韓冰清 劉紅云

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,奶業(yè)科學(xué)研究所,杭州 310058)

滿足反芻動物生理需要的氨基酸組成可最大限度地提高機體對攝入蛋白質(zhì)的吸收利用。對于奶牛而言,瘤胃微生物可利用飼糧中的瘤胃可降解蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為菌體蛋白或合成內(nèi)源性氨基酸,并隨瘤胃不可降解蛋白質(zhì)(rumen-undegraded protein,RUP)一起在小腸被消化吸收。而飼糧蛋白質(zhì)含量過高或氨基酸模式不平衡均會降低反芻動物小腸蛋白質(zhì)的利用率。研究表明,賴氨酸(lysine,Lys)是以玉米為基礎(chǔ)飼糧的奶牛的限制性氨基酸[1],也是奶牛必需氨基酸(essential amino acid,EAA)之一。補充過瘤胃賴氨酸(rumen-protected lysine,RPL)可提高奶牛采食量[2]、氮利用率[3]和泌乳性能[2],增加到達小腸可吸收利用的氨基酸含量,調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)[4-5]、免疫功能[6]和瘤胃發(fā)酵參數(shù)[7],減少飼糧蛋白質(zhì)消耗[2],參與能量代謝[8-9]并維持乳腺健康[6]。乳蛋白不僅具有豐富的營養(yǎng)價值,還是評價奶牛泌乳功能的重要指標(biāo)。雖然越來越多的研究關(guān)注到Lys對奶牛乳蛋白合成的影響,但其影響機制缺乏系統(tǒng)性的整理與歸納。本文圍繞Lys對奶牛乳蛋白合成的影響,綜述了Lys影響乳蛋白合成機制的研究進展,并對其潛在研究方向進行展望,以期為Lys在奶牛養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用和后續(xù)研究提供參考。

1 乳蛋白概述

乳蛋白是評價乳質(zhì)量的重要指標(biāo),其組成與含量直接影響乳及乳制品的營養(yǎng)價值。在牛奶中,蛋白質(zhì)含量約占3.5%,其中80%約為酪蛋白,20%約為乳清蛋白[10]。乳中含有αs1、αs2、β和κ這4種酪蛋白,分別占總?cè)榈鞍椎?9%～46%、8%～10%、25%～35%和8%～15%[10]。酪蛋白具有較高的生物利用度及多種營養(yǎng)功能,包括提供高質(zhì)量蛋白質(zhì)、與鈣磷結(jié)合促進骨骼健康、支持肌肉生長和修復(fù)、改善免疫系統(tǒng)功能以及促進胃內(nèi)膠束形成維持飽腹感等[11]。乳清蛋白以α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-LA)和β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)為主,分別占總?cè)榍宓鞍椎?0%～25%和50%[10],其余組成包括乳鐵蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白、乳過氧化物酶和溶菌酶等[12]。α-LA和β-LG富含支鏈氨基酸(branched chain amino acid,BCAA),參與腫瘤抑制過程[13]。乳鐵蛋白具有較好的鐵吸收轉(zhuǎn)運、抗炎、抗腫瘤和抗氧化等生物功能[14]。乳蛋白酶解后產(chǎn)生β-酪啡肽等生物活性肽,參與心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[14]。

2 Lys影響奶牛乳蛋白合成

2.1 Lys的生理功能

Lys化學(xué)名稱為2,6-二氨基己酸,其構(gòu)型分為L型和D型,且只有L-Lys具有生物活性。Lys直接參與或調(diào)節(jié)激素、肌肉、酶類和乳蛋白等蛋白質(zhì)或肽的合成[15]。當(dāng)機體吸收的碳水化合物不足時,Lys被氧化代謝為乙酰輔酶A參與三羧酸循環(huán),或作為肉堿合成前體物進入脂肪代謝,為基礎(chǔ)細胞活動提供能量[16]。此外,Lys在維持機體免疫、保護神經(jīng)系統(tǒng)或維持酸堿平衡中發(fā)揮重要功能[17-18]。特別值得注意的是,Lys是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾最活躍的位點之一,發(fā)生在蛋白質(zhì)賴氨酸殘基上的甲基化、乙?；?、泛素化和巴豆酰化等[19]都會影響蛋白質(zhì)3級結(jié)構(gòu)折疊及功能發(fā)揮,從而調(diào)節(jié)細胞功能和生物過程[20]。

2.2 Lys影響奶牛泌乳性能

Lys是以玉米為主要飼糧的反芻動物的第一限制性氨基酸。已有研究表明,飼糧中RUP含量減少25.3%,會使泌乳中期奶牛飼料利用效率降低5.4%,并顯著提高血漿中非必需氨基酸(non-essential amino acid,NEAA)濃度,降低血漿中EAA濃度,導(dǎo)致奶牛泌乳性能明顯下降[2]。補充RPL后,飼糧RUP含量不變,對血漿NEAA濃度無影響,但顯著提高血漿EAA濃度,產(chǎn)奶量和乳成分含量升高,且乳中體細胞數(shù)顯著減少,提示RPL可改善乳腺健康狀況[2]。對泌乳早期奶牛的研究觀察到類似影響,每天每頭牛補充20 g RPL增加了1.1 kg/d的產(chǎn)奶量和50 g/d的乳中真蛋白質(zhì)產(chǎn)量[21]。RPL供應(yīng)減少引起乳產(chǎn)量和乳脂含量顯著降低,可能與催乳素水平下降相關(guān)[22]。雖然已有多項研究表明,RPL對奶牛泌乳功能存在積極影響,但仍有部分文獻報道了陰性結(jié)果。最近的研究表明,以玉米青貯飼料為基礎(chǔ)飼糧配制成Lys缺乏飼糧,再分別補充含充足飼糧代謝蛋白(metabolizable protein,MP)的0.3%或0.6%的RPL,對泌乳中期奶牛的干物質(zhì)攝入量、產(chǎn)奶量及乳成分均無顯著影響[4],這可能和RPL較低的生物利用率有關(guān)。

2.3 Lys影響乳蛋白合成

Lys在乳蛋白的合成中發(fā)揮重要作用。補充Lys改善乳腺健康狀況及機體免疫狀態(tài)的同時,可提供氮源促進蛋白質(zhì)合成[6]。此外,真胃灌注Lys梯度減少的氨基酸混合液,導(dǎo)致奶山羊體內(nèi)催乳素含量線性降低,引起乳蛋白產(chǎn)量降低[22]。有研究表明,飼糧中添加0.24%平衡MP的RPL使得圍產(chǎn)期奶牛產(chǎn)奶量提高了11.4%,乳蛋白產(chǎn)量提高了13.9%[23]。產(chǎn)前補充Lys會提高泌乳早期奶牛乳中真蛋白質(zhì)含量,但不影響奶牛產(chǎn)奶量[24]。圍產(chǎn)期補充RPL能夠促進乳蛋白合成,但對產(chǎn)奶量的影響結(jié)果并不一致,這可能與產(chǎn)奶量隨MP攝入量的增加而提高有關(guān)[25]。與MP供應(yīng)充足飼糧相比,飼喂泌乳中期奶牛每頭每天27.6 g RPL后乳中真蛋白質(zhì)含量約提高3.64%,乳蛋白產(chǎn)量增加40 g/d,提示補充Lys可在不影響奶牛泌乳性能的同時減少飼糧中蛋白質(zhì)的使用量[2]。此外,有研究表明,Lys和蛋氨酸、組氨酸或BCAA聯(lián)合添加對乳蛋白合成的促進效果優(yōu)于Lys單獨添加[6,26]。Lys在乳腺中攝入量高于乳中含量,可能參與BCAA等氨基酸的合成[27],通過改變血漿氨基酸譜以促進乳腺對其他氨基酸的攝取,進而提高乳蛋白合成。

3 Lys影響奶牛乳蛋白合成的分子機制

3.1 通過底物作用影響乳蛋白合成

氨基酸是合成乳蛋白的直接底物。林秀娟[27]總結(jié)了牛乳中主要蛋白質(zhì)的氨基酸組成,發(fā)現(xiàn)每100 g α-酪蛋白和β-酪蛋白中Lys的含量分別為8.9和6.5 g,每100 g α-LA和β-LG中Lys的含量分別為11.5和11.8 g。乳蛋白中豐富的Lys含量提示乳腺對Lys的需求量較高。已有研究表明,提高培養(yǎng)基中Lys的含量顯著促進了β-酪蛋白的合成。大約90%的Lys在奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)中主要參與蛋白質(zhì)合成,其余約10%的Lys用于合成NEAA,如組氨酸、天冬氨酸[28]。Lys作為底物時除參與乳蛋白合成外,還參與氨基酸轉(zhuǎn)運載體表達的調(diào)控。已有研究表明,添加Lys提高了BMEC中轉(zhuǎn)運載體——溶質(zhì)載體家族6成員14(SLC6A14)的表達[29],但抑制了溶質(zhì)載體家族7成員1(SLC7A1)、溶質(zhì)載體家族7成員6(SLC7A6)和溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)的表達[28,30]。此外,補充Lys改變了血漿中氨基酸含量,提高了乳腺對其他氨基酸特別是NEAA的攝取和利用[27]。以上研究表明,Lys不僅可以作為氨基酸轉(zhuǎn)運載體和蛋白質(zhì)合成的底物直接參與乳蛋白合成,還可以通過改變其他氨基酸底物的含量調(diào)節(jié)乳腺合成乳蛋白。

3.2 通過蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)影響乳蛋白合成

乳腺上皮細胞中蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)與蛋白質(zhì)合成、降解的動態(tài)過程相關(guān)。目前認為吞噬/自噬-溶酶體和泛素-蛋白酶體是蛋白質(zhì)降解的主要途徑[31]。已有研究表明,Lys抑制自噬-溶酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解,減少自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達以抑制蛋白質(zhì)分解,促進蛋白質(zhì)沉積[32]。但尚未發(fā)現(xiàn)Lys通過泛素-蛋白酶體調(diào)節(jié)自噬的研究。此外,Lys缺乏時會抑制Janus激酶(Janus kinase,JAK)2-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)3信號通路,引起線粒體膜電位喪失,凋亡基因半胱天冬酶9(Caspase9)和半胱天冬酶3(Caspase3)表達量升高,線粒體凋亡,可能通過減少能量供應(yīng)影響蛋白質(zhì)合成[33]。而高劑量Lys促進凋亡基因B細胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白(Bax)和凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)表達,抑制B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)表達,引起還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亞基mRNA表達提高和ROS產(chǎn)生,誘導(dǎo)細胞凋亡[34],降低蛋白質(zhì)合成。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)是自噬的重要抑制因子和細胞代謝的調(diào)節(jié)因子,其激活引起下游自噬相關(guān)基因表達[35]。研究發(fā)現(xiàn),剝奪培養(yǎng)基中的Lys會抑制蛋白質(zhì)合成,激活mTORC1介導(dǎo)的細胞凋亡和自噬,添加Lys則減弱以上抑制效果[36]。同樣,Lin等[37]觀察到添加Lys能夠顯著提高細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成量,抑制胞內(nèi)總蛋白質(zhì)降解速率。以上結(jié)果提示Lys影響蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),該過程可能由獨立的自噬-溶酶體形成過程或JAK-STAT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路介導(dǎo)的細胞凋亡發(fā)揮作用,但目前仍缺乏在奶牛上的深入研究。

3.3 通過調(diào)節(jié)細胞增殖影響乳蛋白合成

乳腺上皮細胞的活力和增殖對乳蛋白合成具有重要影響,泌乳高峰期細胞分泌活動增加使得乳蛋白產(chǎn)量升高[38]。已有研究報道,Lys促進不同類型哺乳動物細胞的增殖[39-40]。Prizant等[41]發(fā)現(xiàn),剝奪培養(yǎng)基中的全部氨基酸時,隨著Lys含量的增加,細胞活力顯著升高,但在達到一定含量后呈下降趨勢,提示BMEC增殖對Lys存在劑量依賴效應(yīng),且高劑量的Lys對細胞存在毒性作用。Lin等[37]研究表明,1.0 mmol/L Lys處理BMEC 24 h后,顯著提高了細胞活力和蛋白質(zhì)合成量,并提高了β-酪蛋白的表達,但超過該劑量時BMEC蛋白質(zhì)合成速率降低。Cao等[29]研究發(fā)現(xiàn),在0.7 mmol/L Lys濃度時,BMEC的活力和周期蛋白D1(cyclin D1)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表達量均處于最高水平。另外,奶牛隨著泌乳次數(shù)與胎次的增加,乳腺在形態(tài)和功能上發(fā)生退化,并在干奶期完成重構(gòu),Lys是否參與了這一過程的調(diào)節(jié)仍需探究。

3.4 通過改善乳腺健康影響乳蛋白合成

圍產(chǎn)期奶牛因產(chǎn)犢或能量和蛋白質(zhì)負平衡更易產(chǎn)生炎癥反應(yīng),導(dǎo)致血漿中白蛋白、球蛋白等負性急性期蛋白(acute-phase protein,APP)表達量降低,觸珠蛋白等正性APP表達量升高[42]。產(chǎn)前或產(chǎn)后補充Lys能夠降低參與編碼正性APP的血清淀粉樣蛋白A3(serum amyloid protein A3,SAA3)mRNA表達,抑制正性APP表達,促進負性APP表達,提示Lys在減輕奶牛炎癥損傷過程中發(fā)揮了積極作用[5]。圍產(chǎn)期、泌乳中期奶牛乳腺體細胞數(shù)隨Lys添加而降低[4,23],這可能與中性粒細胞、巨噬細胞減少促炎因子分泌相關(guān)[43-44]。另外,中性粒細胞等免疫細胞釋放蛋白質(zhì)水解酶以削弱乳腺緊密連接,促進體細胞進入乳腺腺泡發(fā)揮抗炎作用[45]。體外試驗表明,脂多糖誘導(dǎo)BMEC產(chǎn)生炎癥損傷,下調(diào)β-酪蛋白、α-LA和β-LG蛋白表達[46],且這與白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌相關(guān)[47]。而Lys促進miR-575表達以抑制磷酸酶和張力蛋白磷酸酶同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表達,進而抑制小鼠M2小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[48]。生產(chǎn)中,隨著奶牛泌乳胎次的增加,乳腺炎發(fā)生概率提高,探究Lys對不同泌乳時期奶牛免疫功能的影響可以更精準調(diào)節(jié)奶牛乳腺健康水平,對提高泌乳性能具有重要指導(dǎo)作用。

3.5 通過調(diào)控相關(guān)信號通路影響乳蛋白合成

3.5.1 JAK-STAT信號通路

JAK-STAT信號通路受多種細胞因子和生長因子的調(diào)控,介導(dǎo)下游造血作用、免疫適應(yīng)性、組織修復(fù)、炎癥、細胞凋亡和脂肪生成。研究發(fā)現(xiàn),添加1.0 mmol/L Lys顯著提高JAK2、STAT5 mRNA表達和蛋白磷酸化水平,β-酪蛋白表達升高[37]。研究表明,Lys缺乏導(dǎo)致豬背最長肌細胞凋亡,該過程伴隨著JAK2-STAT3信號通路被抑制,而添加Lys后促進STAT3被酪氨酸激酶磷酸化,磷酸化STAT3二聚體進入細胞核與DNA靶基因啟動子結(jié)合,JAK2-STAT3信號通路的活性恢復(fù)[49]。已有研究表明,添加Lys顯著提高奶牛體內(nèi)胰島素和葡萄糖濃度[2]。盡管尚未在奶牛中得到驗證,但胰島素可誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞中STAT5B酪氨酸磷酸化,促進STAT5B入核發(fā)揮促轉(zhuǎn)錄作用[50],該過程由細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號通路介導(dǎo)[51]。St?cklin等[52]研究表明,催乳素和糖皮質(zhì)激素促進STAT異二聚體形成而激活STAT4依賴性轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果提示,Lys可通過促進激素分泌激活JAK-STAT信號傳導(dǎo)以調(diào)節(jié)乳蛋白合成,但在奶牛泌乳上的深層次機制有待進一步研究。

3.5.2 mTOR信號通路

mTOR是一種進化保守的非典型絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,其通過整合營養(yǎng)、能量及生長因子等多種細胞外信號調(diào)控細胞代謝過程。目前普遍認為mTOR刺激細胞核編碼的線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)的合成,協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)合成過程中的能量消耗和線粒體能量產(chǎn)生[8]。Lys可作為信號調(diào)節(jié)分子激活mTOR調(diào)控蛋白合成。體外試驗表明,單獨添加Lys通過促進mTOR、核糖體S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1)和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1,4EBP1)磷酸化而激活mTOR信號通路。飼喂高Lys飼糧時,觀察到小鼠大腦皮質(zhì)層中mTORC1信號傳導(dǎo)因p70-S6K1磷酸化程度減弱而被抑制[9]。剝奪培養(yǎng)基中的全部氨基酸后添加Lys提高了S6K1磷酸化水平,在0.1 mmol/L時有最大促進作用,但對真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)的磷酸化無顯著影響[41],提示Lys提高了mTOR活性,高濃度Lys可能通過抑制S6K1磷酸化進而抑制mTOR通路。磷酸化S6K1可激活真核翻譯起始因子4B(eukaryotic translation initiation factor 4B,eIF4B)和真核翻譯起始因子3(eukaryotic translation initiation factor 3,eIF3),并導(dǎo)致程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)失活,該基因編碼抑制翻譯起始蛋白,從而促進磷酸化介導(dǎo)的翻譯進行,增加蛋白質(zhì)合成[53]。RagD參與mTORC1溶酶體定位及mTORC1下游底物T淋巴細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)/轉(zhuǎn)錄因子E3(transcription factor E3,TFE3)磷酸化的過程[54],Lys可通過RagD誘導(dǎo)mTOC1磷酸化和細胞增殖,促進β-酪蛋白表達[55]。以上研究提示,Lys可通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路以促進乳蛋白合成,但深入影響機制尚不清楚。

3.5.3 其他信號通路

Lys調(diào)節(jié)乳蛋白合成的信號通路研究主要集中于JAK-STAT和mTOR通路,但也有文獻報道絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路參與其中調(diào)控。MAPK信號通路的激活導(dǎo)致大量細胞因子被釋放。MAPK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可響應(yīng)氨基酸等細胞外刺激,在信號通路傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究表明,Lys提高BMEC中MAPK1蛋白表達和磷酸化水平[56],磷酸化的MAPK1正向調(diào)節(jié)Raptor和STAT5A的磷酸化進而激活mTORC1和JAK-STAT信號通路[57-58],促進β-酪蛋白表達。此外,Lys引起mTOR和MAPK信號通路串?dāng)_,并調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)的表達推進細胞周期進程[24],從而影響乳蛋白合成。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路作為mTOR通路的上游通路,在乳蛋白調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[59]。添加Lys顯著提高PI3K、Akt磷酸化水平,激活mTOR信號通路,并促進乳腺導(dǎo)管發(fā)育[60]。

4 小 結(jié)

Lys是以玉米為基礎(chǔ)飼糧的反芻動物的限制性氨基酸。補充Lys可提高奶牛小腸可利用氨基酸含量,改善血漿氨基酸譜,調(diào)節(jié)乳腺對氨基酸的攝取,進而影響奶牛泌乳性能及乳蛋白合成。在乳腺內(nèi),Lys可通過調(diào)節(jié)氨基酸轉(zhuǎn)運載體表達、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、細胞增殖和乳腺健康影響乳蛋白合成。JAK-STAT和mTOR信號通路是Lys調(diào)控BMEC乳蛋白合成的主要信號通路,此外,MAPK和PI3K-Akt信號通路也參與其中。然而,奶牛乳蛋白合成過程由諸多組織器官協(xié)同完成,未來可進一步探究Lys對不同泌乳時期奶牛各內(nèi)臟組織的影響,并利用細胞共培養(yǎng)技術(shù)深入探究Lys影響乳蛋白合成的分子機制,為其在調(diào)節(jié)奶牛生產(chǎn)性能和機體健康的應(yīng)用開辟新思路。