楊 瑩，王子璇，陳 狄，陳 ?，方亞群，金玉翠，馬長艷*，陳 翔

1南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學系，江蘇 南京 211166；2江蘇大學附屬宜興市人民醫(yī)院甲乳外科，江蘇 宜興 214221

乳腺癌（breast cancer，BCa）是全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤，復發(fā)和轉移是導致乳腺癌患者治療失敗的主要原因［1-2］。盡管近年來乳腺癌的診斷和治療手段已經取得了巨大進步，但乳腺癌的發(fā)病率仍高居不下，其發(fā)病機制尚未完全闡明。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。大量研究表明，lncRNA 在多種腫瘤中異常表達，并通過多種機制參與包括乳腺癌在內的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程［3-5］。例如，lncRNA TTN-AS1 通過調控miR-139-5p/ZEB1軸促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）［6］；lncROPM 通過調控PLA2G16 的mRNA 穩(wěn)定性上調其表達，激活PI3K/AKT、Wnt/β-catenin 和Hippo/YAP信號通路，進而維持乳腺癌干細胞的干性［7］；lncRNA AY343892 通過與BRCA1 結合促進PTEN 的轉錄，進而抑制乳腺癌的進展［8］。然而，lncRNA的數(shù)目眾多、作用機制復雜，其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制有待進一步深入挖掘。

RP11-490M8.1 是本課題組在Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據庫中篩查發(fā)現(xiàn)的在乳腺癌組織中顯著下調的一條lncRNA，目前尚未有關于RP11-490M8.1 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制的報道。本研究檢測RP11-490M8.1 在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達情況，并初步研究其對乳腺癌細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

乳腺癌組織及癌旁組織取自南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科，患者未接受過局部或全身治療且經病理學診斷為乳腺癌。本研究經南京醫(yī)科大學倫理委員會批準［南醫(yī)大倫理（2022）492 號］，標本的獲取征得患者知情同意。

人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231來源于美國ATCC。所有細胞均使用含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 μg/μL 鏈霉素的DMEM（Gibco 公司，美國）培養(yǎng)基，并在含有5%CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR

用TRIzol 試劑（大連寶生物）提取乳腺癌組織、癌旁組織以及乳腺癌細胞的總RNA，將RNA按照試劑商提供的說明書（Reverse Transcription Kit，南京諾唯贊）逆轉錄為cDNA，然后對目的基因進行qRTPCR擴增（SYBR Green Ⅰ，上海翊圣）。所用引物序列 為：β-actin 上游引物5′-AGATGTGATCAGCAAGCAG-3′，下游引物5′-GCGCAAGTTAGGTTTTGTCA-3′；人RP11-490M8.1 上游引物5′-CTCTGCTTTCTGTGCCAAGG-3′，下游引物5′-AAACCCACCACT-TTTGTCCG-3′。

1.2.2 細胞轉染及穩(wěn)轉細胞構建

RP11-490M8.1 表達質粒為本實驗室構建，RP11-490M8.1 ASO 及其對照（廣州銳博），按照Lipofectamine 2000（Thermo Scientific 公司，美國）說明書進行質?；駻SO 轉染。RP11-490M8.1 表達質粒及其對照質粒轉染MDA-MB-231 和MCF-7細胞后，用嘌呤霉素進行穩(wěn)轉細胞的篩選并用qRT-PCR 進行過表達效率的驗證。

1.2.3 CCK8實驗

將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，用Opti-DMEM配制10%CCK8試劑（上海翊圣），在細胞貼壁后的0、24、48、72 和96 h 分別加入0.1 mL CCK8 試劑，放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中避光孵育1～2 h，然后用酶標儀于450 nm 處檢測吸光度值，用GraphPad 軟件進行分析并作圖。

1.2.4 克隆形成實驗

將細胞按100 個/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)14 d左右加入5 mL 4%多聚甲醛，在4 ℃冰箱中固定15 min 后棄去多聚甲醛，使用結晶紫染色10～30 min，將染色液用PBS洗凈后室溫干燥、拍照，然后進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學方法

用GraphPad Prism 5.0 軟件和One-way ANOVA檢驗進行實驗結果分析，所有數(shù)據以均數(shù)±標準差（）。RP11-490M8.1表達水平與臨床病理參數(shù)的關系采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 檢驗，Cox多因素回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RP11-490M8.1在乳腺癌組織中表達下調

通過GEO 數(shù)據庫（GSE29431）分析了人乳腺癌及癌旁組織中差異表達的lncRNA。對這些差異表達的lncRNA進一步篩選發(fā)現(xiàn)，RP11-490M8.1在乳腺癌組織中表達顯著下調（圖1A）。利用Web server for Coding Potential Assessing Tool 預測了RP11-490M8.1的蛋白編碼能力，結果顯示RP11-490M8.1不具有蛋白編碼能力（圖1B）。用qRT-PCR檢測了36對乳腺癌及癌旁組織中RP11-490M8.1的表達水平，結果顯示，RP11-490M8.1在33例乳腺癌患者中表達下調，在3例乳腺癌患者中表達上調（圖1C）。

圖1 RP11-490M8.1在乳腺癌組織中表達下調Figure 1 Expression of RP11-490M8.1 was downregulated in breast cancer

2.2 RP11-490M8.1 表達水平與乳腺癌患者的臨床分期呈負相關，與總生存期正相關

分析RP11-490M8.1 表達水平與乳腺癌患者的臨床分期和預后的關系，結果表明，RP11-490M8.1表達水平與乳腺癌患者的臨床分期呈負相關（表1，圖2A），而與雌激素受體、孕激素受體、年齡和人表皮生長因子受體-2 的表達均無相關性。Kaplan-Meier plotter數(shù)據庫分析顯示，RP11-490M8.1低表達和較差的總生存期（overall survival，OS）相關（P=0.034，圖2B）。以上結果提示，RP11-490M8.1可能是乳腺癌預后不良的生物標志物。

圖2 RP11-490M8.1表達水平與乳腺癌患者的臨床分期（A）與預后的關系（B）Figure 2 Correlation of RP11-490M8.1 expression with the clinical stage（A）and prognosis（B）of breast cancer patients

表1 RP11-490M8.1與乳腺癌患者臨床病理特征相關性的分析Table 1 Correlation of RP11-490M8.1 expression with clinicopathological characteristics of breast cancer patients（n）

2.3 過表達RP11-490M8.1顯著抑制乳腺癌細胞的增殖

為了確定RP11-490M8.1 在乳腺癌細胞中的功能，首先在MCF-7 和MDA-MB-231 乳腺癌細胞中轉染RP11-490M8.1 表達質粒，構建RP11-490M8.1 過表達穩(wěn)轉細胞系（圖3A）。CCK8和細胞平板克隆形成實驗結果表明，過表達RP11-490M8.1顯著抑制了乳腺癌細胞的增殖（圖3B、C）。

圖3 過表達RP11-490M8.1抑制乳腺癌細胞的增殖Figure 3 Overexpression of RP11-490M8.1 suppressed the proliferation of breast cancer cells

2.4 敲低RP11-490M8.1促進乳腺癌細胞的增殖

為了進一步證明RP11-490M8.1 在乳腺癌細胞增殖中的作用，在MDA-MB-231 細胞中轉染ASO-RP11-490M8.1 以敲低RP11-490M8.1 的表達，qRTPCR 實驗結果顯示，MDA-MB-231 細胞中RP11-490M8.1 的表達顯著下降（圖4A）。CCK8 實驗結果表明：敲低RP11-490M8.1表達顯著促進了乳腺癌細胞的增殖（圖4B）。

圖4 敲低RP11-490M8.1表達促進乳腺癌細胞的增殖Figure 4 Knockdown of RP11-490M8.1 promoted the proliferation of breast cancer cells

3 討論

乳腺癌已超過肺癌成為全球最常見的癌癥和第5 大癌癥死亡原因，2020 年新發(fā)病例約230 萬，2070年新發(fā)病例預計將達到440萬［9-10］。因此，深入探討乳腺癌發(fā)病的分子機制，尋找新的干預/治療靶點和診斷、預后生物標志物十分必要。本研究發(fā)現(xiàn)：RP11-490M8.1在乳腺癌組織中表達水平顯著下降，RP11-490M8.1低表達與乳腺癌患者較差的預后相關；在乳腺癌細胞中過表達RP11-490M8.1顯著抑制乳腺癌細胞增殖，敲低RP11-490M8.1表達則顯著促進了乳腺癌細胞的增殖。

近年來lncRNA 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和耐藥等過程中的作用引起了極大關注。越來越多的研究表明，lncRNA是非常有潛力的腫瘤診斷、治療、預后的生物標志物和有效靶點［11-13］。在乳腺癌中，SGMS1-AS1、AC015908.2、LINC01014、AC083967.1、TTC39AAS1 和AL353708.3 這6 個鐵死亡相關的lncRNA 可以較好地預測三陰性乳腺癌患者的預后［14］；lncRNA UCA1高表達預示乳腺癌患者預后不良，靶向UCA1可逆轉乳腺癌細胞對化療和內分泌治療的耐藥性，抑制乳腺癌進展［15］；lncRNA SNHG3 在乳腺癌患者血清中水平升高，核磁共振彌散加權成像（diffusion weighted imaging，DWI）聯(lián)合血清SNHG3水平對乳腺癌有較好的診斷價值［16］。本研究通過GEO數(shù)據庫分析和臨床標本檢測，發(fā)現(xiàn)RP11-490M8.1在乳腺癌組織中表達顯著下調，且RP11-490M8.1低表達與乳腺癌患者較差的預后相關。以上結果提示，RP11-490M8.1可能是乳腺癌患者新的預后生物標志物。

lncRNA 通過多種途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。如lncRNA CASC11 通過調節(jié)miRNA-150 的表達而促進膀胱癌細胞的增殖［17］；HOX 基因簇相關的lncRNA 通過調節(jié)EMT 參與腫瘤轉移過程［18］；lncRNA ZNF561-AS1通過調節(jié)miR-302a-3p/PDGFD軸而參與肝細胞癌細胞的增殖和血管發(fā)生［19］；lncRNA TDRG1通過調節(jié)Sox2 mRNA的穩(wěn)定性而參與肺癌細胞干性的調節(jié)［20］；TUBA1C 是lncRNA RP11-480I12.5 的親本基因，而后者通過上調AKT3和CDK6 而促進乳腺癌的惡性進展［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達RP11-490M8.1顯著抑制了乳腺癌細胞的增殖，而敲低RP11-490M8.1表達則促進了乳腺癌細胞的增殖。以上結果初步提示：RP11-490M8.1在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。RP11-490M8.1抑制乳腺癌細胞增殖的機制以及對乳腺癌細胞其他生物學行為如遷移、侵襲和EMT等的影響有待于后續(xù)實驗進一步深入探討。