腸道屏障的通透性非常重要,破壞后腸道內外穩(wěn)態(tài)失衡,菌群發(fā)生移位,有害物質能夠穿透腸壁,由腸道轉移至血液中,導致免疫炎性反應激活,釋放大量炎性因子,這些炎性因子隨血液循環(huán)穿過血腦屏障,加重缺血性腦損傷[2,15-16]。本實驗發(fā)現:缺血性腦卒中后腸道絨毛數量減少、形態(tài)破壞,腸道屏障受損,Occludin和ZO-1蛋白的表達量減少,動物神經功能評分增加、體重下降,且腸道屏障受損嚴重程度和神經評分呈正相關。經三七總皂苷治療后腸道Occludin和ZO-1蛋白表達有所增加,腸道形態(tài)趨于正常,絨毛數量明顯增加,提示三七總皂苷治療缺血性腦卒中作用機制可能與保護腸道功能,維持腸道內外穩(wěn)態(tài)有關,防止有毒有害物質吸收入血,減輕腦缺血后炎癥反應,改善癥狀及神經功能,達到治療疾病的目的。