周尚,劉燕,羅文琳,黃蘭松,黃照河

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000)

隨著社會經(jīng)濟水平、科技的發(fā)展,人們飲食習慣的改變,心血管疾病的發(fā)病率不斷上升,心血管病死亡占我國居民總死亡原因的首位[1]。急性心肌梗死(AMI)是一種嚴重威脅生命的心血管疾病,由冠狀動脈閉塞導致的長期缺血和缺氧損害心臟功能。急性心肌梗死的早期治療可恢復缺血心肌的血液供應(yīng)并降低死亡風險,但當中斷的心肌供血在一定時間內(nèi)恢復時,對原有缺血心肌造成更嚴重的損傷,這被稱為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[2-3]。盡管對MIRI的研究已經(jīng)很久,但是MIRI作為一個重要的臨床問題至今沒有有效的治療手段。對MIRI損傷的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的詳細分子機制仍未完全闡明。因此,了解MIRI的潛在分子機制并為其預(yù)防和治療制定新的治療策略至關(guān)重要。

龍血竭做為我國傳統(tǒng)中藥,是龍舌蘭科植物劍葉龍血樹的乙醇提取物。龍血竭總黃酮(sanguis draconis flavones,SDF)是從龍血竭中提取得到的主要成分,包括黃酮、二氫黃酮、黃烷、查耳酮、二氫查耳酮等多種化合物。研究顯示它具有抑制血小板活性和血栓形成,對心肌缺血有改善等作用[4]。大量研究實驗證實SDF對MIRI具有保護作用[5-6]。PI3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)多種細胞功能的重要通路之一,在許多生理過程和病理反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控細胞增殖、細胞周期阻滯、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)組織炎癥等[7-9]。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號通路與MIRI密切相關(guān),激活PI3K/AKT信號通路可以減少心臟MIRI[10]。細胞凋亡是由細胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物調(diào)節(jié)的程序性細胞死亡的一種方式,其中線粒體凋亡通路是細胞凋亡的主要通路。線粒體通路涉及Bcl-2家族的促凋亡成員與線粒體的聯(lián)合,誘導細胞色素C及其其他細胞凋亡因子釋放入細胞質(zhì),繼而激活Caspase-3導致細胞凋亡[11],Caspase-3是細胞凋亡關(guān)鍵的調(diào)控因子[12]。PI3K/AKT通路的活性對MIRI有多種影響,特別是,它對與線粒體相關(guān)的I/R損傷具有抗凋亡作用[8],因此,激活PI3K/AKT信號通路已成為減少MIRI的有效策略[13-14]。課題組前期研究表明龍血竭總黃酮可以保護MIRI[15],但其保護作用是否通過激活PI3K/AKT信號通路以減少細胞凋亡尚不清楚。本研究通過建立大鼠MIRI模型,探討龍血竭總黃酮對大鼠MIRI心肌細胞PI3K/AKT通路的影響,為SDF治療MIRI提供新的見解,并可能為MIRI治療提供新的靶點。

1 材料

1.1藥材及試劑 SDF由廣西中醫(yī)藥研究院提供。用紫外分光光度法測定其中總黃酮含量在70%以上,使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成濃度分別為9 mg/mL、18 mg/mL、27 mg/mL、36 mg/mL的SDF混懸液備用。56只SD雄性大鼠(6～8周齡,250～350 g)由北京維通利爾動物實驗有限公司提供[證書編號:SCXK(粵)2022-0063,廣東,中國],可自由獲得食物和水,室溫保持在20～25℃。本次研究得到了右江民族醫(yī)學院倫理委員會的批準。蘇木素染色液及伊紅染色液(長春賽默瑞特科技有限公司);2%TTC染色液(北京雷根生物有限公司);PI3K抗體、AKT抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、羊抗兔IgG-HRP(四川正能生物公司);Caspase-3抗體(英國Abcam公司);RIPA裂解液、蛋白酶抑制混合物、抗體稀釋液、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、TBST洗膜液、BCA(bicinchoninicacid)蛋白定量試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(中國上海碧云天生物技術(shù)公司);硝酸纖維素膜(PVDF)(美國Millpore公司)。

1.2儀器 DW3000型小動物人工呼吸機(上海玉研儀器設(shè)備有限公司);小動物心電圖機(廣州三銳電子科技有限公司);冷凍離心機(上海中康儀器有限公司);顯微鏡(上海儀圓光學器有限公司);恒溫烘箱(日本松下公司);石蠟切片機(美國賽默飛公司);攤片機(美國賽默飛公司);冰凍切片機(美國賽默飛公司);脫水機(美國賽默飛公司);Western blot系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);通用凝膠成像系統(tǒng)(美國通用公司);高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技公司);酶標儀(德國珀金埃爾默公司)等。

1.3MIRI大鼠建立模型、分組和處理 大鼠被隨機分為7組(每組8只):①Control組;②Sham組;③缺血/再灌注組(I/R組);④龍血竭總黃酮低劑量+缺血再灌注組(SDF-L組);⑤龍血竭總黃酮中劑量+缺血再灌注組(SDF-M組);⑥龍血竭總黃酮高劑量+缺血再灌注組(SDF-H組);⑦龍血竭總黃酮大劑量+缺血再灌注組(SDF-B組)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,龍血竭總黃酮混懸液按低劑量用藥組(90 mg/kg)、中劑量用藥組(180 mg/kg)、高劑量用藥組(270 mg/kg)、大劑量用藥組(360 mg/kg)灌胃預(yù)處理14 d,Sham組和I/R組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃14 d,Control組正常喂食。灌滿14 d后I/R組及不同劑量龍血竭用藥組大鼠開始建立MIRI模型,MIRI模型是根據(jù)梁麗梅等[16-17]的研究建立的。簡而言之,腹腔注射10%烏拉坦(0.5 mL/100 mg)麻醉大鼠。麻醉后,予氣管插管連接小動物呼吸機機械通氣后,切開大鼠胸壁,用6-0絲線,結(jié)扎冠狀動脈左前降支,缺血30 min后,松開繩結(jié)進行再灌注2 h。Sham組的小鼠穿針但不結(jié)扎冠狀動脈左前降支,用藥組的大鼠與I/R組的操作相同。心肌缺血再灌注造模成功標準:結(jié)扎后,心尖組織發(fā)白或呈暗灰色,心電圖ST段明顯抬高,T波高聳為缺血成功;松開繩結(jié)后,心尖缺血區(qū)顏色變紅,ST回落1/2為再灌注成功。大鼠相關(guān)組織取材后立即予放置-80℃冰箱存放。共有56只大鼠進行造模取材,在造模取材過程中,Sham組、SDF-L組大鼠因室顫和其他原因?qū)е滤劳?只,剩余52只大鼠。

1.4心電圖監(jiān)測 使用小動物心電圖機的電極插入大鼠右上、下肢及左下肢皮下,觀察心電圖Ⅱ?qū)?lián)。觀察并記錄大鼠心電圖ST段變化。

1.5血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的測定 將血清于-80 ℃冰箱取出后,4 ℃溶解后適當稀釋,按照相應(yīng)試劑盒說明書嚴格操作,根據(jù)ELISA制造商的說明書測定血清LDH和CK-MB含量。

1.6心肌梗死面積大小測量 三苯基氯化四氮唑(TTC)染色被用來確定大鼠MIRI損傷后的梗塞大小。在MIRI后,大鼠心臟被切除,并切成2 mm的片狀。用2%TTC對組織切片進行染色,在37 ℃下避光孵育30 min,期間予多次翻面,達到充分浸潤,后用4%多聚甲醛固定,然后檢測心肌梗死面積。白色區(qū)域表示心肌梗死的大小;紅色區(qū)域表示非缺血區(qū)域。最后,用ImageJ軟件計算梗死的大小。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色檢測心肌組織形態(tài)學變化 取血后,迅速分離大鼠心臟1/3到2/3的尖部進行石蠟切片。切片經(jīng)脫水處理后, 用蘇木素和伊紅進行染色之后,對切片進行脫水、清理、密封。在顯微鏡下觀察心臟病理學改變。

1.8Western Blot檢測PI3K、AKT的蛋白含量 大鼠腹主動脈取血后,分離心臟,提取左心室心肌組織總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,調(diào)整各組蛋白濃度。等量蛋白(30 μg)進行SDS-PAGE凝膠電泳分離,濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%BSA室溫封閉2 h,接著加入相應(yīng)的一抗抗體(稀釋比例1∶1000),4 ℃孵育過夜,1×TBST洗膜3次,每次10 min,加入HRP標記的二抗(稀釋比例1∶5000)室溫孵育2 h。洗膜3次,每次10 min后,在GE凝膠成像系統(tǒng)中采用超敏ECL化學發(fā)光液檢測蛋白條帶,以GAPDH為內(nèi)參,使用ImageJ軟件對目的條帶進行灰度分析,以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1大鼠心電圖變化情況 冠狀動脈結(jié)扎前開始連續(xù)監(jiān)測并記錄大鼠心電圖至再灌注2 h后,觀察Ⅱ?qū)?lián)T波和ST段的變化。比較冠脈結(jié)扎前后的心電圖,結(jié)扎后ST段可見弓背向上抬高,再灌注時的ST段逐漸向下回落,最終接近基線水平,說明大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立成功。見圖1。

圖1 大鼠心電圖

2.2龍血竭總黃酮對MIRI大鼠血清LDH和CK-MB含量的影響 與Sham組相比,I/R組、SDF-L組、SDF-M組、SDF-H組及SDF-B組大鼠血清LDH和CK-MB含量顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與I/R組相比,SDF-L組、SDF-M組、SDF-H組及SDF-B組大鼠血清LDH和CK-MB含量顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清LDH和CK-MB水平的比較 單位:U/L

2.3龍血竭總黃酮對MIRI大鼠心肌梗死面積的影響 Control組與Sham組相比,大鼠心肌梗死面積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Sham組相比,I/R組、SDF-L組、SDF-M組、SDF-H組、SDF-B組大鼠心肌梗死面積顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與I/R組相比,SDF-L組、SDF-M組、SDF-H組、SDF-B組大鼠心肌梗死面積顯著減輕,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各用藥劑量組之間相比,大鼠心肌梗死面積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、圖3。

圖2 TTC染色法測定各組大鼠心肌梗死范圍圖

注:與Sham組比較,*P<0.05,與I/R組比較,**P<0.01。

2.4龍血竭總黃酮對MIRI大鼠心肌病理形態(tài)學的影響 光鏡下觀察Control組和Sham組大鼠心臟切片,心肌細胞排列整齊致密,細胞結(jié)構(gòu)完整,邊界清晰,心肌纖維排列整齊,未見變性、壞死、炎性細胞浸潤,心肌細胞分布有序。相反,I/R組心肌細胞結(jié)構(gòu)不完整,心肌細胞紊亂,細胞變性、壞死和炎癥細胞浸潤程度明顯。SDF-L組心肌纖維排列紊亂,細胞水腫,可見炎性細胞浸潤。SDF-M組心肌細胞腫脹,無空泡樣變性,細胞核完整,心肌細胞排列輕度紊亂,間質(zhì)輕度水腫。SDF-H組心肌纖維排列規(guī)則,少量心肌纖維化,胞漿染色不均勻,心肌纖維間隙未見明顯炎性細胞浸潤。SDF-B組肌纖維排列規(guī)則,可見心肌纖維化,胞漿染色不均勻,肌纖維間隙無明顯炎性細胞浸潤。與I/R組比較,各劑量組大鼠心肌細胞腫脹減輕,細胞變性、壞死和炎性細胞浸潤也減少損傷癥狀明顯減輕。見圖4。

圖4 各組大鼠HE染色圖(×400)

2.5龍血竭總黃酮對MIRI大鼠心肌組織PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表達的影響 Control組與Sham組PI3K、AKT蛋白含量無差異(P>0.05);與Sham組比較,I/R組PI3K、AKT蛋白含量均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與I/R組比較,SDF-M組、SDF-H組及SDF-B組PI3K、AKT蛋白含量明顯升高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與Sham組比較,I/R組大鼠心肌組織Caspase-3表達明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與I/R組比較,SDF-M組、SDF-H組及SDF-B組Caspase-3蛋白含量出現(xiàn)減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),各劑量組之間相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5A、圖5B。

注:A.Western Blot法檢測各組大鼠PI3K、AKT、Caspase-3蛋白水平情況;B.各組大鼠蛋白表達水平的比較。*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

MIRI的機制極其復雜,迄今為止,人們都未能闡明其作用的機制。主流的觀點認為,自由基和促炎細胞因子的過量產(chǎn)生,細胞凋亡的增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激都參與了MIRI的發(fā)生和發(fā)展[18]。心肌I/R損傷可導致心力衰竭和心肌炎癥等預(yù)后不良,觸發(fā)室性心律失常可能導致心肌梗死加重[19]。細胞凋亡是由細胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物調(diào)節(jié)的程序性細胞死亡的一種方式[20]。細胞凋亡參與MIRI的病理生理過程,研究表明,MIRI以多種方式誘導細胞凋亡,包括Bax水平升高,Bcl-2水平降低以及抑制PI3K/AKT途徑的激活[21]。防止心肌細胞凋亡作為保護心肌免受MIRI損害的新靶點,引起了越來越多的關(guān)注。

PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)體內(nèi)多種細胞活動,大量研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路的激活對于抑制MIRI期間心肌細胞凋亡至關(guān)重要[22]。能夠?qū)ax、Bad、Caspase-3等促凋亡基因的表達產(chǎn)生抑制作用,而對抗凋亡基因Bcl-2的表達產(chǎn)生促進作用[23-24],從而發(fā)揮抗凋亡作用,減輕心肌損傷。而當缺血缺氧、缺血再灌注等病理因素作用于細胞時,內(nèi)源性途徑啟動線粒體介導的細胞凋亡,激活Bcl-2家族蛋白,促使線粒體釋放細胞色素C,進一步激活Caspase-3,Caspase-3通過直接切割細胞核和細胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白來完成細胞凋亡的過程,誘導細胞凋亡,是細胞凋亡中的一個重要的調(diào)控因子[25]。因此,抑制Caspase-3蛋白的表達可以顯著減輕MIRI,當出現(xiàn)MIRI時,PI3K/AKT通路受到抑制并使其抗凋亡作用減弱。大量研究證實龍血竭總黃酮具有抗炎、抗血小板聚集、抑制細胞凋亡等作用[4,15,26-27]。其在MIRI時通過激活PI3K/AKT信號通路抑制細胞凋亡。MIRI過程中,蛋白水解酶活性發(fā)生變化,細胞膜通透性增加,影響心肌細胞代謝的關(guān)鍵酶LDH和CK-MB從胞漿進入血液,增加其在血清中的含量。因此,常將其作為反映心肌細胞損傷程度的敏感指標。本實驗結(jié)果顯示,使用SDF預(yù)處理后,大鼠LDH和CK-MB水平下降、心肌梗死面積減少,TTC染色結(jié)果提示梗死面積縮小,均能顯著證實SDF對MIRI具有保護作用。與Sham組比較,I/R組的PI3K、AKT、蛋白含量下降,Caspase-3蛋白含量上升,說明在MIRI時,細胞凋亡通路被激活,大量細胞凋亡,并抑制了PI3K/AKT信號通路;相比于I/R組,SDF各劑量組PI3K、AKT蛋白表達明顯上升,且高劑量組PI3K、AKT蛋白上升顯著,Caspase-3蛋白表達下降,說明心肌細胞凋亡受到抑制,這可能與SDF激活PI3K/AKT信號通路途徑有關(guān)。綜上,SDF的抗凋亡作用在心腦血管疾病治療中具有獨特優(yōu)勢,但其有效化學成分復雜,目前的研究熱點依舊是有效成分的分析和提取。本實驗表明,SDF可激活PI3K/AKT通路,發(fā)揮抗凋亡作用,減少細胞凋亡,產(chǎn)生心肌保護功效。當然,MIRI發(fā)病機制較多,并且各通路間相互協(xié)同,目前對其具體保護機制尚不能明確。本實驗僅從PI3K/AKT信號通路角度,探討SDF與MIRI的關(guān)系,其具體機制還需進一步論證。

本研究表明SDF能改善大鼠MIRI,以龍血竭高劑量組療效最佳。SDF可降低心肌損傷標志物LDH、CK-MB的活性,減少心肌梗死面積,抑制心肌細胞凋亡,減輕心肌組織的病理損傷。綜上所述,SDF通過激活PI3K/AKT信號通路抑制心肌細胞凋亡,從而對MIRI大鼠心肌細胞發(fā)揮保護作用。