劉紫杉，王一鑫，李永明

上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，同濟大學口腔醫(yī)學院，同濟大學附屬口腔醫(yī)院正畸科，上海（200072）

牙槽骨是牙齒的重要支持部分，在正畸牙移動及牙周炎發(fā)展及治療的過程中，涉及到骨穩(wěn)態(tài)的平衡及骨改建。牙槽骨血供豐富，在受到機械應力、炎癥刺激時，由于骨組織內血流中斷，部分區(qū)域組織無法正常供氧及營養(yǎng)物質，常常處于低氧環(huán)境［1］。低氧參與并影響機體正常生理過程，氯化鈷是已經被廣泛應用的低氧模擬物，通過增加缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）的表達水平影響下游的低氧反應元件，從而使細胞達到化學低氧狀態(tài)，可用于體外研究模擬細胞低氧狀態(tài)［2-3］。研究表明，HIF-1α 參與調控低氧環(huán)境下機體的反應，是骨組織在低氧環(huán)境下調節(jié)骨代謝的核心分子［4］。HIF-1α 的激活刺激多個缺氧反應基因的轉錄，可通過多種通路參與調節(jié)骨的形成與恢復［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞表達的促紅細胞生成素肝細胞激酶受體配體B2（erythropoietin producing hepatocyte kinase receptor ligand B2，EphrinB2）和成骨細胞表達的促紅細胞生成素肝細胞激酶受體B4（erythropoietin producing hepatocyte kinase receptor B4，EphB4）通過相互作用產生雙向信號，影響成骨細胞和破骨細胞功能，參與骨穩(wěn)態(tài)的調控［7-8］。在成骨細胞譜系中，EphrinB2 與EphB4均有表達，通過相互作用，可以抑制成骨細胞的凋亡來支持成骨細胞譜系的持續(xù)分化，從而維持促進新的類骨質基質礦化［9］。但在低氧條件下，缺氧對成骨細胞EphrinB2/EphB4 的表達及成骨分化的影響目前尚不清楚。

本研究通過使用氯化鈷（CoCl2）模擬低氧環(huán)境，觀察低氧環(huán)境下MC3T3-E1 細胞HIF-1α、EphrinB2 及EphB4 的表達變化及成骨分化情況，了解低氧是否通過EphrinB2/EphB4 信號通路調控MC3T3-E1 細胞的成骨分化，為低氧環(huán)境下骨代謝機制的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1（上海研生生化試劑有限公司，中國），PBS（Hyclone，美國），胎牛血清（BI，以色列），DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），50 μmol/L抗壞血酸（Sigma，美國），10 mmol/L β-磷酸甘油（Sigma，美國），100 nmol/L 地塞米松（Sigma，美國），1%青-鏈霉素（Hyclone，美國），胰蛋白酶（Gibco，美國），RNA 逆轉錄試劑盒（Takara，日本），TRIZOL 試劑（Thermo Fish，美國），茜素紅工作染液（Solarbio，中國），BCIP/NBT 免疫組織化學顯色試劑盒（上海生工生物公司，中國），氯化鈷（Sigma，美國），EphB4 激酶自身磷酸化抑制劑NVPBHG712（MCE，美國）。

RIPA 裂解液（Thermo Fisher，美國），兔抗鼠多克隆HIF-1α 抗體（1∶1 000，Affinity，美國），兔抗鼠多克隆β-actin 抗體（1∶3 000，Affinity，美國），兔抗鼠多克隆EphB4 抗體（1：1 000，Proteintech，美國），兔抗鼠多克隆runt相關轉錄因子2（runt related transcription factor 2，RUNX2）抗體（1∶1 000，Affinity，美國），兔抗鼠多克隆I 型膠原（collogen-1，COL I）抗體（1：1 000，Affinity，美國），兔抗鼠多克隆堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）抗體（1∶1 000，博士德，中國），鼠單克隆骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體（1∶1 000，博士德，中國），羊抗兔熒光二抗（IR Dye 800CW，Abcam，英國）、羊抗鼠熒光二抗（IR Dye 680RD，Abcam，英國），實時熒光定量PCR 儀（Lightcyler96，Roche，瑞士），Western 激光成像系統(tǒng)（Odyssey clx，LICOR，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)與低氧誘導

在DMEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，1%青-鏈霉素配制完全培養(yǎng)基用于培養(yǎng)MC3T3-E1 細胞，在5%體積分數(shù)CO2、37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)。氯化鈷組培養(yǎng)基中加入125 μmol/L 的氯化鈷，對照組使用正常培養(yǎng)基，氯化鈷+抑制劑組在培養(yǎng)基中加入125 μmol/L 的氯化鈷和50 nmol/L 的NVP-BHG712，NVP-BHG712 是EphB4 激酶自身磷酸化的抑制劑，阻止EphB4 與EphrinB2 的接觸反應。在48 h 后對細胞進行RNA 和蛋白質的提取。在完全培養(yǎng)基中加入50 μmol/L 抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、100 nmol/L 地塞米松，對細胞進行成骨誘導，每48 h更換培養(yǎng)基。

1.3 細胞增殖測定

以2×104個/mL 接種MC3T3-E1 細胞于96 孔板，按照分組處理培養(yǎng)48 h 后，PBS 洗滌，每孔加入CC-K8 溶液10 μL 與90 μL 完全培養(yǎng)基，于37 ℃CO2培養(yǎng)箱孵育2 h 后，酶標儀波長450 nm 檢測吸光度，根據公式：細胞活力=（實驗組的吸光度-空白組的吸光度）/（對照組的吸光度-空白組的吸光度），計算細胞活力。

1.4 qRT-PCR

按分組處理細胞48 h，使用TRIZOL 對各組細胞進行裂解，提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，qRT-PCR 檢測成骨標志物ALP、RUNX2、COL 1、OCN 的變化情況，以及信號分子HIF-1α、EphrinB2、EphB4 的變化。以β-actin 作為內參，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primers sequences

1.5 Western blot

按分組處理MC3T3-E1 細胞48 h 后，棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解細胞，進行蛋白的抽提及定量。取等量總蛋白100 ℃加熱5 min，10%及12.5%SDS-PAGE 電泳分離后，轉至NC 膜，使用5%BSA 封閉1 h，封閉后分別與兔抗鼠多克隆HIF-1α 抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆β-actin 抗體（1∶3 000），兔抗鼠多克隆EphB4抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆Ephrinb2 抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆ALP 抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆RUNX2抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆COL I抗體（1∶1 000），鼠單克隆OCN 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，使用羊抗兔熒光二抗或羊抗鼠熒光二抗孵育，使用Odyssey clx 激光成像系統(tǒng)顯色。

1.6 ALP 染色及定量分析

對3 組細胞成骨誘導7 d，棄培養(yǎng)基，使用PBS清洗細胞3 次，使用4%的多聚甲醛固定液固定，按照BCIP/NBT 免疫組織化學顯色試劑盒說明書配置ALP 染色液，染色5 min 后洗滌，拍照。使用Image J對染色結果進行分析。

1.7 茜素紅染色

不同條件處理下的細胞成骨誘導21 d 后，首先使用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 輕緩沖洗3 次，加入茜素紅工作染液室溫染色5～10 min，吸取染色液，使用PBS 輕柔洗滌，顯微鏡下拍攝，使用Image J 對染色結果進行分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

所有實驗設置3 個重復進行并獨立進行3 次。使用SPSS20.0、GraphPad Prism8.0、Image J 軟件進行分析與繪圖，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 氯化鈷及EphB4 磷酸化抑制劑NVP-BHG712對MC3T3-E1 細胞增殖的影響

分別使用125 μmol/L 的氯化鈷，50 nmol/L 的NVP-BHG712 處理MC3T3-E1 細胞48 h 后，與對照組比較，細胞增殖率無明顯差異（圖1）（P＞0.05），說明在細胞培養(yǎng)基中加入氯化鈷和抑制劑NVPBHG712 不影響細胞的增殖與凋亡。

圖1 氯化鈷及NVP-BHG712 處理MC3T3-E1 48 h 對細胞增殖的影響Figure 1 The effect of CoCl2and NVP-BHG712 treatment on MC3T3-E1 cell proliferation for 48 h

2.2 氯化鈷低氧誘導對MC3T3-E1 成骨分化的影響

兩組MC3T3-E1 細胞培養(yǎng)48 h 后成骨標記物mRNA 的檢測結果顯示：相比對照組，MC3T3-E1 經過125 μmol/L 氯化鈷刺激48 h 后，ALP（t= 3.215，P= 0.032 4）、RUNX2（t= 5.332，P= 0.006）、COL I（t=12.41，P=0.000 2）、OCN（t=6.175，P=0.003 5）等成骨標志物mRNA 表達明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義（圖2a）。兩組細胞成骨誘導7 d 后ALP染色結果如圖2b，Image J 定量分析結果顯示，氯化鈷組細胞成骨分化明顯高于對照組（t= 8.023，P=0.015 2），差異具有統(tǒng)計學意義（圖2c）。

圖2 氯化鈷低氧誘導對MC3T3-E1 細胞成骨分化影響Figure 2 Effects of hypoxia caused by CoCl2on osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells

2.3 低氧誘導使MC3T3-E1 中HIF-1α 表達上調，并上調EphrinB2 及EphB4 的表達

在MC3T3-E1 的培養(yǎng)基中加入氯化鈷可以上調HIF-1α 的表達，實現(xiàn)模擬低氧環(huán)境，其中mRNA上調120 倍（t= 9.406，P= 0.000 7），HIF-1α/β-actin蛋白比值增加1.5 倍（t= 17.49，P＜0.000 1）。通過對氯化鈷誘導48 h 后的細胞進行qRT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)EphrinB2（t= 15.82，P＜0.000 1）和EphB4（t=23.40，P＜0.000 1）表達上調（圖3a）。經Western blot 檢測，EphrinB2/β-actin 蛋白比值（t=16.44，P＜0.000 1）增加，EphB4/β-actin 蛋白比值（t= 14.87，P=0.000 1）也增加，差異具有統(tǒng)計學意義（圖3b、3c）。

圖3 MC3T3-E1 細胞在氯化鈷低氧誘導下HIF-1α，EphrinB2，EphB4 基因及蛋白表達變化Figure 3 Expression of HIF-1α,EphrinB2,and EphB4 in MC3T3-E1 cells under hypoxia caused by CoCl2

2.4 抑制低氧誘導下EphrinB2 與EphB4 的結合可抑制細胞成骨分化及礦化

相比氯化鈷組，添加抑制劑組ALP（t= 5.324，P= 0.006）、RUNX2（t= 13.38，P= 0.000 2）、COLI（t=7.435，P=0.001 7）、OCN（t=2.385，P=0.075 5）成骨標記物mRNA 表達下調，差異具有統(tǒng)計學意義（圖4a）。

三組成骨誘導7 d ALP 染色結果見圖4b，Image J 定量分析結果顯示，使用EphB4 激酶自身磷酸化抑制劑后，細胞的成骨分化明顯減少（t=57.69，P=0.000 3），差異具有統(tǒng)計學意義（圖4c）。成骨誘導21 d 茜素紅染色結果見圖4d，Image J 定量分析結果顯示，使用EphB4 激酶自身磷酸化抑制劑后，細胞的礦化明顯減少（t=14.24，P=0.004 9），差異具有統(tǒng)計學意義（圖4e）。另外，Western blot檢測結果顯示，添加抑制劑組中成骨標志物ALP、OCN、Runx2、COLI 蛋白水平也低于氯化鈷組，差異具有統(tǒng)計學意義（圖4f、4g）。

圖4 抑制EphB4 與EphrinB2 結合對氯化鈷低氧誘導下MC3T3-E1 細胞成骨分化影響Figure 4 Effects of restraining the combination of EphB4 and EphrinB2 under hypoxia caused by CoCl2on osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells

3 討 論

研究低氧環(huán)境下骨代謝的調節(jié)機制，對了解牙槽骨在機械應力、炎癥刺激下維持骨穩(wěn)態(tài)平衡、進行骨改建具有重要意義。目前研究表明低氧對骨代謝起到調節(jié)作用，參與骨穩(wěn)態(tài)的維持［10-12］。作為細胞處于低氧環(huán)境的標志物，HIF-1α 在低氧環(huán)境下被激活，調節(jié)氧誘導基因的表達。以往研究發(fā)現(xiàn)，低氧會誘導血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）轉錄增加，刺激局部血管的形成，輸送營養(yǎng)物質，從而增強骨生成［13-17］；同時低氧環(huán)境可通過HIF-1α-GRP78-Akt 信號通路促進間充質干細胞的存活、增殖，從而抑制骨髓間充質干細胞的凋亡［18］；通過STAT3 信號促進骨髓間充質干細胞的成骨分化，促進成骨［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在氯化鈷誘導細胞低氧環(huán)境下HIF-1α 表達升高，成骨標志物（ALP、RUNX2、COL I、OCN）在mRNA 水平的表達升高，細胞成骨分化能力增強，與以往研究結果一致。但也有研究報道持續(xù)的缺氧會抑制成骨分化［20-21］。本研究結果顯示，48 h 的低氧誘導增強了MC3T3-E1 的成骨分化，提示低氧暴露時間可影響成骨細胞的分化，適宜的低氧暴露可以有效誘導前體細胞成骨分化。

破骨細胞表面的EphrinB2 與成骨細胞表面表達的EphB4 結合產生雙向信號傳遞，其中正向信號通過刺激EphB4 增強Rho 蛋白的活性可誘導成骨分化。在成骨細胞中，特異性抑制EphrinB2 和EphB4 磷酸化可明顯降低成骨細胞分化，表明成骨細胞譜系中EphrinB2/EphB4 相互作用在成骨細胞分化中起到關鍵作用［22］。研究報道，缺氧可上調小鼠皮膚中的Eph 受體和Ephrin 配體的表達［23］，也有研究顯示缺氧可上調血管內皮細胞中EphrinB2表達［24］。然而有關成骨細胞分化過程中缺氧和EphrinB2/EphB4 之間的關系目前尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，氯化鈷處理MC3T3-E1 細胞后，HIF-1α mRNA 和蛋白表達升高，缺氧誘導成功；MC3T3-E1細胞EphrinB2、EphB4 mRNA 和蛋白的表達上調，表明低氧可以促進MC3T3-E1 細胞表達EphrinB2和EphB4。通過對低氧誘導的MC3T3-E1 細胞使用EphB4 磷酸化抑制劑NVP-BHG712，阻止EphrinB2與EphB4 結合產生信號后，MC3T3-E1 的成骨標志物表達明顯下降，對細胞進行成骨誘導，ALP 染色及茜素紅染色結果進一步表明細胞的成骨分化及礦化能力下降。實驗初步證明低氧可以通過上調EphrinB2、EphB4 在MC3T3-E1 細胞表面的表達，調節(jié)其成骨分化能力。

低氧環(huán)境中，HIF-1α 被激活，成為90～100 個基因轉錄的缺氧反應元件，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是其中重要基因之一［7］，EPO 可通過與間充質干細胞和造血干細胞的直接相互作用來刺激成骨細胞分化，促進成骨［25-26］。EPO 可通過促進骨髓間充質干細胞表面EphB4 過表達，與EphrinB2 結合，驅動成骨細胞分化［27-28］。因此，推測低氧可能通過HIF-1α-EPO- EphrinB2/EphB4 對MC3T3-E1 細胞的成骨分化做出調控。具體機制需進一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在氯化鈷誘導的體外細胞低氧環(huán)境，MC3T3-E1 的成骨分化增加，同時，細胞低氧環(huán)境上調了HIF-1α、EphrinB2、EphB4 的表達，而阻止EphrinB2 和EphB4 的結合后，細胞的成骨分化下降，表明缺氧和EphrinB2/EphB4 之間的信號轉導在促進前體細胞成骨分化過程中具有重要作用。EphrinB2/EphB4 可在低氧環(huán)境下促進MC3T3-E1 細胞的成骨分化，增加成骨標志物的表達及基質礦化，為低氧調控骨代謝機制的研究提供了新的參考依據。

【Author contributions】Liu ZS peformed the experiments, analyzed the data, and wrote the article.Wang YX revised the article.Li YM designed the study and guided the writing of the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.