陳壁娜

黃芪為多年生豆科類草本生長(zhǎng)的植物，味甘且性溫，最早出現(xiàn)于醫(yī)學(xué)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》，因其具有養(yǎng)血滋津、斂瘡新生、疏通散痹、固表益氣等效用，可在調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、保肝、抗炎等中發(fā)揮多重藥理學(xué)作用[1]。在我國(guó)，黃芪用途廣泛，不僅能夠參與心血管、呼吸、內(nèi)分泌等疾病的治療且效果良好，同時(shí)在保護(hù)心肌細(xì)胞、調(diào)節(jié)血壓等方面也取得了一定的進(jìn)展[2]。黃芪不僅包含黃酮、皂苷、多糖、微量元素以及其他有機(jī)物等化學(xué)成分，同時(shí)也包括甲苷類、多糖類及酮類化合物，這些均是黃芪中較為重要的活性成分?，F(xiàn)階段，隨著藥理學(xué)研究的不斷深入以及提取檢測(cè)方式的不斷完善，臨床中常將有關(guān)黃芪的藥理活性以及化學(xué)成分等作為關(guān)鍵研究對(duì)象，而研究中出現(xiàn)的差異性表現(xiàn)則是對(duì)應(yīng)成分提取方法不同的體現(xiàn)。本研究對(duì)黃芪不同提取方法對(duì)化學(xué)成分的影響進(jìn)行探究，旨在為臨床藥物提取方法提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑本研究黃芪源于來(lái)北京同仁堂大藥房。取晾曬干燥的黃芪根粉碎，過(guò)篩30 目，篩下產(chǎn)物經(jīng)封閉干燥包裝后保存?zhèn)溆?。將黃芪根切成厚度為2mm 的薄片用于水磨法進(jìn)行提取。纖維素酶、甲醇、正丁醇、氨水、苯酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2，4，6-三吡啶基均三嗪、維生素C、福林酚試劑。

1.2 儀器與設(shè)備超聲波多頻清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：SB-500DTY）；分離式磨漿機(jī)（滄州利達(dá)民用機(jī)械廠，型號(hào)：DM-ZF-105）；電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司，型號(hào)：HH-2A）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司，型號(hào)：UV-1700）；高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司，型號(hào)：LC-2010AHT）。

1.2 方法

1.2.1 獨(dú)立提取 ①水磨提?。⊿）：取黃芪片10g，加入60ml 蒸餾水，在40℃下將黃芪片浸泡約7h，研磨過(guò)濾后將濾渣進(jìn)行重復(fù)提取。②超聲輔助提?。–）：依據(jù)文獻(xiàn)方法[3]取黃芪粉3g，添加60ml 蒸餾水進(jìn)行超聲提取1h，完成后將提取液進(jìn)行過(guò)濾，再將濾渣重復(fù)提取1 次，將兩次濾液進(jìn)行合并待用。③酶解提取（M）：依據(jù)文獻(xiàn)[4]取黃芪粉5g，加入30ml pH 值為4.5 的磷酸緩沖液，加入纖維素酶0.05g，充分搖勻后60℃下水浴3h，過(guò)濾后將濾渣重復(fù)提取。④亞臨界提?。╕）：稱取黃芪粉8g，在高溫高壓環(huán)境下加蒸餾水300ml，密封后將氮?dú)饨尤?min，高溫條件下提取30min，將提取液過(guò)濾后再將濾渣進(jìn)行重復(fù)提取，最后將兩次濾液進(jìn)行合并。

1.2.2 聯(lián)合提取 ①超聲輔助聯(lián)合亞臨界提?。– ＋Y）：首先在超聲條件下進(jìn)行提取，完成后再在亞臨界提取條件下進(jìn)行成分提取。②酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y）：首先在酶解條件下進(jìn)行提取，提取完成后再利用亞臨界條件進(jìn)行成分提取。③水磨聯(lián)合亞臨界提?。⊿ ＋Y）：首先在水磨條件下進(jìn)行提取，提取完成后再在亞臨界條件下進(jìn)行成分提取。

1.3 黃芪提取物檢測(cè)

1.3.1 黃芪總皂苷 用等量正丁醇將提取液進(jìn)行提取，共3 次，在與正丁醇液聯(lián)合后，使用飽和氨溶液清洗3 次，正丁醇飽和水溶液清洗3 次，去掉正丁醇后將剩余殘?jiān)眉状级ㄈ?，取得樣品黃芪總皂苷。依據(jù)文獻(xiàn)[5]使用香草醛-高氯酸比色法檢測(cè)黃芪總皂苷總提取率，總皂苷提取率=提取液中總皂苷含量/原料質(zhì)量×100%。

1.3.2 黃芪總黃酮 將20ml 提取液轉(zhuǎn)移到100ml 的分液漏斗中，添加20ml 水飽和正丁醇，搖勻后提取，共3 次，正丁醇液結(jié)合后將溶劑蒸發(fā)，取殘?jiān)眉状既芙夂蠖ㄈ荩罁?jù)文獻(xiàn)[5]采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法測(cè)定黃芪總黃酮提取率?？傸S酮提取率=提取液中總黃酮含量/原料質(zhì)量×100%。

1.3.3 黃芪多糖 取5ml 提取液放置在10ml 離心管內(nèi)，放入3ml 無(wú)水乙醇，震蕩后冷藏12h，離心，取沉淀無(wú)水乙醇5ml，清洗后離心，沉淀加蒸餾水溶解，放在容量瓶?jī)?nèi)定容，取得樣品，依據(jù)文獻(xiàn)[6]采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定黃芪多糖提取率，多糖提取率=提取液中多糖含量/原料質(zhì)量×100%。

1.4 黃芪提取物抗氧化能力檢測(cè)取DPPH 自由基清除力定容后的提取物2ml 及0.2mmol/L DPPH 溶液2ml，混合后搖勻，20min 后500nm 波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值A(chǔ)i，0.2mmol/L DPPH 溶液2ml 和2ml 90% 乙醇溶液混勻后的吸光度Aj，分別檢測(cè)2ml 提取物和90%乙醇混合后的吸光度Ac，共計(jì)3 次，其中清除率SR（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%；ABTS+自由基清除力和鐵離子還原能力檢測(cè)依據(jù)文獻(xiàn)[7]，結(jié)果以每克干物質(zhì)中Vc 的含量表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPadPrism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各提取方法的黃芪總皂苷提取率比較在各提取方法中，黃芪總皂苷的提取率由高到低依次為C＋Y、M ＋Y、C、Y、S ＋Y、S、M，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 各提取方法的黃芪總皂苷提取率比較（±s，%）

表1 各提取方法的黃芪總皂苷提取率比較（±s，%）

注：與S 比較*P<0.05；與C 比較#P<0.05；與M 比較&P<0.05；與Y 比較%P<0.05；與C ＋Y 比較@P<0.05；與M ＋

提取方法提取率水磨提取（S）0.96±0.15超聲輔助提?。–） 2.59±0.98*酶解提取（M） 0.52±0.07*#亞臨界提?。╕） 1.82±0.25*#&超聲聯(lián)合亞臨界提取（C ＋Y） 4.86±2.38*#&%酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y） 3.65±1.96*#&%@水磨聯(lián)合亞臨界提?。⊿ ＋Y） 1.40±0.50*#&%@￥F 5.119 P 0.001

2.2 各提取方法的黃芪總黃酮提取率比較在各提取方法中，黃芪總黃酮的提取率由高到低依次為S、C ＋Y、M ＋Y、M、Y、C、S ＋Y，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 各提取方法的黃芪總黃酮提取率比較（±s，%）

表2 各提取方法的黃芪總黃酮提取率比較（±s，%）

注：與S 比較*P<0.05；與C 比較#P<0.05；與M 比較&P<0.05；與Y 比較%P<0.05；與C ＋Y 比較@P<0.05；與M ＋Y 比較￥P<0.05

提取方法提取率水磨提?。⊿）4.88±2.26超聲輔助提取（C） 0.43±0.19*酶解提?。∕） 1.75±0.82*#亞臨界提取（Y） 0.83±0.36*#&超聲聯(lián)合亞臨界提?。– ＋Y） 3.63±1.62*#&%酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y） 2.58±1.20*#&%@水磨聯(lián)合亞臨界提?。⊿ ＋Y） 0.28±0.08*#&%@￥F 6.205 P 0.001

2.3 各提取方法的黃芪多糖提取率比較在各提取方法中，黃芪多糖的提取率由高到低依次為M、S＋Y、C ＋Y、S、M ＋Y、Y、C，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 各提取方法的黃芪多糖提取率比較（±s，%）

表3 各提取方法的黃芪多糖提取率比較（±s，%）

注：與S 比較*P<0.05；與C 比較#P<0.05；與M 比較&P<0.05；與Y 比較%P<0.05；與C ＋Y 比較@P<0.05；與M ＋Y 比較￥P<0.05

提取方法提取率水磨提?。⊿）4.59±0.60超聲輔助提?。–） 1.23±0.09*酶解提取（M） 6.95±1.33*#亞臨界提?。╕） 2.69±0.20*#&超聲聯(lián)合亞臨界提取（C ＋Y） 4.80±0.72*#&%酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y） 3.73±0.39*#&%@水磨聯(lián)合亞臨界提?。⊿ ＋Y） 5.78±1.20*#&%@￥F 17.510 P 0.001

2.4 各提取方法的黃芪抗氧化性比較各提取方法的黃芪水提物對(duì)DPPH、ABTS+自由基清除力以及鐵離子還原能力由高到低依次為M ＋Y、Y、C ＋Y、S ＋Y、S、C、M，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。Y 比較￥P<0.05

表4 各提取方法的黃芪抗氧化性比較（±s，mgVc/g）

表4 各提取方法的黃芪抗氧化性比較（±s，mgVc/g）

注：與S 比較*P<0.05；與C 比較#P<0.05；與M 比較&P<0.05；與Y 比較%P<0.05；與C ＋Y 比較@P<0.05；與M ＋Y 比較￥P<0.05

提取方法DPPHABTS+鐵離子還原能力水磨提?。⊿）20.57±1.887.45±1.2021.80±5.35超聲輔助提取（C） 9.62±1.12* 4.67±0.62* 10.98±1.40*酶解提?。∕） 5.05±0.38*# 2.12±0.10*# 4.20±0.17*#亞臨界提取（Y） 59.32±4.70*#& 30.66±4.65*#& 185.89±23.89*#&超聲聯(lián)合亞臨界提?。– ＋Y） 45.45±3.69*#&% 21.75±3.70*#&% 153.69±16.67*#&%酶解聯(lián)合亞臨界提?。∕ ＋Y） 71.69±5.69*#&%@ 41.89±5.59*#&%@ 224.89±32.25*#&%@水磨聯(lián)合亞臨界提取（S ＋Y） 31.22±2.79*#&%@￥ 12.65±2.69*#&%@￥ 74.05±9.72*#&%@￥F 15.8206.5096.187 P 0.0010.0010.001

3 討論

多項(xiàng)研究表明，黃芪含有黃酮類、苷類、多糖類等多種化學(xué)成分，同時(shí)其化學(xué)組成復(fù)雜且藥理學(xué)作用廣泛，在臨床中有著極為廣闊的應(yīng)用前景[8]。本研究各類提取方法在黃芪總皂苷取得情況的結(jié)果顯示，在單一提取方式中，使用超聲輔助法提取的含量較高，亞臨界法次之，而酶解法的提取率最低。分析原因，可能是由于黃芪總皂苷的穩(wěn)定性較好，當(dāng)進(jìn)行超聲輔助提取時(shí)，由于超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)及空化反應(yīng)可在一定程度上對(duì)黃芪的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)造成破壞，進(jìn)而增加了化合物的快速溶出率。而當(dāng)采用亞臨界法提取時(shí)，由于溫度較高且壓力較大，在這一狀態(tài)下使得提取的水分子極性強(qiáng)烈縮減，導(dǎo)致熱動(dòng)力學(xué)提高，最終增加了有效成分的提取率。而在聯(lián)合提取中，亞臨界和超聲聯(lián)合法的提取率最高，亞臨界和水磨聯(lián)合法的提取率最低，分析原因可能是由于超聲波在工作中能夠產(chǎn)生一定的纖維素酶并同時(shí)伴隨發(fā)生空化反應(yīng)，而這種反應(yīng)可與提取物細(xì)胞壁所產(chǎn)生的降解反應(yīng)產(chǎn)生作用，因此，在多種因素的共同作用下使得黃芪的細(xì)胞結(jié)構(gòu)徹底被破壞，使皂苷大量溶解并濾出。

本研究在黃芪總黃酮的提取中發(fā)現(xiàn)，水磨法的提取率最高，大約是其他提取方法的2 倍以上，分析原因可能為，在進(jìn)行水磨法提取時(shí)，由于提取中是僅僅對(duì)于原材料本身產(chǎn)生作用，且在促進(jìn)黃酮類化合物濾出的同時(shí)并不會(huì)造成其他因子的破壞，因而極大地提高了提取率及提取純度。而在單一提取方式里，纖維素酶能夠在一定程度上對(duì)植物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，進(jìn)而促進(jìn)了植物活性成分的大量濾出，酶解提取法的取得率次之。而與單一的提取方式相比，聯(lián)合提取法在總黃酮提取率上的優(yōu)勢(shì)并不顯著，原因是由于黃酮類物質(zhì)穩(wěn)定性較差，且在高溫狀態(tài)下容易產(chǎn)生分解反應(yīng)，因此，在進(jìn)行聯(lián)合提取時(shí)對(duì)黃酮的提取率相對(duì)較低。

本研究在黃芪多糖提取中發(fā)現(xiàn)，酶解提取法對(duì)黃芪多糖的提取率中最高，而超聲輔助提取法的提取率最低，可能是在超聲環(huán)境下，長(zhǎng)期的超聲干預(yù)導(dǎo)致多糖因子的結(jié)構(gòu)發(fā)生進(jìn)行性破壞，從而促進(jìn)了多糖的提取率[9]。且有研究表示，經(jīng)纖維素酶干預(yù)后，黃芪多糖可在質(zhì)量分?jǐn)?shù)不發(fā)生改變的情況下增加提取率[10]。這一結(jié)果與本研究相類似。超聲與亞臨界共同提取法所取得的多糖更多，分析原因可能為當(dāng)進(jìn)行聯(lián)合提取時(shí)，能縮短提取時(shí)間以及增加提取效率，也從一定程度上避免了黃芪多糖由于環(huán)境因素而發(fā)生降解反應(yīng)。另有學(xué)者在利用超聲聯(lián)合提取法對(duì)植物多糖進(jìn)行提取的研究中發(fā)現(xiàn)，由于超聲的共同作用，能夠更明顯地改變單糖的形態(tài)結(jié)構(gòu)及組成，并顯著增加多糖的提取率[11]。

據(jù)報(bào)道，多種病理及生理學(xué)表征均與自由基的產(chǎn)生有一定相關(guān)性[12]。由于黃芪具有一定的抗氧化效用，分析其抗氧化活性可為黃芪在臨床治療及藥物干預(yù)中的具體作用機(jī)制提供更加準(zhǔn)確的方向。經(jīng)研究，DPPH 自由基性質(zhì)較為穩(wěn)定，可以被抗氧化劑和一些能夠提供質(zhì)子等相關(guān)因子的清除劑消除，并使其吸光度下降[13]。本研究在DPPH、ABTS+自由基清除率和鐵離子還原能力對(duì)黃芪水提物抗氧化能性的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，不同提取方法得到的黃芪提取液對(duì)DPPH、ABTS+自由基清除力和鐵離子還原能力均能夠表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即亞臨界與其他方法聯(lián)合提取或者單獨(dú)采用亞臨界法進(jìn)行提取時(shí)，體外的抗氧化能力均較強(qiáng)，其中以酶解聯(lián)合亞臨界提取法的抗氧化能力最強(qiáng)?？梢?，不同的提取方法對(duì)黃芪的抗氧化性可能產(chǎn)生不同程度的影響。分析原因可能為，黃芪中含有較為豐富的氨基酸和還原性糖類，而氧化反應(yīng)發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)本身的狀態(tài)產(chǎn)生改變，不會(huì)產(chǎn)生大量新生的活性物質(zhì)，這些物質(zhì)在一定程度上為氧化反應(yīng)提供了必需的羰基和氨基化合物，進(jìn)一步參與氧化反應(yīng)[14，15]。所以這些物質(zhì)極有可能比皂苷、多糖、黃酮具有更高的抗氧化活性。

綜上所述，超聲聯(lián)合亞臨界提取法對(duì)黃芪總皂苷的提取率更高，水磨法對(duì)黃芪總黃酮的提取率更高，酶解提取法對(duì)黃芪多糖的提取率更高。而不同提取法對(duì)黃芪的抗氧化能力影響也不同，其中酶解聯(lián)合亞臨界提取法在DPPH、ABTS+自由基清除及鐵離子還原能力方面均高于其他提取方法。