林鑫,黃群

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科,廣西 百色 533000)

膀胱癌(bladder cancer)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,約75%的初診患者為非肌層浸潤性膀胱癌[1]。其中約50%的非肌層浸潤性膀胱癌患者在接受經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后2年出現(xiàn)復發(fā),40%的病例在5年后進展為肌層浸潤性膀胱癌[2],而進展為浸潤性膀胱癌后的5年生存率約為57%[3]。肌層浸潤性膀胱癌的標準治療為根治性膀胱切除同時行盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),但50%的膀胱癌病例最終出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,且不同分子亞型的膀胱癌對各類治療手段的敏感性也存在很大差異[4]。PD-1/PD-L1抑制劑是近年來膀胱癌免疫治療的一次重大突破,顯示出較好的效果及良好的安全性,雖然可以通過PD-1表達量、膀胱癌分型等預測免疫治療效果,但仍有部分病人對PD-1/PD-L1抑制劑無反應(yīng)[5]。針對晚期膀胱癌患者的治療,仍需找到有效的治療靶點,指導治療方案的分子標志物。

Spectrin蛋白是細胞膜骨架的重要組成部分,由兩個α亞基和兩個β亞基形成絲狀四聚體結(jié)構(gòu),在維持胞膜完整性、介導細胞黏附及遷移等方面發(fā)揮重要作用[6]。非紅細胞血影蛋白β2(spectrin beta,non-erythrocytic 2,SPTBN2) 是Spectrin蛋白β-Ⅲ亞基的編碼基因,定位于染色體11q13[7]。既往研究發(fā)現(xiàn),SPTBN2在肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中出現(xiàn)不同程度的差異性表達[8-9]。有研究認為SPTBN2蛋白免疫組化結(jié)果可以作為一種潛在的診斷惡性周圍神經(jīng)鞘瘤的高敏感性指標[10]。在結(jié)直腸癌中,SPTBN2出現(xiàn)高表達,與淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。SPTBN2已被證明在多種腫瘤細胞中出現(xiàn)差異性表達且影響預后,但其在膀胱癌中的作用機制尚不明確,在膀胱癌細胞中的生物學作用目前國內(nèi)外少有報道。本研究旨在探討SPTBN2基因?qū)Π螂装?637細胞增殖、遷移和侵襲的作用,為研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料 人類膀胱癌細胞5637(武漢普諾塞生命科技有限公司);RPIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(美國gibco公司);siRNA、引物合成(蘇州吉瑪生物科技有限公司);Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司);Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(美國Coring公司);SYBR Green PCR Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司);CCK-8試劑盒(上海同仁生物科技有限公司);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、7.5 % PAGE凝膠快速制備盒、RIPA強效裂解液、ECL化學發(fā)光試劑盒(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);PVDF膜(美國Millipore公司);SPTBN2多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體、HRP標記羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2主要設(shè)備與儀器 生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱、離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司);LightCycle 96熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司);多功能酶標儀(美國Perkin Elmer公司);電泳轉(zhuǎn)移槽(美國BIO-RAD公司);AI600 化學發(fā)光成像儀(美國GE公司);倒置光學顯微鏡(德國Laica公司);超微量紫外分光光度計(北京天根生化科技有限公司)。

1.3細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將人類膀胱癌5637細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng),胰蛋白酶常規(guī)消化細胞以傳代,選擇對數(shù)生長期細胞進行下一步實驗。實驗分為空白對照組(blank control group,Blank組)、陰性對照組(negative control,NC組)、siRNA實驗組(siRNA#1組、siRNA#2組)。轉(zhuǎn)染前24 h,常規(guī)消化細胞,用完全培養(yǎng)基重懸細胞后進行細胞計數(shù),于6孔板中每孔接種3×105個細胞,待細胞密度至50%～70%時進行轉(zhuǎn)染。250 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別稀釋5 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑與5 μL siRNA,混合孵育20 min后加入至6孔板中,轉(zhuǎn)染體系總計為2 mL,陰性對照組轉(zhuǎn)染通用陰性序列siRNA,空白對照組中加入等量轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time PCR,qPCR) 轉(zhuǎn)染24 h后,用TRIzol法提取細胞總RNA,超微量紫外分光光度計測量總RNA濃度,取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,配制SYBR Green PCR Master Mix體系進行實時熒光定量PCR,反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,62 ℃ 60 s,共計40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法處理數(shù)據(jù),對相對表達量進行分析,進行3次以上重復實驗。SPTBN2上游引物:GCCCGCAACCTGCATACTAA,下游引物:AGCTCTCGCCCTTCCTTGTC,GAPDH上游引物:ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG,下游引物:GCCATCACGCCACAGTTTC。

1.5蛋白免疫印跡 (Western Blot) 轉(zhuǎn)染48 h后用RIPA強效裂解液提取細胞總蛋白,BCA法進行蛋白定量,加入足量SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后煮沸10 min。每孔蛋白上樣量為30 μg。7.5% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白,SPTBN2蛋白轉(zhuǎn)膜條件為恒流300 mA轉(zhuǎn)膜4 h,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h,用TBST清洗3次,每次5 min。各個條帶分別加入SPTBN2一抗(1∶3000)和GAPDH一抗(1∶5000),4 ℃搖床孵育過夜,用TBST清洗后加入二抗(1∶10000)孵育1 h,使用ECL試劑顯影,以GAPDH為內(nèi)參使用ImageJ軟件對結(jié)果進行分析。

1.6CCK-8增殖實驗 轉(zhuǎn)染后以胰蛋白酶常規(guī)消化細胞,用完全培養(yǎng)基重懸細胞,將細胞接種于96孔板中,細胞接種密度為2 000個/孔,每組設(shè)5個復孔,分別于細胞貼壁后0 h、24 h、48 h、72 h加入CCK-8試劑,37 ℃孵育2 h后使用酶標儀測量450 nm波長吸光度(OD值)。

1.7劃痕實驗 6孔板底部做3條平行橫線,以每孔4×105個細胞的密度接種于6孔板中,轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)48 h至細胞鋪滿,用200 μL槍頭垂直于孔板表面畫下劃痕,吸出培養(yǎng)基后以PBS緩沖液清洗兩遍,加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)基,取5個視野于倒置顯微鏡下拍照,并于24 h后再次拍照記錄,使用ImageJ軟件分析,計算劃痕愈合率,劃痕愈合率=(初始劃痕寬度值-對應(yīng)時間點劃痕寬度值)/初始劃痕寬度值。

1.8Transwell侵襲實驗 Matrigel基質(zhì)膠中加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至500 mg/mL,每個Transwell小室中分別加入100 μL基質(zhì)膠,置于37 ℃培養(yǎng)箱中3 h,細胞轉(zhuǎn)染后常規(guī)消化,使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞調(diào)整細胞濃度至5×105/mL,每個小室上層加入100 μL細胞懸液,在下室內(nèi)加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用4%多聚甲醛固定15 min,用棉簽輕輕拭去上室中的基質(zhì)膠,結(jié)晶紫染色15 min后,用PBS清洗兩遍,于倒置顯微鏡下拍照,使用Image J軟件計算透過濾膜的細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1構(gòu)建SPTBN2低表達細胞株 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染SPTBN2 siRNA的5637膀胱癌細胞中SPTBN2 mRNA表達水平較空白對照組和陰性對照組降低(見圖1),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)?？瞻讓φ战M和陰性對照組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Western Blot結(jié)果顯示,實驗組的SPTBN2蛋白表達量明顯低于對照組(見圖2),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),空白對照組和陰性對照組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.2敲低SPTBN2抑制膀胱癌5637細胞的增殖 CCK-8實驗結(jié)果顯示,48 h起,實驗組的OD值低于陰性對照組(P<0.001),72 h各組細胞的OD值低于陰性對照組(見圖3),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注:與Blank組相比,**P<0.01。

圖3 CCK-8法檢測細胞增殖的結(jié)果

表1 CCK-8法檢測細胞增殖的結(jié)果

2.3SPTBN2對膀胱癌遷移、侵襲能力的影響 經(jīng)過siRNA處理的兩組細胞,24 h的遷移率低于陰性對照組(見圖4),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。Transwell侵襲實驗顯示,實驗組細胞穿透至下室的數(shù)量較陰性對照組明顯減少(見圖5),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

圖4 劃痕實驗結(jié)果(×40)

表2 劃痕實驗愈合百分比

圖5 Transwell侵襲實驗結(jié)果(×100)

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,患者的不良預后與腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和化療耐藥相關(guān),因此,有必要了解膀胱癌發(fā)展的分子機制和尋找有效的腫瘤標志物,以開發(fā)新的治療靶點[12]。腫瘤組織中SPTBN2高表達提示預后不良,這在肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥中均有報道。本研究發(fā)現(xiàn),在人類膀胱癌5637細胞中沉默SPTBN2的表達能抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,提示SPTBN2對膀胱癌的發(fā)展具有重要作用。

表3 Transwell實驗侵襲細胞數(shù)

SPTBN2是Spectrin蛋白β-Ⅲ亞基的編碼基因,定位于染色體11q13,SPTBN2參與維持細胞正常形態(tài)和功能,同時還是細胞高爾基體膜的主要組成部分[7]。SALCEDO-SICILIA L等[13]研究發(fā)現(xiàn),SPTBN2在維持高爾基體膜結(jié)構(gòu)完整性和調(diào)控蛋白分泌中發(fā)揮重要作用,SPTBN2編碼的蛋白主要富集于高爾基體的遠端膜囊,維持高爾基體結(jié)構(gòu)完整性和分泌活性,完全去除SPTBN2可導致高爾基體裂解。此外,SPTBN2還參與細胞信號通路的傳導,SPTBN2可通過穩(wěn)定細胞膜表面興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體4(excitatory amino acid transporter 4, EAAT4)以調(diào)控谷氨酸信號通路[14]。在小鼠模型中,SPTBN2缺失能引起浦肯野細胞中鈉離子電流減少及谷氨酸信號通路發(fā)生改變[15]。針對SPTBN2與疾病的研究主要集中在神經(jīng)退行性疾病如脊髓小腦性共濟失調(diào)、認知障礙等方面[16]。SPTBN2蛋白可與肌動蛋白絲結(jié)合,形成SPTBN2收縮蛋白-肌動蛋白骨架,SPTBN2基因突變促使SPTBN2蛋白與肌動蛋白絲親和力增加而導致5型脊髓小腦性共濟失調(diào)[17]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),在肺腺癌中,SPTBN2表達量與肺癌患者預后顯著相關(guān), SPTBN2可促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[8]。在結(jié)直腸癌中,SPTBN2可通過m6A修飾促進翻譯從而促使腫瘤惡性轉(zhuǎn)化[11]。甲狀腺癌細胞敲低SPTBN2后,甲狀腺癌細胞株的增殖、遷移能力和細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化被抑制,凋亡細胞比例增加,同時細胞周期抑制蛋白P21,cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3、Bax等凋亡相關(guān)蛋白表達增加,說明SPTBN2在甲狀腺癌細胞中可能參與細胞周期轉(zhuǎn)換,抑制腫瘤細胞凋亡[18]。在子宮內(nèi)膜癌中,SPTBN2是miR-424-5p的下游靶基因,SPTBN2可以與Claudin-4(CLDN4)相互作用,通過PI3K/AKT通路促進子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移[9]。以上研究表明,SPTBN2參與多方面生物學過程,在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,具有較高研究價值。

膀胱癌早期臨床癥狀不明顯,導致部分患者首診時腫瘤可能已發(fā)展至中晚期,且易復發(fā)的特點要求患者需要長期、規(guī)范的檢查,這也增加了患者的治療成本和心理負擔。膀胱癌的生物學性質(zhì)復雜,目前對其發(fā)病機制、進展過程仍未完全了解。因此,對膀胱癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制的研究,為尋找新的腫瘤標志物和預后評估具有重要意義。前期生物信息學研究結(jié)果表明SPTBN2顯著影響膀胱癌患者預后,可能與膀胱癌的發(fā)展相關(guān)[19],但SPTBN2在膀胱癌細胞中的相關(guān)作用尚未被深入研究。為進一步探討SPTBN2在膀胱癌細胞中的作用,驗證SPTBN2對膀胱癌細胞的影響,本研究設(shè)計了兩條靶向SPTBN2 siRNA序列,通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建SPTBN2低表達細胞株,qPCR和Western Blot結(jié)果顯示,兩條siRNA序列具有較好的干擾效率。CCK-8增殖實驗結(jié)果表明,兩組經(jīng)過轉(zhuǎn)染靶向SPTBN2 siRNA的細胞,48 h和72 h的增殖速率均低于陰性對照組,SPTBN2 siRNA實驗組的增殖活性受到抑制;劃痕實驗和Transwell實驗顯示,下調(diào)SPTBN2表達后,膀胱癌5637細胞的遷移和侵襲能力較對照組弱。實驗發(fā)現(xiàn)減少膀胱癌5 637細胞中SPTBN2的表達量能抑制腫瘤增殖、遷移和侵襲,提示SPTBN2在膀胱癌發(fā)展中發(fā)揮促進作用,本研究的結(jié)果與既往研究結(jié)果相一致[19]。

近年來,膀胱癌手術(shù)技術(shù)的改進以及新型治療方案的應(yīng)用,改善了部分患者的預后情況,但膀胱癌具有高度異質(zhì)性,對各種治療手段的敏感性存在很大差異,總體上膀胱癌患者的長期生存率仍變化不大[20]。針對膀胱癌的部分靶向藥物顯示出較好的治療效果和應(yīng)用前景[21]。但仍有部分患者不能從治療中獲益,現(xiàn)有的靶向藥物在臨床應(yīng)用中仍具有局限性。如何減少腫瘤復發(fā)和進展仍然是膀胱癌治療中有待突破的難點。SPTBN2分布于多種細胞,在膀胱癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮促進作用,高表達SPTBN2提示腫瘤患者的預后較差,SPTBN2的靶向藥物研究可能成為未來膀胱癌治療藥物研發(fā)的方向。本研究驗證了兩條靶向SPTBN2 siRNA的有效性,實驗結(jié)果顯示,SPTBN2是促進膀胱癌腫瘤細胞增殖和侵襲的因子,降低SPTBN2的表達能有效抑制膀胱癌5637細胞的惡性生物學行為。因此SPTBN2可能是腫瘤治療的潛在靶點,針對SPTBN2的進一步研究,對指導膀胱癌患者的臨床治療,研究新的治療靶點具有重要意義。

本研究觀察到SPTBN2的表達與膀胱癌5637細胞的增殖、遷移和侵襲能力相關(guān),但作用機制尚不清楚,下調(diào)SPTBN2是否影響細胞內(nèi)增殖與侵襲有關(guān)蛋白的表達以及細胞DNA復制活性能否受到抑制,有待進一步研究。

綜上所述,研究發(fā)現(xiàn)降低SPTBN2在膀胱癌5637細胞中的表達能抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這提示SPTBN2在膀胱癌診斷和治療中具有重要意義,值得深入研究。