蒯振彧，朱正飛，曾宣，陳泓蓉

作者單位：馬鞍山職業(yè)技術學院藥學教研室，安徽 馬鞍山243031

丹參是唇形科鼠尾草屬植物，又名赤參，紫丹參，紅根等，為常見中藥，有“一味丹參，功同四物”之說，歷代本草皆有收載，味苦，性微寒，歸心、肝經。具有活血調經，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養(yǎng)血安神等功效［1］?，F(xiàn)代藥學研究表明丹參中主要含有丹參酮類［2］、丹酚酸類［3］、揮發(fā)油［4］等化學成分，具有保護心血管、抗心律失常、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用［5］。近年來體外藥理實驗發(fā)現(xiàn)丹參中黃酮類化合物如丹參酮Ⅰ、ⅡA、Ⅵ、隱丹參酮、異隱丹參酮等抗腫瘤活性［6-7］，其中丹參酮ⅡA 的作用機制研究的較為深入，具有誘導腫瘤細胞凋亡［8］，抑制腫瘤細胞遷移［9］，抑制腫瘤細胞增殖［10］等作用。研究表明，丹參類制劑臨床上聯(lián)合放化療治療，在增加抗腫瘤療效的同時能夠減輕放化療產生的毒副反應，改善病人生活質量，延長生存期［10-13］。

目前對于丹參黃酮類的化合物主要集中在提取分離和單體分子的體外活性實驗，抗腫瘤作用機制的研究不夠系統(tǒng)。分子對接通過模擬候選藥物與靶點蛋白的結合，分析作用機制，預測結合模式，促進了藥物設計和新藥研發(fā)的效率［14-16］。本研究于2021 年12 月至2022 年3 月利用對接模擬預測活性分子與靶點蛋白結合能力，Lipinski五法則及一系列ADMET（吸收，分布，代謝，排泄，毒性）特性對化合物進行類藥性分析，為天然藥物丹參中活性成分的篩選以及抗腫瘤藥物的研發(fā)提供參考及線索。

1 資料與方法

1.1 資料來源中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，網址：http：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php）和TCM@TAIWAN（網址：http：∕∕tcm.cmu.edu.tw∕）數(shù)據庫；有機小分子生物活性數(shù)據庫（PubChem，網址：https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；蛋白質數(shù)據庫（PDB，Protein Date Bank，網 址：https：∕∕www1.rcsb.org）；Sybyl-X 2.1 軟件；Molegro Virtual Docker（MVD）軟件；Discovery Studio 2019 Client軟件。

1.2 方法

1.2.1小分子配體準備 在TCMSP 和TCM@TAIWAN數(shù)據庫中搜索關鍵詞“丹參”，選擇丹參黃酮類分子，從PubChem 數(shù)據庫下載相應sdf 格式的化合物，并采用Chem 3D 軟件中Calculations 程序對所有分子進行Minimize Energy 力場優(yōu)化后完成mol2 格式轉換，建立此次分子對接的小分子化合物庫，配體信息見表1。

表1 丹參黃酮類對接的配體分子信息

1.2.2受體蛋白優(yōu)化處理 根據文獻［15，22-24］，選擇了20個腫瘤相關的靶點蛋白作為受體，從PDB數(shù)據庫中下載相應蛋白結構，以pdb結構保存，蛋白信息見表2，利用Sybyl-X 2.1軟件Application模塊中Docking suite 對靶蛋白進行去水，加氫等蛋白結構優(yōu)化處理，根據靶點蛋白自身配體生成對接空腔位點口袋。

表2 與丹參黃酮類分子對接受體蛋白信息

1.2.3分子對接 利用Sybyl-X2.1 軟件Surflex-dock模塊，以23 個丹參黃酮類化合物分子為配體，20 個抗腫瘤靶點蛋白為受體進行分子對接，以打分函數(shù)Total Score 為評價標準小分子配體與靶點蛋白的相互結合作用，Total Score 分數(shù)高低反應了配體與受體的結合能力大小，該函數(shù)計算綜合考慮了極性作用、疏水作用、焓和熔劑化等因素，該數(shù)值越大，表明小分子配體與大分子靶點蛋白的匹配結合活性較好，親和力較大。

1.2.4類藥性篩選 根據Lipinski五法則，使用Discovery Studio 2019 Client 的Filter by Lipinski 模塊進行類藥性預篩選評估，預測氫鍵受體和供體的數(shù)量、油水分配系數(shù)（LogP）、分子量（MV）和極性表面積等屬性。

1.2.5基于計算機模擬的藥動學和毒性研究 將篩選出的與靶點蛋白結合力強的化合物進行ADMET預測，采用Discovery Studio 2019 Client 軟件中small molecules 模塊中ADMET descriptors 進行參數(shù)設置，對化合物的吸收、分布、代謝、排泄和毒性進行預測。

1.2.6對接分析與圖像處理 采用Discovery Studio 2019 Client 軟件中Receptor-Ligand Interactions模塊對Total Score＞7［17］的分子對接的結果進行分析，并制作對接圖。

2 結果

2.1 分子對接結果將19 個丹參中黃酮類小分子配體與20 個腫瘤靶蛋白進行結合評估，打分函數(shù)Total Score 顯示數(shù)值提示，紅根草鄰醌與腫瘤壞死因子-α（TNF-α），硫草酮與Polo樣激酶1（PLK-1），鼠尾酮與胰島素樣生長因1 受體（IGF1R），二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2（ARL2），異丹參酮Ⅱ與酪氨酸和蘇氨酸蛋白激酶（TTK）結合最好，新隱丹參酮與表皮生長因子受體（EGFR）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4），丹參酮ⅡA 與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），丹參酮Ⅵ與血小板源生長因子受體（PDGFR）的Total Score＞7，說明結合作用較強。丹參中黃酮類小分子配體與靶蛋白對接結果，具體函數(shù)得分情況見表3。

本研究評價了8個具有高結合能力黃酮類化合物的類藥性，見表4，鼠尾酮、二氫丹參酮Ⅰ、異丹參酮Ⅱ、新隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅵ表現(xiàn)出合理的理化性質：LogP≤5，MV＜500 g∕mol，氫鍵受體數(shù)≤10，氫鍵供體數(shù)≤5和PSA≤140?。

表4 對篩選的化合物進行Lipinski五規(guī)則預測

2.2 ADMET 分子動力學預測結果篩選出的8個丹參黃酮類化合物進行ADMET 預測結果見表5。根據水溶性預測標準，非常低：-8.00＜log（SW）＜-6.00；低：-6.00＜log（SW）＜-4.00；好：-4.00＜log（SW）＜-2.00；二氫丹參酮Ⅱ、新隱丹參酮和丹參酮Ⅵ水溶性評價處在-4.00＜log（SW）＜-2.00的區(qū)間里，水溶性較好；分子透過血腦屏障難易程度等級標準，極高：0；高：1；中等：2；低：3；不確定：4。二氫丹參酮Ⅱ、異丹參酮Ⅱ和丹參酮Ⅵ血腦屏障透過能力強，優(yōu)于其他化合物；根據細胞色素P450 的主要亞型CYP2D6對化合物代謝行為進行評估，篩選出的化合物對細胞色素P450 2D6都無抑制作用；篩選出的化合物都與血漿蛋白有較高的結合率；根據總清除率（log mL·min-1·kg-1）來判斷藥物排泄的能力?？偳宄首罡叩氖嵌涞⑼狪，其次是丹參酮Ⅵ和新隱丹參酮；篩選出的化合物二氫丹參酮Ⅰ、異丹參酮Ⅱ、新隱丹參酮和丹參酮Ⅵ不具有肝毒性。綜上所述，化合物二氫丹參酮Ⅰ具有最佳藥物樣特性。

表5 8個黃酮類化合物的ADMET預測

2.3 篩選化合物的親和力分析為了驗證篩選出的化合物二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2受體的結合情況，使用基于SPR技術的Biacore T200生物分子互作分析系統(tǒng)，將二氫丹參酮Ⅰ稀釋到32 μmol∕L，通過響應值觀察小分子與蛋白的結合強度，發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2 受體的響應值高，結合具有較高的特異性，見圖1。

圖1 在Biacore系統(tǒng)中二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2受體蛋白結合響應情況 圖2 二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2受體分子對接效果圖：2A為二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2作用的三維模式圖；2B為氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2作用的二維圖

2.4 對接結果分析二氫丹參酮Ⅰ相較于其余丹參黃酮類化合物，與ADP-核糖基化因子樣2 受體結合函數(shù)打分最高，Total Score 為8.140 2，分子對接得分為-85.040 8，為了明確二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2 受體的相互作用情況，采用分子對接技術分析其結合位點，結果顯示，二氫丹參酮Ⅰ落入蛋白活性口袋中，且二氫丹參酮Ⅰ與氨基酸殘基精氨酸61（ARG61）形成氫鍵，與谷氨酰胺78（GLN78）形成C-H 鍵，與異亮氨酸29（ILE29）、蛋氨酸（MET20）等形成疏水鍵，見圖2。

3 討論

本研究將丹參中的19 個黃酮類小分子化合物與20個已知腫瘤靶點蛋白通過對接評估，將篩選出的化合物進行類藥性、生物利用度和ADMET 預測，確定最佳藥物相似成分。其中二氫丹參酮Ⅰ具有最佳藥物樣特性。目前多數(shù)的丹參中黃酮類化合物的藥理研究多集中在隱丹參酮和丹參酮ⅡA，隱丹參酮能夠選擇性的抑制血管內皮生長因子的活性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［24］，丹參酮ⅡA 可通過下調COX-2的表達抑制大腸癌和直腸癌的血管生成［25］，本研究結果提示丹參酮ⅡA 與COX-2 的Total Score 優(yōu)于其余黃酮類化合物，初步驗證了計算機篩選的準確性。

此外，通過體外Biacore 系統(tǒng)檢測，二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2 受體具有較高的結合力。模擬對接分析結合受力方式，發(fā)現(xiàn)結構中的醚鍵和酮基基團可與靶點蛋白中的多個氨基酸以氫鍵及疏水鍵等作用力相結合。

綜上所述，虛擬篩選和分子對接有助于提高藥物篩選效率，本研究為丹參中黃酮類化合物二氫丹參酮Ⅰ抗腫瘤作用提供了理論基礎，為后續(xù)靶向ADP-核糖基化因子樣2 受體的小分子抑制劑的研發(fā)提供了良好的先導化合物。