鄧順順，梁國(guó)朝，梁靈君，高永雙

（1.中山市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.藥劑科, 廣東 中山 528400）

精神分裂癥為精神科常見(jiàn)病、多發(fā)病,該疾病有著較高的致殘率，疾病對(duì)于患者的家庭以及整個(gè)社會(huì)造成了極大負(fù)擔(dān)[1]。該病是一種目前病因尚未明確的嚴(yán)重精神疾病,藥物控制是精神分裂癥的基本治療手段[2]。第二代抗精神病藥物也叫新型抗精神病藥物,主要包括利培酮、奧氮平、氨磺必利等藥物。與傳統(tǒng)抗精神病藥物比較，第二代抗精神病藥物療效更廣、治療作用更確切、安全性也更高等特點(diǎn)，已被臨床廣泛應(yīng)用于精神分裂癥患者的治療[3］。有研究顯示，仍然會(huì)有50%以上患者在服用第二代抗精神病藥物之后會(huì)出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，其中在體重方面體現(xiàn)的尤為突出，影響患者繼續(xù)治療依從性，不僅帶來(lái)不好的主觀體驗(yàn)，而且會(huì)增加疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)［4-5］。

臨床常用抗精神病治療藥物的療效與藥物的不良反應(yīng)與其血藥濃度密切相關(guān)，因此血藥濃度監(jiān)測(cè)( TDM ) 是精神科藥物治療方面的重要參考[6]。神經(jīng)精神藥理學(xué)與藥物精神病學(xué)協(xié)會(huì)（AGNP）推薦臨床使用奧氮平、利培酮或氨磺必利時(shí)進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上[7-9]，建立一種可用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展，準(zhǔn)確而快速的同時(shí)檢測(cè)人血清中奧氮平、利培酮或氨磺必利的方法，進(jìn)行方法學(xué)確證，提高TDM 的效率。

1 材料與方法

1.1 試劑 甲醇、乙腈（色譜純），德國(guó)默克公司；乙酸，廣州化學(xué)試劑廠；去離子水，自制。

1.2 試驗(yàn)藥品 氨磺必利，批號(hào)200701；奧氮平，批號(hào)：201502；利培酮，批號(hào)：201704，純度均＞99%,購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所；內(nèi)標(biāo)氨磺必利-D5，批號(hào)：2-AMC-124-4；奧氮平-D3，批號(hào)：6-QFY-169-3；利培酮-D4，批號(hào)：3-KHI-168-3，純度均＞99%,購(gòu)于Toronto Research Chemicals 公司。

1.3 儀器設(shè)備 采用島津8040 型號(hào)液質(zhì)聯(lián)用儀（日本SHIMADZU），配備有可調(diào)柱溫箱 (CTO-20A)，氮?dú)獍l(fā)生器（ATN-1050）,二元高壓泵(LC-20AD)，自動(dòng)進(jìn)樣器(SIL-20AHT-UFLC)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5424R 型)；yi 移液槍(Eppendorf)，數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，KQ-300DV 型）分析天平(Sartorins，B2T5S 型)；混勻儀(艾本德MixMate 型) ；帕恩特普通分析級(jí)純水機(jī)(北京湘順源，XYB-H 型)。

1.4 溶液配制

1.4.1 對(duì)照品工作溶液制備稱取抗精神病藥物奧氮平、利培酮和氨磺必利的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品分別用一定量甲醇溶解配制成為10.00 ug·mL-1的儲(chǔ)備液，保存于2～8℃冰箱備用。使用時(shí)再按需求按照一定比例用甲醇稀釋成質(zhì)控工作液和標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控樣品的制備 留取正常體檢人員血清作為空白血清，取1.4.1 制備的對(duì)照品工作液10 μL，加入空白血清90 μL，混勻儀混勻1 min，分別配制成含不同藥物的血清標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后按比例用甲醇溶解成含各分析物的質(zhì)量濃度從低到高依次如下：奧氮平為5、10、25、50、100、250、500 和1 000 ng·mL-1，利培酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為1、2、5、10、20、50、100 和200 ng·mL-1，氨磺必利為10、20、50、100、200、500、1 000 和2 000 ng·mL-1。用甲醇將血清標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3 個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控品（低、中、高），各分析物濃度如下：奧氮平為100、500、800 ng·mL-1，利培酮為20、100、160ng·mL-1，氨磺必利為200、1000、1 600 ng·mL-1。

1.4.3 同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液配制 用乙腈溶解奧氮平-D3、利培酮-D4 和氨磺必利-D5，分別配成質(zhì)量濃度為100 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 Phenomenex 預(yù)柱：Security Guard Ultra Cartridges (AJ0-8775)；Phenomenex 色譜柱:Kinetex XB-C18,2.6 μm,3.0 x 50 mm；柱溫為45℃；流速為0.4 mL·min-1；流動(dòng)相水相為0.1%乙酸水溶液，有機(jī)相為甲醇，線性梯度洗脫；進(jìn)樣量為5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離（ESI）標(biāo)準(zhǔn)功能正離子模式，離子源溫度為200 ℃，流速20.0 L·min-1，加熱模塊溫度為450 ℃，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）質(zhì)譜掃描方式，電噴霧壓力為230 kPa。各物質(zhì)前體與產(chǎn)物質(zhì)荷比（m/z）分別為：奧氮平m/z 312.9→256.1，內(nèi)標(biāo)奧氮平-D3 m/z 316→256.1，利培酮m/z 411.2→191.1，內(nèi)標(biāo)利培酮-D4 m/z 415→195.1，氨磺必利m/z 370.2→242，內(nèi)標(biāo)氨磺必利-D5 m/z 375.2 →242，碰撞能量分別為26，22，22，26，45 和24 eV，裂解電壓135e V。

2 試驗(yàn)與結(jié)果

2.1 樣本的處理 在1.5 mL 的離心管中加入空白血清樣本、標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μL,，加入乙腈450 μL，混勻儀1 400 轉(zhuǎn)/分混勻1 min，然后在4℃條件下15 000 rpm 離心10 min，用加樣槍吸取100 μL 上清液置于帶專用內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2.2 專屬性試驗(yàn) 取4 份等量空白血清，第1 份不加任何物質(zhì)，第2 份加入內(nèi)標(biāo)，第3 份加入分析物，第4 份同時(shí)加入分析物和內(nèi)標(biāo)，按照操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣檢測(cè)分析，得到色譜圖。奧氮平和奧氮平-D3 的保留時(shí)間約為2.31 min，利培酮和利培酮-D4 的保留時(shí)間約為2.42 min，氨磺必利和氨磺必利-D5 的保留時(shí)間約為2.36 min。檢測(cè)結(jié)果：血清中基質(zhì)不干擾分析物及內(nèi)標(biāo)成分的測(cè)定，專屬性強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

圖1 血清中3 中精神科藥物檢測(cè)的典型色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 按“1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控樣品的制備”配制所得的標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成由低到高8 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線的血清樣品，按操作規(guī)程檢測(cè)，檢測(cè)兩次。以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)（y），以配制時(shí)的各分析物濃度為橫坐標(biāo)(x) ，采用加權(quán)( 1 /x2 ) 最小二乘法進(jìn)行回歸，得到各分析物標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限驗(yàn)證結(jié)果

2.4 精密度與提取回收率試驗(yàn) 按“1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)控樣品的制備”項(xiàng)制備的血清質(zhì)控樣品，按普通樣本處理操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)，一天內(nèi)將同一批次的低、中、高三個(gè)水平樣本獨(dú)立檢測(cè)5 次，檢測(cè)間隔時(shí)間大于1 h，連續(xù)檢測(cè)3 d，可得到45 個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)，并根據(jù)當(dāng)批的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算均值（x），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）,批內(nèi)、批間的精密度?？瞻籽逯屑尤氩煌瑵舛鹊膶?duì)照品溶液后，配制成低、中、高三個(gè)水平的樣本，每組每個(gè)濃度5 份樣品，計(jì)算各均值，然后計(jì)算提取回收率。各分析物的準(zhǔn)確度均在95.37%～105.72%，日內(nèi)及日間精密度均＜15%，見(jiàn)表2。

表2 精密度與回收率驗(yàn)證結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)控樣品的制備”項(xiàng)制備各分析物質(zhì)控血清樣品（低、中、高3個(gè)濃度）各3 份，考察其在常溫避光條件下放置1 h和24 h、-20 ℃保存條件下存放1 d 和14 d 的穩(wěn)定性。驗(yàn)證結(jié)果：質(zhì)控樣品在常溫避光條件下放置1 h 和24 h、-20 ℃保存7 d 和14 d 的條件下，RSD 均小于15%，結(jié)果穩(wěn)定。

2.6 基質(zhì)效應(yīng) 制備標(biāo)準(zhǔn)品純?nèi)芤海寮訕?biāo)樣本以及兩者1:1 的混合液，分別前處理后測(cè)定3 次。計(jì)算三種溶液3 次測(cè)定的峰面積 （目標(biāo)化合物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值）均值，1:1 混合樣本的均值相比血清加標(biāo)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品純?nèi)芤旱木档钠睢ｒ?yàn)證結(jié)果奧氮平、利培酮和氨磺必利的偏差均小于15%，目標(biāo)分析物在生物樣本和純?nèi)芤褐械馁|(zhì)譜響應(yīng)無(wú)差異，不影響目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確定量。

3 討論

目前，盡管許多國(guó)家與地區(qū)的精神分裂癥治療指南，均推薦單一抗精神病藥治療原則，但實(shí)際臨床上聯(lián)合用藥很常見(jiàn)[10], 有些聯(lián)合用藥甚至超過(guò)50%[11]。當(dāng)患者聯(lián)合用藥時(shí)，需要進(jìn)行每一種藥物的TDM 檢測(cè)，如果能一管血同時(shí)檢測(cè)其所有藥物的藥物濃度，那將會(huì)極大的縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，并減輕患者多次采血的負(fù)擔(dān)，臨床運(yùn)用會(huì)更加廣泛?；谫|(zhì)譜具有分析敏感性和特異性，并能夠在單個(gè)過(guò)程中測(cè)量多種化合物[12]。這是一種監(jiān)測(cè)接受多種藥物治療的患者的經(jīng)濟(jì)、有效的方法［13］。目前TDM 多采用高效液相色譜、熒光偏振免疫分析等方法，其對(duì)應(yīng)的儀器平臺(tái)分別是高效液相色譜儀和免疫分析儀[14], 對(duì)于某些臨床化學(xué)和毒理學(xué)分析物，液相色譜(LC)與串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)配對(duì)提供了優(yōu)于免疫測(cè)定的傳統(tǒng)測(cè)試的優(yōu)勢(shì)[12]。本實(shí)驗(yàn)室采用的是液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，HPLCMS/MS 檢測(cè)方法。

本研究旨在建立一種同時(shí)監(jiān)測(cè)奧氮平、利培酮和氨磺必利的HPLC-MS/MS 方法。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用乙腈蛋白沉淀法對(duì)樣品進(jìn)行處理，與液-液萃取法、固相萃取法相比，不但提高了靈敏度，而且有利于改善峰型[15]。本研究采用同位素化合物作為內(nèi)標(biāo)，同位素內(nèi)標(biāo)與分析物離子可簡(jiǎn)化色譜行為，確保質(zhì)譜行為一致，有效降低溶血、高脂血以及高膽紅素血樣等特殊血樣對(duì)檢測(cè)的影響[16]。本方法驗(yàn)證過(guò)程符合生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[17]，驗(yàn)證該方法的專屬性、線性范圍、靈敏度、和基質(zhì)效應(yīng)等，均能滿足該方法同時(shí)檢測(cè)奧氮平、利培酮和氨磺必利三種精神類藥物的研究要求，檢測(cè)中所需標(biāo)本量少，檢測(cè)速度快，能提高臨床檢測(cè)效率和檢測(cè)質(zhì)量，可以進(jìn)行日常檢測(cè)。