陳馨嶸 范鑫 司丹妮 王明明 龍章佑 孫潤(rùn)民 余靜

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-angiotensin system，RAS）是調(diào)節(jié)、參與心血管系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)變化的重要組成部分，對(duì)心血管功能穩(wěn)態(tài)、電解質(zhì)和體液平衡的維持，以及血壓的調(diào)節(jié)均有重要作用。血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）作為RAS 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在病理狀態(tài)下，可直接與心肌細(xì)胞膜上的Ang Ⅱ1 型受體（Angiotensin Ⅱtype 1 receptor，AT1R）結(jié)合，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞肥大、凋亡，引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抑制自噬等，最終影響心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[1～3]。

縫隙連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是心肌細(xì)胞間縫隙連接的主要蛋白成分，在成熟的心肌細(xì)胞中，Cx43 主要位于心肌細(xì)胞閏盤上，能在心肌細(xì)胞之間傳遞電流、允許化學(xué)信號(hào)和能量底物交換，是協(xié)調(diào)細(xì)胞功能所必需的結(jié)構(gòu)[4]。AngⅡ可以通過減少心肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá)而引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常改變[5～8]。

TRV027 是一種新型AT1R 偏向性配體，能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷AngⅡ與AT1R 的結(jié)合、選擇性地激活β-arrestin 通路，從而抑制AngⅡ介導(dǎo)的交感神經(jīng)興奮、血管收縮、水鈉潴留等，并且可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮能力，增加心輸出量，改善心功能[9～11]。因此本研究針對(duì)AngⅡ與Cx43 之間的關(guān)系，探索TRV027 是否通過抑制Ang Ⅱ并激活β-arrestin 通路對(duì)心肌細(xì)胞Cx43 產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 選取大鼠心肌細(xì)胞H9C2 細(xì)胞株（和元生物技術(shù)股份有限公司）作為研究對(duì)象，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）、1%雙聯(lián)抗生素（鏈霉素、青霉素，美國(guó)Gibco 公司）的DMEM 高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，選取第3～5 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 Ang Ⅱ、TRV027（美國(guó)AbMole 公司），GAPDH、β-arrestin 抗體、熒光二抗（中國(guó)Proteintech 公司），Cx43 抗體（美國(guó)abcam 公司），TBgreen（中國(guó)TaKaRa 公司）；電泳儀、Bio-Tek 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-tek 公司），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)（中國(guó)天能科技公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-rad 公司），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 將H9C2 細(xì)胞分為對(duì)照組、AngⅡ組、TRV027 組、AngⅡ+TRV027 組。AngⅡ組用1×10-5mol/L Ang Ⅱ干預(yù)48h；TRV027 組用1×10-8mol/L TRV027 干預(yù)24h；Ang Ⅱ+TRV027組用1×10-5mol/L AngⅡ干預(yù)24h 后，給予1×10-8mol/L TRV027 干預(yù)24h，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，無藥物干預(yù)。1.2.2 蛋白質(zhì)印跡（WB）法檢測(cè)Cx43 和β-arrestin在H9C2 細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 將四組細(xì)胞培養(yǎng)至6 孔板中，干預(yù)48h，收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30min，12 000r/min 4℃離心20min，收集上清，按照BCA 試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度、計(jì)算上樣蛋白量，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1.5h，TBST 洗膜，加入稀釋的Cx43 一抗（1:1 000）和β-arrestin 一抗（1:700），4℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，TBST 洗膜，將ECL 超敏化學(xué)發(fā)光液滴加于膜上，顯影、定影、拍照。用ImageJ 計(jì)算Cx43 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)H9C2 細(xì)胞中Cx43、β-arrestin mRNA 的表達(dá) 將四組細(xì)胞培養(yǎng)至6 孔板中，干預(yù)48h，按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：模板cDNA 2μl，上下游引物各0.1μl，Taq DNA 聚合酶12.5μl，滅菌水8.5μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40 個(gè)循環(huán)。Cx43 上游引物：正向：5'-TGAAG TTCAGACAAGGCTCAAAGA-3'，反向：5'-AATGTTGA TAGAAGCCGTTTGGTG-3'；β-arrestin 上游引物：正向：5'-TGGGCAACTCAAGCACGAA-3'，反向：5'-AGCTT CACCTTGACCCTGTAGGA-3'。以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計(jì)算Cx43、β-arrestin mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 免疫熒光法觀察H9C2 細(xì)胞 將四組H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)至24 孔板中，干預(yù)48h，用4%多聚甲醛固定30min，用PBS清洗5次，每孔加300μl 0.1%Triton（Cx43 檢測(cè)組不加Triton），用PBS 清洗5 次，加入10%正常山羊血清37℃溫箱封閉1.5h，滴加一抗100μl（Cx43 1:400，β-arrestin 1:200），置于4℃冰箱搖床孵育過夜，次日取出至室溫復(fù)溫1h，PBS 清洗5 次，加入熒光二抗100μl（1:400），室溫避光孵育1h，PBS 清洗5 次，用1:10 染色5min，PBS 清洗5 次，置于熒光顯微鏡下應(yīng)用FITC 通道觀察H9C2細(xì)胞內(nèi)Cx43、β-arrestin 的蛋白表達(dá)情況，DAPI 通道觀察細(xì)胞核染色。用ImageJ 計(jì)算細(xì)胞內(nèi)Cx43、β-arrestin 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Cx43 和β-arrestin 的蛋白水平比較AngⅡ組H9C2 細(xì)胞Cx43（t=6.425、P=0.003）和β-arrestin（t=4.511、P=0.0004）的蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組；Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2 細(xì)胞Cx43（t=-6.530、P=0.0001）和β-arrestin（t=-7.982、P=0.00001）的蛋白表達(dá)量明顯高于Ang Ⅱ組；TRV027 組Cx43（t=-5.524、P=0.0003）和β-arrestin（t=-6.137、P=0.0001）的蛋白表達(dá)量也高于Ang Ⅱ組。見表1、圖1。

表1 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白表達(dá)水平比較（±s）

分組Cx43β-arrestin對(duì)照組0.63±0.010.65±0.02 Ang Ⅱ組0.42±0.040.47±0.06 TRV027 組0.71±0.060.73±0.02 AngⅡ+TRV027 組0.76±0.060.79±0.01

圖1 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白水平比較

2.2 各組Cx43 和β-arrestin 的 mRNA 水平比較Ang Ⅱ組H9C2 細(xì)胞Cx43（t=1.682、P=0.048）和β-arrestin（t=2.869、P=0.022）的mRNA 表達(dá)量明顯低于對(duì)照組；Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2 細(xì)胞Cx43（t=-6.052、P=0.003）和β-arrestin（t=-4.748、P=0.0002）的mRNA 表達(dá)量明顯高于Ang Ⅱ組；TRV027 組Cx43（t=-4.529、P=0.012）和β-arrestin（t=-3.148、P=0.019）的mRNA表達(dá)量也高于Ang Ⅱ組。見表2。

表2 各組H9C2細(xì)胞Cx43和β-arrestin mRNA水平比較（±s）

表2 各組H9C2細(xì)胞Cx43和β-arrestin mRNA水平比較（±s）

分組Cx43β-arrestin對(duì)照組0.012±0.0050.0006±0.0001 Ang Ⅱ組0.005±0.0030.0002±0.0001 TRV027 組0.015±0.0010.0006±0.0001 AngⅡ+TRV027 組0.018±0.0010.0009±0.0002

2.3 各組免疫熒光相對(duì)表達(dá)量比較根據(jù)熒光效果圖及半定量分析可見，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組Cx43、β-arrestin 的綠色熒光強(qiáng)度降低；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+TRV027 組Cx43、β-arrestin 的綠色熒光強(qiáng)度升高。熒光半定量分析結(jié)果顯示，Ang Ⅱ組H9C2 細(xì)胞Cx43（t=7.038、P=0.00002）和β-arrestin（t=11.926、P=0.000001）的熒光相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組；Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2細(xì)胞Cx43（t=-14.049、P=0.00001）和β-arrestin（t=-6.517、P=0.00003）的熒光相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ang Ⅱ組；TRV027 組Cx43（t=-4.856、P=0.001）和β-arrestin（t=-11.426、P=0.00001）的熒光相對(duì)表達(dá)量也高于Ang Ⅱ組。見圖2、表3。

表3 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的螢光相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 的螢光相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

分組Cx43β-arrestin對(duì)照組48.49±3.3065.19±1.71 Ang Ⅱ組28.35±3.7032.75±4.39 TRV027 組40.73±2.4264.26±1.88 AngⅡ+TRV027 組59.70±1.1351.61±2.42

圖2 各組H9C2 細(xì)胞Cx43 和β-arrestin 熒光效果圖

3 討論

心血管疾?。–ardiovascular disease，CVD）的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍然呈上升趨勢(shì)，是全球死亡和導(dǎo)致殘疾的主要原因[12]。而RAS 的過度激活可以通過誘發(fā)炎癥、細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)，造成心臟和血管損傷，是CVD 發(fā)病及病情惡化的重要因素之一[13，14]。Ang Ⅱ作為RAS 的重要活性成分發(fā)揮了核心作用，例如Ang Ⅱ可引起動(dòng)脈血管收縮以及鈉水潴留，促進(jìn)高血壓、心律失常、心肌梗死、心力衰竭等CVD 的發(fā)生發(fā)展。而Ang Ⅱ主要依賴于和細(xì)胞膜表面高度特異受體的結(jié)合而發(fā)揮作用，目前已知的Ang Ⅱ受體亞型主要有兩種，AT1R 和AT2R，二者都屬于G 蛋白偶聯(lián)受體，其中AT1R 是Ang Ⅱ發(fā)揮作用的主要受體[15]。當(dāng)Ang Ⅱ和AT1R 結(jié)合后，通過激活下游的G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著收縮血管、調(diào)節(jié)血壓和水鈉平衡等作用。在高血壓、充血性心力衰竭等CVD 的治療中廣泛使用的Ang Ⅱ轉(zhuǎn)換酶抑制劑和AT1R 阻斷劑就是通過限制Ang Ⅱ的產(chǎn)生或者阻斷Ang Ⅱ與AT1R 受體的結(jié)合來發(fā)揮療效。因此，阻斷Ang Ⅱ的作用進(jìn)而抑制RAS 的過度激活，對(duì)CVD 的防治具有重要意義。

Cx43 作為縫隙連接的主要蛋白，其數(shù)量減少和分布異常與心律失常、心力衰竭、高血壓等疾病相關(guān)[16～18]。研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ可以通過減少心肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá)，增加Ⅰ型膠原蛋白的含量，從而導(dǎo)致心臟間質(zhì)纖維化[5～7]。Ang Ⅱ還可以通過下調(diào)大鼠心房組織中Cx43 的表達(dá)，加重心房纖維化程度[19]。有學(xué)者在大鼠心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn)，梗死區(qū)Cx43的表達(dá)降低，而給予VX765（一種caspase-1 抑制劑）上調(diào)了Cx43 的表達(dá)后，心肌梗死后大鼠心臟細(xì)胞間的信息傳遞得到了改善[20]。另有研究顯示，在大鼠心肌梗死后給予Ang Ⅱ受體拮抗劑（氯沙坦），梗死區(qū)的Ang Ⅱ水平明顯降低，而Cx43 在心肌組織不同區(qū)域表達(dá)增高，說明Ang Ⅱ的激活導(dǎo)致了Cx43 的表達(dá)降低[8]。在人體實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，給予晚期心衰患者心內(nèi)膜注射過表達(dá)Cx43 可以提高注射段心肌運(yùn)動(dòng)能力和生存能力[21]。以上研究說明Ang Ⅱ可以下調(diào)心臟組織中Cx43 的表達(dá)，而通過阻斷Ang Ⅱ可以改善Cx43 的異常表達(dá)，進(jìn)而對(duì)心臟產(chǎn)生保護(hù)作用。而本研究結(jié)果顯示Ang Ⅱ可以降低大鼠心肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá)，這與以上研究結(jié)論相似，表明Ang Ⅱ可能通過下調(diào)心肌細(xì)胞Cx43的表達(dá)來影響心肌細(xì)胞功能。

TRV027 作為新型的AT1R 偏向性配體，一方面，TRV027 能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷Ang Ⅱ與AT1R 的結(jié)合，抑制Ang Ⅱ通過AT1R 介導(dǎo)的下游G 蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路對(duì)心血管系統(tǒng)的作用；另一方面，TRV027可以選擇性的激活β-arrestin 介導(dǎo)的非G 蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路，發(fā)揮正性肌力作用，改善心臟功能[9～11]。TRV027 選擇性激活β-arrestin 蛋白在病理環(huán)境中比普通AT1R 阻斷劑有更好地保護(hù)心臟和脈管系統(tǒng)的作用[22，23]。既往研究發(fā)現(xiàn)，給自發(fā)性高血壓大鼠中樞輸注TRV027 可降低基線平均動(dòng)脈壓，降低血管對(duì)Ang Ⅱ的反應(yīng)性[11]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示，TRV027 通過與AT1R 結(jié)合、激活β-arrestin 在新生小鼠心臟中以劑量依賴性方式起到了長(zhǎng)效正性肌力作用[24]。有學(xué)者證明了TRV027 在人體中的安全性和可耐受性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TRV027 可以降低穩(wěn)定性心力衰竭患者的平均動(dòng)脈壓[25，26]。這說明TRV027 能夠通過阻斷Ang Ⅱ與AT1R 的結(jié)合抑制Ang Ⅱ發(fā)揮作用，同時(shí)激活β-arrestin 信號(hào)通路對(duì)心臟和脈管系統(tǒng)起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示TRV027 提高了Ang Ⅱ下調(diào)的心肌細(xì)胞Cx43 的表達(dá)，也提高了β-arrestin 蛋白的表達(dá)，機(jī)制可能是TRV027 在抑制Ang Ⅱ作用的同時(shí)激活了β-arrestin信號(hào)通路，從而改善了Cx43 的異常表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，Ang Ⅱ可以降低大鼠心肌細(xì)胞中Cx43、β-arrestin 的表達(dá)，而TRV027 可以改善這一作用，增加大鼠心肌細(xì)胞中Cx43 和β-arrestin 的表達(dá)。因此，TRV027 可能通過阻斷Ang Ⅱ與AT1R 結(jié)合、激活β-arrestin 通路，上調(diào)心肌細(xì)胞中Cx43 的表達(dá)，改善心肌細(xì)胞功能。

本研究?jī)H限于在心肌細(xì)胞當(dāng)中進(jìn)行干預(yù)，沒有對(duì)Ang Ⅱ介導(dǎo)的下游信號(hào)通路及β-arrestin 相關(guān)通路進(jìn)行驗(yàn)證，缺少對(duì)心肌細(xì)胞功能和損傷相關(guān)檢測(cè)，而且未從動(dòng)物層面來探討TRV027 的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)上述問題重點(diǎn)研究，進(jìn)一步驗(yàn)證TRV027對(duì)心肌細(xì)胞及心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制。