毛海嬋,鄭武娟,曾文軍,楊麗玲,李明,阮建波

痤瘡是一種毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病,好發(fā)于青春期,且具有損容性[1]。2021年,中國一項對中學(xué)生的流行病學(xué)調(diào)查顯示痤瘡現(xiàn)患率高達60.21%[2]。痤瘡丙酸桿菌(Cutibacteriumacnes,C.acnes)是痤瘡重要發(fā)病機制之一,以抗生素治療來降低皮損中C.acnes種群密度,從而達到治療效果,獲得《中國痤瘡治療指南》推薦[1]。自1960年由美國首次報道分離出C.acnes至抗生素被廣泛應(yīng)用于痤瘡治療,其耐藥性問題日益顯著。C.acnes的抗生素耐藥現(xiàn)象,以大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類耐藥問題較為突出,且這兩類藥物抗菌作用機制相似,二者交叉耐藥現(xiàn)象較為普遍[3]。國內(nèi)一項Meta分析[4]顯示,痤瘡丙酸桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素耐藥率分別為45%、74%和59%,林可酰胺類的克林霉素耐藥率高達88%。既往文獻報道細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥可能與外排泵相關(guān),使用外排泵抑制劑可降低細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素、克拉霉素和泰利霉素的耐藥性[5]。為此,本研究收集臨床分離的痤瘡丙酸桿菌,使用外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙(Carbonyl cyanide-3-chlorophenylhydrazone,CCCP)和(苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺(phenylalanine-arginine β-naphthylamide,PAβN)聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗菌藥物進行藥物敏感性試驗,測定最小抑菌濃度,觀察外排泵抑制劑是否影響?zhàn)畀彵釛U菌的耐藥性,以期通過外排泵抑制劑降低C.acnes對大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素的耐藥性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株C.acnes標(biāo)準(zhǔn)株:ATCC11827,購于廣東省微生物菌種保藏中心。C.acnes臨床分離株39株:2015年6月—2016年10月來自暨南大學(xué)附屬東莞醫(yī)院痤瘡患者皮損處收集樣本。

1.1.2試劑與儀器 紅霉素(ERY)、阿奇霉素(AZM)、林可霉素(LIN)和克拉霉素(CLA)(中國食品藥品檢定研究院),鹽酸克林霉素(CLI)(美國洛杉磯PANPHY化學(xué)公司),CCCP和PAβN(美國Sigma公司)。VITEK MS plus質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司),細(xì)菌多點接種儀(MIT-P型)(日本株式會社佐久間制所),厭氧培養(yǎng)罐(AJ9050型)和多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng)(Multi-Purpose Incubator型)(廣州市尤德生物科技有限公司),標(biāo)準(zhǔn)混合氣體裝置(CO2:10%,H2:10%,N2:80%)(大連大特氣體有限公司),麥?zhǔn)媳葷岫葍x(BIOMERIEUX DensiCHEK Plus)。

1.2方法

1.2.1菌株復(fù)蘇鑒定 從-70 ℃冰箱中取出菌種,復(fù)蘇后進行厭氧血瓊脂平板培養(yǎng)、菌落形態(tài)判斷、革蘭染色鏡檢、純化培養(yǎng)及VITEK MS plus質(zhì)譜分析[6],質(zhì)譜評分大于2.0為鑒定至種水平。

1.2.2藥敏試驗 按照瓊脂稀釋法[7],對大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素)和林可酰胺類(克林霉素、林可霉素)設(shè)置0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL濃度梯度布氏血瓊脂平板進行藥敏試驗。

1.2.3外排泵抑制試驗 根據(jù)藥敏結(jié)果分多重耐藥組、單一耐藥組進行外排泵抑制試驗。按照瓊脂稀釋法[7],以外排泵抑制劑聯(lián)合抗菌藥物:CCCP+紅霉素,PAβN+紅霉素,CCCP+阿奇霉素,PAβN+阿奇霉素,CCCP+克拉霉素,PAβN+克拉霉素,CCCP+克林霉素,PAβN+克林霉素,CCCP+林可霉素,PAβN+林可霉素。每種抗生素濃度設(shè)置0.062 5、0.125、0.25 、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL (共13個濃度)制備布氏血瓊脂平板。外排泵抑制劑濃度使用10 μg/mL參考文獻[8]。

1.2.4MIC值 調(diào)節(jié)菌液濁度為0.5麥?zhǔn)蠞岫?相當(dāng)于105CFU/點),使用多點接種儀從低濃度到高濃度依次接種含抗菌藥物系列稀釋濃度平板,接種前后各需接種兩個空白對照平板。待平板吸收接種物后,置于厭氧培養(yǎng)罐內(nèi),放入?yún)捬踔甘緞┖痛呋瘎?密閉罐體,使之連接多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng),待罐內(nèi)達到厭氧環(huán)境,置于36 ℃恒溫箱孵育48 h,測定藥物MIC值。

1.2.5結(jié)果判讀 藥敏試驗:抗菌藥物解釋標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI《Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria, approved standard seventh edition》[7]。多重耐藥菌株指對兩種或以上大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素耐藥;單一耐藥菌株指僅對一種大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素耐藥;敏感菌株指對大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素(紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、林可霉素)均敏感;外排泵抑制試驗:先觀察只含外排泵抑制劑的平板中細(xì)菌的生長是否有抑制作用。再觀察外排泵抑制劑聯(lián)合抗菌藥物的平板,藥物MIC值是否降低。外排泵抑制劑聯(lián)合抗菌藥物的MIC結(jié)果判讀參照藥敏試驗的步驟。以聯(lián)合外排泵抑制劑后,抗菌藥物MIC值降低≥4倍為外排泵表型陽性菌[8-9],即MIC值至少降低兩個濃度梯度。

2 結(jié)果

2.1鑒定結(jié)果 39株前期收集的凍存菌株,經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)、純化、革蘭染色鏡檢、質(zhì)譜鑒定,結(jié)果均為C.acnes(質(zhì)譜鑒定得分均>2.0,細(xì)菌均鑒定至種水平)。

2.2藥敏試驗結(jié)果 39株C.acnes的大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類藥物藥敏試驗結(jié)果,MIC值詳見表1。耐藥菌29株(74.36%),包括多重耐藥菌株27株(69.23%)和單一耐藥菌株2株(5.13%);敏感菌株10株(25.64%)。

表1 痤瘡丙酸桿菌對大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素的MIC值分布情況 (μg/mL,n=39)

2.3外排泵抑制試驗結(jié)果 多重耐藥組:CCCP+阿奇霉素篩選出5株外排泵表型陽性菌株,CCCP+克拉霉素篩選出2株外排泵表型陽性菌株(菌株編號為27號、38號,這兩株菌株包含在前述以阿奇霉素為外排底物的外排泵陽性的5株菌中),CCCP+紅霉素、克林霉素、林可霉素時,菌株外排泵表型均為陰性;PAβN+克拉霉素篩選出2株外排泵表型陽性菌株(菌株編號為38號、91號,此38號菌株與CCCP+克拉霉素外排泵陽性菌株38號菌株一致),PAβN+紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素時,菌株外排泵表型均為陰性。外排泵表型陽性菌株其MIC值變化見表2～3。其中38號菌以克拉霉素為底物時,聯(lián)合CCCP或PAβN的MIC值均由128 μg/mL降至16 μg/mL。另外,存在部分菌株MIC值僅降低2倍,CCCP+紅霉素有3株菌(MIC值由>256 μg/mL降至256 μg/mL)、CCCP+克拉霉素有1株菌(>256 μg/mL降至256 μg/mL)、PAβN+紅霉素有1株菌(256 μg/mL降至128 μg/mL)、PAβN+克林霉素有7株菌(128 μg/mL降至64 μg/mL)。CCCP或PAβN+林可霉素,藥物MIC未發(fā)生變化。單一耐藥組:以兩種外排泵抑制劑分別聯(lián)合5種抗生素后MIC值未發(fā)生變化,菌株外排泵表型均為陰性。

表2 使用CCCP前后外排泵表型陽性菌株MIC (μg/mL)

表3 使用PAβN前后外排泵表型陽性菌株MIC (μg/mL)

3 討論

痤瘡是皮膚科常見病,C.acnes通過天然免疫和獲得性免疫參與了痤瘡的發(fā)生發(fā)展,是痤瘡重要發(fā)病機制之一[1]。然而,近十年來,國內(nèi)不斷有C.acnes的耐藥報道[4]。本研究中39株臨床分離的痤瘡丙酸桿菌對大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺耐藥率為74.36%(29/39),與2019年國內(nèi)一項痤瘡患者皮損中痤瘡丙酸桿菌對抗生素耐藥性的Meta分析報道高耐藥率結(jié)果相似[4]。C.acnes高耐藥性的產(chǎn)生,可導(dǎo)致痤瘡治療失敗、皮膚微生物菌群紊亂、局部和系統(tǒng)條件致病菌感染和耐藥株傳播等不良影響[10]。因此,降低C.acnes耐藥性對痤瘡治療具有重要意義。

細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類耐藥的機制主要有三種:①外排泵;②滅活酶;③基因變異或攜帶耐藥基因。既往關(guān)于痤瘡丙酸桿菌對大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類耐藥的機制主要集中于耐藥基因ermX和23S rRNA點突變[11]。然而,罕見C.acnes外排泵相關(guān)耐藥機制報道。外排泵是在細(xì)菌細(xì)胞膜上的一些轉(zhuǎn)運膜蛋白,這些膜蛋白通過主動耗能改變自身構(gòu)象,將藥物選擇性或非選擇性地泵出細(xì)菌細(xì)胞外,使達到作用靶位的抗菌藥物濃度顯著降低而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥[12]。通過使用外排泵抑制劑可抑制外排泵的活性,達到降低耐藥菌株耐藥性的效果,CCCP與PAβN是目前使用較多的外排泵抑制劑。CCCP是一種氧化磷酸化抑制劑,是線粒體質(zhì)子載體解偶聯(lián)劑,可增加線粒體膜對質(zhì)子的通透性,從而破壞線粒體膜電位,使外排轉(zhuǎn)運系統(tǒng)因能量缺乏而主動外排作用受限,導(dǎo)致抗菌藥物在菌體內(nèi)蓄積,從而提高細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性[13]。PAβN則通過競爭性結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白上的結(jié)合位點,以阻止進入細(xì)菌內(nèi)的抗菌藥物及其他底物與該位點的結(jié)合,減少藥物的外排,使細(xì)菌內(nèi)藥物濃度不受外排泵的影響,提高抗菌藥物的效果[14]。

本研究采用CCCP和PAβN兩種外排泵抑制劑,分別聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素)及林可酰胺類(克林霉素、林可霉素)進行外排泵抑制試驗,發(fā)現(xiàn)在多重耐藥組C.acnes中存在外排泵表型陽性菌株:以CCCP+阿奇霉素篩選出5株外排泵表型陽性菌株,MIC值由>256 μg/mL降至<0.062 5 μg/mL,細(xì)菌由耐藥變?yōu)槊舾?CCCP+克拉霉素篩選出2株外排泵表型陽性菌株(編號為27、38號包含在前述5株菌中)。其中27號、38號菌在CCCP作用下,阿奇霉素、克拉霉素的MIC值降低≥4倍,說明CCCP對這兩株菌的外排轉(zhuǎn)運阿奇霉素和克拉霉素的外排泵具有顯著的抑制作用。與Deng等[15]報道結(jié)果相似,CCCP對篩選外排泵陽性菌株及降低菌株耐藥性方面較PAβN更有優(yōu)勢。本研究PAβN+克拉霉素也篩選出2株菌外排泵表型陽性菌株,但與CCCP+克拉霉素篩選的菌株不完全一致,其中38號菌是共有的,均表現(xiàn)出外排泵抑制現(xiàn)象。38號菌在PAβN作用下,克拉霉素的MIC值由128 μg/mL降至16 μg/mL,但阿奇霉素的MIC值并未發(fā)生變化,提示CCCP對外排泵的抑制作用較PAβN更廣譜,這可能與CCCP和PAβN的作用機制不同相關(guān),CCCP作為一種氧化磷酸化抑制劑,廣泛影響外排泵的能量供應(yīng)從而抑制外排泵作用,而PAβN則需競爭性結(jié)合某種轉(zhuǎn)運蛋白上的結(jié)合位點才能起抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)耐藥性C.acnes中存在外排泵導(dǎo)致耐藥,外排泵抑制劑CCCP和PAβN能一定程度上降低多重耐藥痤瘡丙酸桿菌對大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類抗生素的耐藥性。但文獻報道的外排泵系統(tǒng)種類繁多、機制復(fù)雜,不同細(xì)菌對同種抗生素或同種細(xì)菌對不同抗生素的外排作用可由不同的外排泵參與[12],未來研究重點是痤瘡丙酸桿菌的多重耐藥與哪些外排泵相關(guān),總而言之,本研究為解決C.acnes耐藥的藥物開發(fā)提供一定參考。