萬(wàn)夷曼 肖圣慧 白依超 范佳音 王 琰 吳長(zhǎng)艾

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山東泰安 271000

谷子(Setaria italicaL.)是重要的禾本科糧飼作物, 具有適應(yīng)性廣、營(yíng)養(yǎng)豐富、節(jié)水性突出、生長(zhǎng)周期短、基因組小、二倍體自花授粉和單穗結(jié)實(shí)多等特點(diǎn), 已成為研究C4光合作用、非生物響應(yīng)和生物能產(chǎn)生的模式作物[1], 也是未來(lái)確保全球糧食安全和營(yíng)養(yǎng)健康的重要作物[2]。對(duì)谷子基因組學(xué)、農(nóng)藝性狀形成和遺傳機(jī)制的研究具有重要價(jià)值[3-4]。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)谷子遺傳轉(zhuǎn)化的最大困難是基因依賴性以及農(nóng)桿菌對(duì)谷子的低敏感性[5-6]。干燥成熟的谷子種子作為外植體, 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)谷子遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)19.2%[7]。一種谷子新品種xiaomi誘導(dǎo)胚性愈傷組織作為外植體, 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的xiaomi遺傳轉(zhuǎn)化效率約達(dá)23.28%[3]。以冀谷11谷子幼穗為外植體, 抗性愈傷組織獲得率為16.4%[8]。但根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的谷子遺傳轉(zhuǎn)化體系耗時(shí)較長(zhǎng), 需要4到5個(gè)月才可獲得轉(zhuǎn)基因幼苗, 且對(duì)谷子品種要求比較嚴(yán)格[9]。因此, 建立一種普遍適用且高效快捷的谷子遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)谷子基因功能研究至關(guān)重要。

發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶的Ri質(zhì)粒通過(guò)感染植物損傷部位, 可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量生長(zhǎng)迅速和毛狀分支多的毛狀根[10]。另外, 由于具有遺傳穩(wěn)定、激素自主性、分化程度高和次生代謝產(chǎn)物含量高等特點(diǎn)[11], 毛狀根在農(nóng)作物育種、醫(yī)藥合成、環(huán)境修復(fù)以及基因功能研究等方面具有廣泛應(yīng)用[12-15]。發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化, 已在多種植物中獲得成功, 如玉米(Zea maysL.)[16]、大豆(Glycine maxL.)[17]、棉花(Gossypium hirsutumL.)[18]、菠菜(Spinacia oleraceaL.)[19]和向日葵(Helianthus annuusL.)[20]。而發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的谷子發(fā)根誘導(dǎo)體系未見(jiàn)報(bào)道。

研究表明, 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的效率受乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間等多種因素影響。巴戟天(Morinda officinalisHow.)毛狀根誘導(dǎo)時(shí), 在侵染液中加入300 μmol L-1AS誘導(dǎo)毛狀根的效率最高, 誘導(dǎo)率達(dá)到36.7%, 而加入AS的濃度低于100 μmol L-1時(shí), 對(duì)誘導(dǎo)效率影響不大[21]。鉤藤(Uncaria rhynchophylla(Miq.) Jacks)毛狀根在加入100 μmol L-1AS時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)54.76%; 加入200 μmol L-1AS的鉤藤毛狀根轉(zhuǎn)化效率為0[22]。可見(jiàn), 適量的乙酰丁香酮可以提高毛狀根的誘導(dǎo)效率。杜梨(Pyrus betulifoliaBunge)毛狀根誘導(dǎo)產(chǎn)生需要的菌液濃度OD600值為0.3～0.4[23];虎杖(Polygonum cuspidatum)毛狀根誘導(dǎo)產(chǎn)生需要的菌液濃度OD600值為0.8[24]。因此, 毛狀根誘導(dǎo)過(guò)程中選擇適合的菌液濃度也是至關(guān)重要的。此外, 共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短, 發(fā)根農(nóng)桿菌不易附著并進(jìn)入植物細(xì)胞, 導(dǎo)致毛狀根誘導(dǎo)效率低; 而共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可導(dǎo)致外植體死亡, 從而導(dǎo)致毛狀根誘導(dǎo)效率降低[25]。這些研究為發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的谷子發(fā)根誘導(dǎo)體系的建立提供了很好的參考。

CBL (calcineurin B-like proteins)是植物中一類Ca2+感應(yīng)蛋白[26], CBL及其互作蛋白CIPK (CBLinteracting protein kinase)構(gòu)成CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng),在植物應(yīng)對(duì)干旱、鹽漬、低溫等逆境脅迫響應(yīng)中起重要作用[27]。在谷子中,SiCBL1、SiCBL3和SiCBL7受高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[28]。NHX家族蛋白含有Na+/H+exchange (PF00999)蛋白結(jié)構(gòu)域, 主要參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的離子重建和pH平衡, 在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)狗尾草(Setaria viridis) NHX介導(dǎo)Na+的吸收過(guò)程[31]。DVL編碼一類小肽, 具有功能多效性。擬南芥(Arabidopsis thaliana)DVL1過(guò)表達(dá)株系株高變矮、葉片變圓、花簇生、花梗和果莢變短等[32]。苜蓿(Medicago sativaL.) DVL還介導(dǎo)根瘤形成[33]。谷子DVL、SiNHX和SiCBL的生物學(xué)功能研究較少。因此, 本研究通過(guò)比較谷子外植體、品種、乙酰丁香酮、菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的毛狀根誘導(dǎo)效率及遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響, 建立了一種高效的谷子毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系。并利用實(shí)驗(yàn)室已有載體, 通過(guò)蛋白亞細(xì)胞定位和基因功能鑒定證明了該技術(shù)體系在谷子基因功能鑒定中的可行性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

谷子品種Ci846和豫谷1號(hào)(Yugu 1)種子來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源保存中心, 龍珠1號(hào)種子來(lái)自章丘創(chuàng)新源農(nóng)作物種植專業(yè)合作社,xiaomi種子來(lái)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧育種團(tuán)隊(duì), 噸谷種子購(gòu)于育種銷售市場(chǎng); 后期由實(shí)驗(yàn)室自行繁殖保存。

1.2 菌株

發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌種購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司, 后期由實(shí)驗(yàn)室自行保存。

1.3 谷子芽尖外植體培養(yǎng)

挑選100粒均勻飽滿的谷子種子, 用砂紙除去麩皮。無(wú)菌條件下進(jìn)行種子表面消毒: 先用10 mL 75%酒精消毒5 min, 10 mL 0.1%吐溫水沖洗2次; 后依次用10 mL 2.6%次氯酸鈉消毒3 min, 10 mL 0.1%吐溫水沖洗3次, 10 mL無(wú)菌水沖洗5次; 然后將種子用無(wú)菌濾紙吸干, 用無(wú)菌牙簽點(diǎn)于MS培養(yǎng)基,25℃±1℃黑暗培養(yǎng)3 d。取4～7 mm嫩黃色芽尖用于發(fā)根誘導(dǎo)。

1.4 谷子胚性愈傷組織培養(yǎng)

將消毒晾干的種子點(diǎn)于含4.0 mg L-12,4-D和1.0 mg L-16-BA的MS培養(yǎng)基上, 25℃±1℃黑暗培養(yǎng)30 d (期間每10 d更換1次新鮮培養(yǎng)基), 誘導(dǎo)胚性愈傷組織, 取淡黃色緊致的胚性愈傷組織用于發(fā)根誘導(dǎo)。

1.5 毛狀根誘導(dǎo)條件的選擇

1.5.1 外植體選擇 各取谷子50個(gè)芽尖和50塊愈傷組織外植體于20 mL無(wú)菌水懸浮的菌體中(OD600= 0.5) 15 min, 將外植體置于毛狀根誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.5.2 乙酰丁香酮對(duì)毛狀根誘導(dǎo)產(chǎn)生的影響 40個(gè)龍珠1號(hào)芽尖外植體分別于20 mL 1/2 MS或含有50、100、150、200 μmol L-1乙酰丁香酮的1/2 MS液體培養(yǎng)基懸浮菌體(OD600= 0.5) 15 min。

外出學(xué)習(xí)使她產(chǎn)生“頓悟”，教學(xué)技巧、課堂管理和“教書(shū)育人”的教育信念也隨之改變。比如，她的備課方法和教案寫(xiě)法有了改觀，教學(xué)技巧、組織課堂的方法和教學(xué)效果都有很大提高。她對(duì)外語(yǔ)教育的意義有了新認(rèn)識(shí)。這個(gè)階段的職業(yè)發(fā)展特點(diǎn)是主動(dòng)探索外語(yǔ)的教育功能，體現(xiàn)出積極性和主觀能動(dòng)性。教師信念構(gòu)建體現(xiàn)為對(duì)教育信念的反思和探索。

1.5.3 菌液濃度對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響 40個(gè)龍珠1號(hào)芽尖外植體分別于OD600為0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0的含有100 μmol L-1AS的1/2 MS液體培養(yǎng)基中15 min。

1.5.4 暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響 200個(gè)龍珠1號(hào)芽尖外植體于20 mL含100 μmol L-1AS的1/2 MS液體培養(yǎng)基(OD600= 0.5)中15 min, 然后將芽尖外植體分為5組(每組40個(gè)芽尖外植體)置于毛狀根誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 分別暗培養(yǎng)1、2、3、4和5 d。

1.6 相關(guān)培養(yǎng)基配置及培養(yǎng)條件

谷子芽尖外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基: 4.42 g L-1MS+30 g L-1蔗糖+8 g L-1瓊脂。谷子愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基: 4.42 g L-1MS+30 g L-1蔗糖+4.0 mg L-12,4-D+1.0 mg L-16-BA+8 g L-1瓊脂粉。毛狀根誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基: 4.42 g L-1MS+30 g L-1蔗糖+8 g L-1瓊脂。毛狀根誘導(dǎo)擴(kuò)繁培養(yǎng)基: 4.42 g L-1MS+30 g L-1蔗糖+8 g L-1瓊脂+300 mg L-1特美汀。探究乙酰丁香酮對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基: 1/2 MS+15 g L-1蔗糖+0、50、100、150、200 μmol L-1乙酰丁香酮。以上培養(yǎng)基的pH均為5.8, 121℃高溫高壓滅菌20 min。

培養(yǎng)條件: 光照培養(yǎng)箱溫度25 ±1 ,℃ ℃ 光周期為光照16 h/黑暗8 h, 光照強(qiáng)度為125 μmol m-2s-1,培養(yǎng)時(shí)間15 d。每個(gè)處理包括40個(gè)外植體, 統(tǒng)計(jì)30個(gè)外植體的數(shù)據(jù), 包括毛狀根的根長(zhǎng)、毛狀根誘導(dǎo)率和平均生根數(shù), 3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.7 谷子SiDVL1和SiDVL3表達(dá)載體構(gòu)建及定位分析

設(shè)計(jì)SiDVL1(Seita.2G169800.1)和SiDVL3(Seita.3G159000.1)特異引物, 分別通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因cDNA, 利用同源重組的方法將目的基因與載體pCAMBIA1305.1連接, 獲得目的基因融合GFP的表達(dá)載體。將35S::SiDVL1-GFP和35S::SiDVL3-GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)化EHA105感受態(tài)細(xì)胞和K599感受態(tài)細(xì)胞, 轉(zhuǎn)化方法見(jiàn)上海唯地生物技術(shù)公司的感受態(tài)使用說(shuō)明書(shū)。

煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化: 將35S::SiDVL1-GFP-EHA105和35S::SiDVL3-GFP-EHA105目標(biāo)菌株活化, 用滲透液重懸菌體并調(diào)至OD600=1.0, 黑暗放置2～4 h,將含輔助質(zhì)粒p19的農(nóng)桿菌和目標(biāo)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌1∶1混勻, 用1 mL注射器(無(wú)針頭)吸取混合菌液接種煙草葉片背面, 暗培養(yǎng)3 d, 使用激光共聚焦顯微鏡LSM880進(jìn)行GFP熒光鑒定。

DVL定位分析: 將SiDVL1-GFP和SiDVL3-GFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草葉片以及隨機(jī)選取的20條K599介導(dǎo)的毛狀根根尖, 用激光共聚焦顯微鏡LSM880進(jìn)行GFP熒光鑒定, 判斷基因在煙草和谷子毛狀根的定位情況。

1.8 谷子SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7表達(dá)載體構(gòu)建及功能鑒定

設(shè) 計(jì)SiNHX2(Seita.2G160200.1)、SiCBL4(Si002829m)和SiCBL7(Si002269m)的基因特異引物,通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因cDNA, 利用同源重組的方法將目的基因與載體pCAMBIA1305.1連接,獲得目的基因的表達(dá)載體。將35S::SiNHX2、35S::SiCBL4、35S::SiCBL7表達(dá)載體以及空載體(pCAMBIA1305.1)轉(zhuǎn)化K599感受態(tài)細(xì)胞, 轉(zhuǎn)化方法見(jiàn)上海唯地生物技術(shù)公司的感受態(tài)使用說(shuō)明書(shū)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用以下公式進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì), 采用GraphPad Prism 6.01軟件作圖, 利用LSD和Duncan’s方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

毛狀根誘導(dǎo)率(%) = 產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)/侵染的外植體總數(shù)×100%;

外植體的平均生根數(shù)(條) = 所有外植體產(chǎn)生的毛狀根數(shù)/產(chǎn)生毛狀根的外植體;

毛狀根的轉(zhuǎn)化效率(%) = PCR驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)基因毛狀根數(shù)或有GFP熒光的毛狀根數(shù)/毛狀根總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子外植體選擇

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)谷子遺傳轉(zhuǎn)化時(shí), 未成熟的花序、成熟的莖尖、未成熟胚胎或花序誘導(dǎo)的愈傷組織均可作為谷子外植體, 但是不同外植體的遺傳轉(zhuǎn)化效率存在很大差異[3]。本試驗(yàn)用谷子芽尖和胚性愈傷組織為外植體, 利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)谷子毛狀根。結(jié)果表明, 胚性愈傷組織作為外植體產(chǎn)生毛狀根需要10 d, 且生長(zhǎng)緩慢(圖1-A), 芽尖外植體產(chǎn)生毛狀根需要5 d, 生長(zhǎng)較快(圖1-B)。培養(yǎng)14 d時(shí),谷子芽尖誘導(dǎo)的毛狀根顯著長(zhǎng)于胚性愈傷組織誘導(dǎo)的毛狀根(圖1-C), 芽尖誘導(dǎo)毛狀根的效率顯著高于胚性愈傷組織誘導(dǎo)毛狀根的效率(圖1-D)。說(shuō)明谷子芽尖比胚性愈傷組織更適合用作毛狀根誘導(dǎo)外植體。

圖1 不同外植體對(duì)誘導(dǎo)毛狀根的影響Fig. 1 Effects of different types of explants on hairy roots inductionA和B分別為發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染谷子胚性愈傷組織和芽尖外植體誘導(dǎo)10 d和5 d時(shí)毛狀根發(fā)生情況; C: 培養(yǎng)14 d誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的根長(zhǎng); D: 培養(yǎng)14 d誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的誘導(dǎo)效率。3次生物學(xué)重復(fù),n= 30。采用單因素方差分析, 不同字母表示差異顯著(P＜ 0.05)。A and B: Foxtail millet’s hairy-root development afterA. rhizogenesstrain K599 infecting embryogenic callus for 10 days and bud tips for 5 days, respectively. C: the root length of induced hairy roots cultured for 14 days. D: the induction efficiency of hairy roots cultured for 14 days. Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis. Different letters indicate significant differences atP＜ 0.05.

2.2 不同品種的芽尖外植體對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響

谷子遺傳轉(zhuǎn)化具有基因依賴性以及農(nóng)桿菌低敏感性等限制[5-6]。本試驗(yàn)對(duì)Ci846、xiaomi、龍珠1號(hào)、豫谷1號(hào)和噸谷5個(gè)品種的谷子芽尖外植體進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo), 發(fā)現(xiàn)5個(gè)供試品種的芽尖外植體均能誘導(dǎo)產(chǎn)生白色毛狀根, 且形態(tài)相似(圖2-A～E); 毛狀根長(zhǎng)度均在1.5～2.0 cm之間(圖2-F); 毛狀根誘導(dǎo)率均在70%左右(圖2-G); 平均產(chǎn)生毛狀根數(shù)目約4條(圖2-H)。說(shuō)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)谷子毛狀根可能不受品種限制, 易于推廣應(yīng)用, 可能是一種突破品種限制提高谷子遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。

圖2 不同谷子品種的芽尖外植體對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響Fig. 2 Effects of bud tip explants from different millet varieties on hairy roots inductionA～E: 分別為Ci846 (A)、xiaomi(B)、噸谷(C)、龍珠1號(hào)(D)和豫谷1號(hào)(E)芽尖外植體對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響; F: 不同品種來(lái)源的芽尖外植體誘導(dǎo)毛狀根的根長(zhǎng); G: 不同品種來(lái)源的芽尖外植體誘導(dǎo)毛狀根的誘導(dǎo)效率; H: 不同品種來(lái)源的芽尖外植體誘導(dǎo)毛狀根的平均生根數(shù)。3次生物學(xué)重復(fù),n= 30。采用單因素方差分析, ns表示在0.05概率水平無(wú)顯著差異。A-E: the effects of Ci846,xiaomi, Dungu, Longzhu 1, and Yugu 1 on hairy roots induction, respectively. F: the root length of induced hairy roots using bud tips from indicated varieties as the explants. G: the induction efficiency of hairy roots when bud tips from indicated varieties were used as the explants. H: the average induced hairy root number when bud tips from indicated varieties were used as the explants. Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis; ns indicates no significant correlation at the 0.05 probability level.

2.3 乙酰丁香酮對(duì)谷子毛狀根誘導(dǎo)的影響

乙酰丁香酮在農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化體系中起到提高質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化效率的作用[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)0、50、100、150和200 μmol L-1的AS處理龍珠1號(hào)芽尖能夠誘導(dǎo)分支多、無(wú)向地性的白色毛狀根(圖3-A～E)。誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d的毛狀根根長(zhǎng)分別為0.69、0.75、0.95、0.65和0.59 cm (圖3-F); 毛狀根誘導(dǎo)率分別為50.15%、59.93%、80.15%、71.65%和59.54% (圖3-G), 平均生根數(shù)分別為1條、2條、3條、2條和2條(圖3-H)。說(shuō)明在侵染液和共培養(yǎng)基中加入AS有利于谷子毛狀根誘導(dǎo), 其中100 μmol L-1AS對(duì)谷子毛狀根的誘導(dǎo)效果最好。

圖3 乙酰丁香酮對(duì)谷子毛狀根誘導(dǎo)的影響Fig. 3 Effects of AS on foxtail millet hairy roots inductionA～E: 分別為0、50、100、150和200 μmol L-1AS對(duì)誘導(dǎo)毛狀根的影響; F: 0、50、100、150和200 μmol L-1AS誘導(dǎo)毛狀根的根長(zhǎng); G:0、50、100、150和200 μmol L-1AS誘導(dǎo)毛狀根的誘導(dǎo)效率; H: 0、50、100、150和200 μmol L-1AS誘導(dǎo)毛狀根的平均生根數(shù)。3次生物學(xué)重復(fù),n= 30。采用單因素方差分析, 不同字母表示差異顯著(P＜ 0.05)。A-E: the effect of 0, 50, 100, 150, and 200 μmol L-1AS on hairy roots induction, respectively. F: the root length of induced hairy roots in the presence of 0, 50, 100, 150, and 200 μmol L-1AS. G: the induction efficiency of hairy roots in the presence of 0, 50, 100, 150, and 200 μmol L-1AS. H: the average induced root number in the presence of 0, 50, 100, 150, and 200 μmol L-1AS. Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis. Different letters indicate significant differences atP＜ 0.05.

2.4 菌液濃度對(duì)谷子毛狀根誘導(dǎo)的影響

適宜的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液濃度是影響遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素[34]。本研究分別用OD600= 0.1、0.2、0.3、0.5、0.8和1.0的菌液侵染龍珠1號(hào)芽尖。結(jié)果表明所有濃度的菌液均能誘導(dǎo)白色毛狀根, 但存在差異(圖4-A～F)。6個(gè)菌液濃度誘導(dǎo)毛狀根根長(zhǎng)分別為3.51、3.94、7.15、5.18、4.25和3.85 cm (圖4-G); 毛狀根誘導(dǎo)率分別為54.85%、55.56%、74.54%、76.25%、62.89%和60.75% (圖4-H); 平均生根數(shù)分別為2條、2條、3條、4條、2條和2條(圖4-I)。說(shuō)明OD600為0.3的菌液誘導(dǎo)的毛狀根根長(zhǎng)最長(zhǎng), OD600為0.5的菌液誘導(dǎo)的毛狀根效率和平均生根數(shù)最高。后續(xù)試驗(yàn)用OD600為0.5的菌液濃度進(jìn)行侵染。

圖4 菌液濃度對(duì)谷子毛狀根誘導(dǎo)的影響Fig. 4 Effect of bacterium concentration on foxtail millet hairy roots inductionA～F: OD600分別為0.1、0.2、0.3、0.5、0.8和1.0對(duì)誘導(dǎo)毛狀根的影響; G: 不同菌液濃度誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的根長(zhǎng); H: 不同菌液濃度誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的誘導(dǎo)效率; I: 不同菌液濃度誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的平均生根數(shù)。3次生物學(xué)重復(fù),n= 30。采用單因素方差分析, 不同字母表示差異顯著(P＜ 0.05)。A-F: the effect of bacteria solution at concentrations 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.8, and 1.0 OD600on hairy roots induction, respectively. G: the root length of induced hairy roots by bacteria at concentrations mentioned in (A-F), respectively. H: the induction efficiency of hairy roots by bacteria solution at concentrations mentioned in (A-F), respectively. I: the average induced rooting number by bacteria solution at concentrations mentioned in (A-F), respectively. Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis. Different letters indicate significant differences atP＜ 0.05.

2.5 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)谷子毛狀根誘導(dǎo)的影響

外源基因轉(zhuǎn)移至植物受體細(xì)胞的過(guò)程, 主要是由外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間決定[25]。為探究谷子發(fā)根誘導(dǎo)的最佳共培養(yǎng)時(shí)間, 本研究比較了1、2、3、4和5 d共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)龍珠1號(hào)毛狀根誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明5種共培養(yǎng)時(shí)間均能誘導(dǎo)谷子毛狀根產(chǎn)生, 但存在明顯差異(圖5-A～E)。與其他共培養(yǎng)時(shí)間相比, 共培養(yǎng)3 d時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根最長(zhǎng)(3.58 cm) (圖5-F), 毛狀根誘導(dǎo)率最高(65.35%)(圖5-G), 平均生根數(shù)最多(3條) (圖5-H)。說(shuō)明K599侵染后共培養(yǎng)3 d對(duì)谷子毛狀根誘導(dǎo)效果最好。

圖5 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)谷子毛狀根誘導(dǎo)的影響Fig. 5 Effect of co-culture time on foxtail millet hairy roots inductionA～E: 分別為共培養(yǎng)1、2、3、4和5 d對(duì)誘導(dǎo)毛狀根的影響; F: 共培養(yǎng)1、2、3、4和5 d誘導(dǎo)毛狀根的根長(zhǎng); G: 共培養(yǎng)1、2、3、4和5 d誘導(dǎo)毛狀根的效率; H: 共培養(yǎng)1、2、3、4和5 d誘導(dǎo)毛狀根的平均生根數(shù)。3次生物學(xué)重復(fù),n= 30。采用單因素方差分析, 不同字母表示差異顯著(P＜ 0.05)。A-E: the effects of co-culture time of 1, 2, 3, 4, and 5 day(s) on hairy roots induction, respectively. F: the root length of induced hairy roots after co-culture for 1, 2, 3, 4, and 5 day(s). G: the induction efficiency of hairy roots after co-culture for 1, 2, 3, 4, and 5 day(s). H: the average hairy root number after co-culture for 1, 2, 3, 4, and 5 day(s). Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis. Different letters indicate significant differences atP＜ 0.05.

2.6 優(yōu)化條件下谷子毛狀根誘導(dǎo)效率驗(yàn)證

為驗(yàn)證優(yōu)化條件下谷子毛狀根的誘導(dǎo)效率, 本研究用含有100 μmol L-1AS、OD600為0.5的菌液侵染龍珠1號(hào)芽尖15 min, 在含有100 μmol L-1AS的MS固體培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)3 d, 轉(zhuǎn)移至含有300 mg L-1特美汀的MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d。試驗(yàn)重復(fù)12次, 共侵染253個(gè)芽尖。結(jié)果表明平均每個(gè)芽尖誘導(dǎo)毛狀根數(shù)目為3條, 毛狀根誘導(dǎo)效率達(dá)到80.24% (表1), 高于單獨(dú)最佳AS濃度、共培養(yǎng)時(shí)間和菌液濃度對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)效率, 接近于棉花子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的誘導(dǎo)率(82%)[18]。

表1 芽尖外植體誘導(dǎo)毛狀根的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Data statistics of hairy root by shoot tip explants induction

2.7 谷子毛狀根在基因功能驗(yàn)證研究中的應(yīng)用

為利用谷子毛狀根體系進(jìn)行科學(xué)研究, 本研究構(gòu)建了SiDVL-GFP谷子表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599, 侵染龍珠1號(hào)芽尖并誘導(dǎo)毛狀根。隨機(jī)選取388條毛狀根, 提取毛狀根基因組DNA進(jìn)行GFP基因的PCR檢測(cè)。以無(wú)菌苗正常根作為陰性對(duì)照, 空載體質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。其中277條毛狀根檢測(cè)出目的大小的條帶(部分結(jié)果見(jiàn)圖6)。進(jìn)一步計(jì)算發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)谷子芽尖外植體產(chǎn)生毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)到71%。

圖6 部分轉(zhuǎn)基因發(fā)根的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig. 6 Verification of transgenic hairy root by PCRM: DNA marker; 1: 基因表達(dá)載體質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照); 2～33: 基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化毛狀根的DNA; WT: 空載體轉(zhuǎn)化毛狀根DNA。M: DNA marker. 1: the gene expression vector was used as the positive control. 2-33: DNA from induced hairy root samples. WT: the empty vector from induced hairy root samples was used as the negative control.

同時(shí), 本研究隨機(jī)選取20條SiDVL1-GFP和SiDVL3-GFP轉(zhuǎn)化的毛狀根根尖, 用激光共聚焦顯微鏡LSM880進(jìn)行GFP熒光鑒定。結(jié)果表明帶有GFP熒光信號(hào)的毛狀根有15條(部分?jǐn)?shù)據(jù)見(jiàn)圖7),進(jìn)一步計(jì)算發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)谷子芽尖外植體產(chǎn)生毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)到75%, 與PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致。SiDVL1-GFP和SiDVL3-GFP在谷子發(fā)根中的亞細(xì)胞定位與其在煙草葉片中的定位一致(圖7)。說(shuō)明該系統(tǒng)可用于谷子蛋白的亞細(xì)胞定位分析。

圖7 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的谷子DVL基因定位分析Fig. 7 Subcellular localization ofSiDVLgenes usingA. rhizogenes-mediated hairy root transformation

為利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因功能鑒定, 本研究將構(gòu)建的SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7的谷子表達(dá)載體利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化谷子芽尖, 獲得谷子轉(zhuǎn)基因植株,進(jìn)行耐鹽性分析。結(jié)果表明,SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉(zhuǎn)基因谷子幼苗在正常條件下的生長(zhǎng)與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷子幼苗(對(duì)照)無(wú)明顯差異; 而在175 mmol L-1NaCl條件下,SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉(zhuǎn)基因谷子幼苗的存活率顯著高于對(duì)照(圖8), 說(shuō)明SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7提高谷子的耐鹽性, 同時(shí)證明該體系可用于谷子基因功能鑒定。

圖8 SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉(zhuǎn)基因谷子幼苗對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)Fig. 8 Responses of foxtail millet withSiNHX2,SiCBL4, andSiCBL7transformed hairy-roots to salt stressA:SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉(zhuǎn)發(fā)根谷子幼苗在含有175 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基為對(duì)照)上生長(zhǎng)7 d的表型; B:SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉(zhuǎn)基因谷子幼苗在含有175 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基為對(duì)照)上生長(zhǎng)7 d的存活率統(tǒng)計(jì)。3次生物學(xué)重復(fù),n= 30。ns表示在0.05概率水平無(wú)顯著差異, ***表示在0.01概率水平顯著相關(guān)。A: the phenotypes of millet seedlings withSiNHX2,SiCBL4, andSiCBL7transformed hairy-roots when treated on MS medium with or without 175 mmol L-1NaCl for 7 days. B: the survival rates of millet seedlings withSiNHX2,SiCBL4, andSiCBL7transformed hairy-roots when treated on MS medium with or without 175 mmol L-1NaCl for 7 days. Three biological experiments were repeated,n= 30. ns indicates no significant correlation in the 0.05 probability level; *** indicates significant correlation at the 0.01 probability level.

3 討論

3.1 不同外植體影響谷子毛狀根誘導(dǎo)效率

在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)谷子遺傳轉(zhuǎn)化時(shí), 未成熟的花序、成熟的莖尖、未成熟胚胎或花序誘導(dǎo)的愈傷組織均可作為谷子外植體, 但是這些外植體獲取的時(shí)間較長(zhǎng), 不同外植體遺傳轉(zhuǎn)化效率存在很大差異[3]。發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化效率較高, 如以虎杖葉片為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到92%[24]; 以棉花子葉為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的誘導(dǎo)率達(dá)到82%[18]。本研究發(fā)現(xiàn)谷子胚性愈傷組織作為外植體時(shí)產(chǎn)生毛狀根需要10 d, 而且毛狀根生長(zhǎng)緩慢; 而以谷子芽尖作為外植體時(shí)產(chǎn)生毛狀根需要5 d, 且毛狀根生長(zhǎng)較快(圖1)。說(shuō)明不同外植體對(duì)谷子毛狀根誘導(dǎo)效果具有較大影響。

3.2 菌液濃度、乙酰丁香酮和共培養(yǎng)時(shí)間影響谷子毛狀根誘導(dǎo)效率

研究表明菌液濃度、乙酰丁香酮和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)也有很大影響。杜梨和虎杖毛狀根誘導(dǎo)產(chǎn)生需要的菌液濃度OD600分別為0.3～0.4[23]和0.8[24]。巴戟天[21]和鉤藤[22]毛狀根誘導(dǎo)適宜的乙酰丁香酮濃度分別為300 μmol L-1和100 μmol L-1。外源基因轉(zhuǎn)移至植物受體細(xì)胞的過(guò)程, 主要是由外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間決定, 而共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短, 發(fā)根農(nóng)桿菌不易附著并進(jìn)入植物細(xì)胞, 發(fā)揮作用的Ri質(zhì)粒減少, 導(dǎo)致毛狀根誘導(dǎo)效率低; 而共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可導(dǎo)致外植體死亡, 從而導(dǎo)致毛狀根誘導(dǎo)效率降低[23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液在OD600為0.5時(shí)對(duì)谷子毛狀根的誘導(dǎo)效率較高(圖4)。侵染液中加入適量的乙酰丁香酮共培養(yǎng)3 d時(shí)有助于谷子芽尖誘導(dǎo)谷子毛狀根(圖3和圖5)。因此, 合適的菌液濃度、乙酰丁香酮和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)谷子芽尖誘導(dǎo)毛狀根具有顯著的促進(jìn)作用。

3.3 谷子毛狀根體系具有重要的應(yīng)用價(jià)值

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物產(chǎn)生的毛狀根在農(nóng)作物育種、醫(yī)藥合成、環(huán)境修復(fù)以及基因功能研究等方面具有廣泛應(yīng)用[12-15]。本研究利用谷子毛狀根體系進(jìn)行的蛋白亞細(xì)胞定位分析(圖7)和基因功能鑒定(圖8), 說(shuō)明發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的谷子芽尖毛狀根是一種谷子蛋白亞細(xì)胞定位分析和基因功能鑒定的快速有效的方法。此外, 谷子遺傳轉(zhuǎn)化具有基因型依賴性[5-6], 且根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)谷子遺傳轉(zhuǎn)化的效率較低, Y4品種為4.72%[35], 而xiaomi品種約為23.28%[3]。本研究發(fā)現(xiàn)谷子品種對(duì)毛狀根誘導(dǎo)效率無(wú)影響, 誘導(dǎo)效率較高, 均能達(dá)到70% (圖2), 說(shuō)明谷子毛狀根可能是一種突破品種限制提高谷子遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。

4 結(jié)論

利用OD600為0.5的K599介導(dǎo)谷子芽尖外植體,在加入100 μmol L-1AS的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3 d, 谷子毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)70%, 同時(shí)該體系可進(jìn)行基因定位和功能分析, 因此本研究建立了一種突破品種限制高效快速鑒定谷子基因功能的方法。