楊曉玉，陳恩，李通，程豐，龔國富，雷文波

（1.鄂州市中心醫(yī)院檢驗科，湖北 鄂州 436000；2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，湖南 衡陽 421001）

2019 年底爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的一種嚴(yán)重急性呼吸道傳染病。2020 年新冠肺炎在全球程爆發(fā)性擴(kuò)散，目前已有5 900 余萬人確診，死亡人數(shù)達(dá)140 多萬，且還呈增長之勢，全世界均面臨著嚴(yán)峻的疫情挑戰(zhàn)。

SARS-CoV-2 是β 屬的冠狀病毒，有包膜，直徑為60～140 nm[1]，主要傳染源是新冠肺炎患者及無癥狀感染者，其傳播途徑主要是通過呼吸道飛沫和密切接觸傳播，長時間暴露于高濃度氣溶膠也有感染的可能[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，糞便和尿液中也可以分離到新冠病毒[3]。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，目前新冠肺炎的易感人群較廣，部分研究顯示男性的病例數(shù)比女性多[4]，且年齡較大的患者，特別是自身具有基礎(chǔ)性疾病的患者預(yù)后更差，比如高血壓、糖尿病等[5-6]。新冠肺炎患者早期的臨床癥狀以發(fā)熱、干咳、乏力為主，少數(shù)患者伴有鼻塞、咽痛、流涕、腹瀉、肌痛等癥狀[7]。重癥患者可出現(xiàn)呼吸困難或者低氧血癥，進(jìn)而發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙及多器官衰竭等[8]。

新冠病毒檢測方法多種多樣，有高通量測序檢測、病原核酸檢測、血清抗體檢測等方法。病原核酸檢測方法具有成本相對較低、特異性和敏感性相對較高[9]，且其檢測條件與檢測人員技術(shù)水平等要求相對容易滿足等特點，符合目前大樣本量的篩查及診斷的客觀需要。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》，實時熒光RT-PCR 已成為檢測新型冠狀病毒的常規(guī)檢測方法[10]，主要針對新型冠狀病毒兩段主要的保守基因序列：開放讀碼框1ab （Open Reading Frame1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（Nucleocapsid Protein，N）[11-12,1]。隨著國內(nèi)外疫情的發(fā)展，為滿足國內(nèi)外疫情防控的需要，各大體外診斷生物試劑公司推出了各種核酸檢測試劑盒。但因各試劑廠家研發(fā)團(tuán)隊水平不一，技術(shù)參差不齊，檢測試劑盒性能也各有優(yōu)劣，其靈敏性、特異性等方面可能會有所差異。本研究就國內(nèi)常用的兩種核酸檢測試劑盒進(jìn)行比較與評估，旨在為臨床實驗室遴選核酸檢測試劑選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 湖北省鄂州市中心醫(yī)院2020 年2 月17 日至24 日確診的COVID -19（經(jīng)核酸檢測檢測陽性及胸片CT 影像學(xué)檢查有新冠肺炎典型性改變及臨床癥狀者）咽拭子樣本55 例，同時期經(jīng)新冠核酸檢測與影像學(xué)檢查排除的非新冠肺炎患者咽拭子樣本28 例。

1.1.2 檢測試劑盒 某核酸擴(kuò)增試劑盒A （雙重?zé)晒釶CR 法，批號20200108）；某核酸擴(kuò)增試劑盒B（雙重?zé)晒釶CR 法，批號：20200106）；天隆EXRNA/DNA 核酸提取試劑盒 （磁珠法，批號：E0120010221）。

1.1.3 儀器 核酸全自動提取儀 （Natch CS S12C）（圣湘生物），核酸提取儀 （天隆科技），Applied Biosystems QuantStudio 3＆5 實時熒光定量PCR 儀（Thermo）。

1.2 實驗方法 以下實驗的核酸提取均采用各試劑廠家推薦方法進(jìn)行，并嚴(yán)格按照各試劑說明書操作。B 采用配套的一步法提??；A 采用其推薦之一的核酸提取試劑盒及相對應(yīng)的提取儀提取。

1.2.1 一致性檢測 選擇COVID-19 臨床確診病例55 例、非COVID-19 患者28 例，用A、B 兩種試劑進(jìn)行檢測，分析兩種試劑的診斷效能。

1.2.2 分析靈敏度檢測 從55 例COVID-19 患者中選擇ORF1ab 基因和N 基因均強陽的樣本1例，經(jīng)過10×、100×、1 000×、10 000×、100 000×稀釋，每個濃度設(shè)3 個平行孔，用兩種試劑分別進(jìn)行檢測；在最低檢測濃度基礎(chǔ)上再進(jìn)行倍比稀釋，再用兩種試劑分別進(jìn)行檢測。

1.2.3 精密度檢測 將1.2.2 步驟中兩種試劑均能100%檢測到的高中低濃度，每個濃度分裝成5 個樣本，分別用兩種試劑盒檢測，重復(fù)3 次，分析試劑的精密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用一致性Kappa 檢驗，分析試劑的診斷效能。精密度的分析采用方差分析levene 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一致性實驗及準(zhǔn)確性實驗結(jié)果 用兩種試劑盒檢測COVID-19 樣本55 例、非COVID-19 樣本28 例，試劑A 與B 均檢測ORF1a/b 和N 基因。試劑A 的檢出率、特異度、符合度、Kappa 值、雙靶標(biāo)陽性率、單靶標(biāo)陽性率、復(fù)檢率分別是100%、96.4%、98.8%、0.973、90.7%、9.3%、9.3%。試劑B 的檢出率、特異度、符合度、Kappa 值、雙靶標(biāo)陽性率、單靶標(biāo)陽性率、復(fù)檢率分別是98.2%、100%、98.8%、0.964、79.6%、20.4%、20.4%。經(jīng)分析，試劑A 與B的一致性及準(zhǔn)確性相當(dāng)。見表1-2。

表1 兩種核酸檢測試劑盒檢測結(jié)果分析

表2 兩種核酸檢測試劑盒的診斷效能評估

2.2 兩種試劑盒診斷靈敏度比較 從55 例COVID-19 樣本中取雙靶標(biāo)陽樣本1 例進(jìn)行10×梯度稀釋，每個濃度設(shè)3 個平行孔，用兩種試劑盒檢測。各擴(kuò)增曲線均呈典型的“S”型，根據(jù)稀釋倍數(shù)做線性回歸方程，發(fā)現(xiàn)試劑A 的線性范圍最寬且線性關(guān)系良好見圖1。試劑B 可穩(wěn)定檢測到100×稀釋的樣本，而試劑A 可以檢測的最低濃度是1 000×稀釋的樣本。為進(jìn)一步確認(rèn)以上實驗結(jié)果，再將樣本稀釋200×、400×、800×、1 000×、2 000×，每個濃度設(shè)8 個孔，用兩種試劑檢測。結(jié)果顯示樣本經(jīng)200×、400×、800×、1 000×稀釋后，試劑A 的檢出率均是100%；試劑B 的檢出率分別是100%、100%、62.5%、25%，見表3。

圖1 10 倍梯度稀釋樣本后試劑A和B 的ORF1ab/N 基因擴(kuò)增曲線圖

表3 倍比稀釋后兩種試劑檢測結(jié)果

2.3 兩種試劑精密度實驗比較 已知2.2 實驗中兩種試劑能共同檢出的最低濃度是100×稀釋后的樣本，則將2.2 實驗中的樣本原液及10×、100×稀釋后作為高、中、低3 個濃度，每個濃度每批重復(fù)測5次，連續(xù)測3 次，統(tǒng)計其Ct 值與CV%。兩種試劑檢測未稀釋的樣本各基因精密度之間差異無顯著意義（P>0.05）。樣本經(jīng)10×稀釋后，試劑A 與B 的N基因CV%值分別為0.7、2.1 （F=8.31，P<0.05），ORF1ab 基因CV%值分別為0.6、2.3（F=15.614，P<0.05）；樣本經(jīng)100 ×稀釋后，試劑A 與B 的N 基因CV%值分別為3.1、8.9 （F=5.684，P<0.05)，ORF1ab基因CV%值分別為1.9、6.0（F=5.846，P<0.05）。試劑B 的精密度均隨著樣本濃度的降低而降低，而試劑A 的高中低濃度精密度變化不明顯，說明試劑A 的精密度優(yōu)于試劑B。

3 討論

國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)的新型冠狀病毒檢測試劑中，大部分采用的方法為實時熒光PCR，它具有簡便快速、特異性強、靈敏度高等特點[9]。但不同廠家試劑成分不同或引物、探針設(shè)計策略不一而可能導(dǎo)致其檢測性能上有差異。本研究對不同公司生產(chǎn)的新冠病毒核酸檢測試劑A和B 進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)試劑B 的雙陽率僅79.6%，明顯低于試劑A 的90.7%。根據(jù)指南要求，單靶標(biāo)陽性患者需要用不同類型的標(biāo)本如痰、肺泡灌洗液等進(jìn)行復(fù)查或隔天重新采集同一類型樣本進(jìn)行復(fù)查[1]。試劑B 的復(fù)檢率為20.4%，明顯高于試劑A的9.3%。

為避免所選新冠肺炎患者樣本中新冠病毒濃度覆蓋范圍不全而導(dǎo)致實驗出現(xiàn)誤差，從55 例新冠肺炎樣本中取雙靶標(biāo)陽性1 例樣本進(jìn)行10×梯度稀釋，用兩種試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)試劑A 的線性范圍更廣，靈敏度更高，它可以穩(wěn)定檢測到1 000×稀釋樣本，而試劑B 只能穩(wěn)定檢測到100×稀釋的樣本。進(jìn)一步將樣本稀釋800×、1 000×，每個濃度分裝8 管，試劑A 的檢出率分別是100%、100%；試劑B 的檢出率分別是62.5%、25%。通過以上實驗發(fā)現(xiàn)，兩種試劑對高病毒載量的樣本檢出率一致，但對低病毒載量樣本，試劑A 的檢出率明顯高于試劑B，充分說明試劑A 的分析靈敏度高于后者。在精密度實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，兩種試劑檢測未稀釋的樣本（雙靶標(biāo)陽性的樣本）ORF1ab 和N 基因檢出的精密度差異無顯著意義（P>0.05）。但樣本經(jīng)10×與100×稀釋后，試劑A 的N 基因(F=8.31，P<0.05,F=5.684，P<0.05)和ORF1ab 基因（F=15.614，P<0.05, F=5.846，P<0.05) 精密度均優(yōu)于試劑B，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。試劑B 的精密度均隨著樣本濃度的降低而降低，而試劑A 精密度隨著濃度降低并無明顯趨勢，這可能因試劑A 靈敏度相對較高，所稀釋的樣本濃度不適合作為其弱陽性樣本。

表4 兩種試劑對不同濃度樣本檢測后的Ct 值與CV%結(jié)果

綜上所述，試劑A 的符合度高，靈敏度與重復(fù)性相對較好，且其復(fù)檢率相對試劑B 要低，整體性能相對占優(yōu)勢。因條件有限，暫無通用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行最低檢測限的檢測，僅對本實驗室所采用過的試劑與耗材進(jìn)行實驗，如陽性標(biāo)本僅采用的是鄂州市中心醫(yī)院新冠確診患者的樣本，這可能會導(dǎo)致實驗有誤差。本研究僅對幾種試劑診斷性能進(jìn)行初步的評估，其更深一層的性能驗證，需進(jìn)一步研究。