謝麗君

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，昆明 653002

甲狀腺癌是全球常見的惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是主要的甲狀腺癌類型，治愈率超過90%；相反，濾泡狀甲狀腺癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移且復(fù)發(fā)率高，甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）、甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）是最具侵襲性的內(nèi)分泌惡性腫瘤，ATC 和MTC 對(duì)放射性碘消融和傳統(tǒng)化療無效。因此，識(shí)別PTC、ATC、MTC 和FTC 間主調(diào)節(jié)因子的差異和共同調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)可能對(duì)甲狀腺癌的治療有重要意義。

近年來，多項(xiàng)研究闡明了不同病理類型甲狀腺癌的遺傳復(fù)雜性。Yoo 等[1]比較了12 例晚期分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）和13 例ATC 患者的mRNA 表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，異常的甘油脂類代謝、脂肪酸代謝、CDKN2A基因表達(dá)與甲狀腺癌的侵襲性明顯相關(guān)。Nicolson 等[2]對(duì)17例FTC 和4 例正常甲狀腺組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 1，HDAC1）是一種能在腫瘤侵襲前發(fā)揮增強(qiáng)表達(dá)作用的組蛋白修飾物。盡管既往已取得了重要進(jìn)展，但PTC、ATC、MTC 和FTC 間的共同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和特異性調(diào)控因子仍然未知。

本研究從GSE27155、GSE29265 和GSE53157共3 個(gè)數(shù)據(jù)集的組織樣本中篩選基因表達(dá)譜，共包括9 例ATC、43 例PTC、2 例MTC 和4 例FTC 患者的數(shù)據(jù)，通過PTC 分別與FTC、ATC 和MTC 比較的交集來確定差異表達(dá)基因（differential expressed gene，DEG）；此外，采用基因富集分析注釋4 種不同病理類型甲狀腺癌共同特異基因的生物學(xué)功能和信號(hào)通路；構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以確定甲狀腺癌的共同主調(diào)控因子，并分析其與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 DEG 篩選

通過基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）進(jìn)行DEG 篩選，在GEO 數(shù)據(jù)庫中以“thyroid cancer”“Homo sapiens”“tissue”為關(guān)鍵詞搜索基因序列，排除微小RNA、線粒體DNA、非體內(nèi)甲狀腺癌組織取材標(biāo)本等相關(guān)數(shù)據(jù)，最終選取GSE27155、GSE29265 和GSE53157 共3 個(gè)數(shù)據(jù)集，其中GSE27155 的數(shù)據(jù)來自26 例PTC 和2 例MTC 患者，GSE29265 的數(shù)據(jù)來自10 例PTC 和9 例ATC 患者，GSE53157 的數(shù)據(jù)來自7 例PTC 和4 例FTC 患者。利用基因芯片差異分析軟件GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分析各個(gè)數(shù)據(jù)集，選取P＜0.05、|logFC|＞1 的基因?yàn)楹蜻x差異基因，最終將3 個(gè)數(shù)據(jù)集中選取的差異基因取交集，篩選出DEG。利用微生信在線分析軟件（http://www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)篩選出的DEG 進(jìn)一步分析以篩選出共同表達(dá)的差異基因。

1.2 基因本體（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

利用2021 更新版生物學(xué)信息注釋及可視化數(shù)據(jù)庫（the database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）中在線分析工具以人源基因?yàn)楸尘斑M(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析，設(shè)定P＜0.05。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用String 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并采用Cytoscape 3.7.2 進(jìn)行可視化分析，通過CytoHubba 插件對(duì)構(gòu)建的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析。通過分析網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)關(guān)聯(lián)積分值，獲得整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能形成的蛋白簇和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白，并在Cytoscape 中進(jìn)行可視化。關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)篩選標(biāo)準(zhǔn)為最大團(tuán)中心性（maximal clique centrality，MCC）算法，同時(shí)采用Mcode 插件進(jìn)行蛋白簇和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白分析，隨后采用ClueGO 插件（http://apps.cytoscape.org/apps/cluego）對(duì)CytoHubba 生成的模塊進(jìn)行通路相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.4 轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

通過Cytoscape 3.7.2 軟件中的iRegulon 插件對(duì)1.3 中獲得的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測。預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，參數(shù)被設(shè)置為默認(rèn)值，此外，選擇標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment score，NES）＞5.0 的轉(zhuǎn)錄因子作為重要因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 不同病理類型甲狀腺癌共同轉(zhuǎn)錄因子的Kaplan-Meier 分析

為評(píng)估1.4 中獲得的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)甲狀腺癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值，使用Kaplan-Meier plotte 計(jì)算表達(dá)值的最佳臨界值[3]，將來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov/）的353 例甲狀腺癌組織分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析（www.kmplot.com），組間比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。對(duì)于Kaplan-Meier 曲線，P值和95%CI 的風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）通過Log-rank 檢驗(yàn)和多因素Cox 回歸分析得出，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中不同組間HR 代表高表達(dá)組相對(duì)于低表達(dá)組的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，若HR＞1 代表該基因?yàn)槲ｋU(xiǎn)因素，若HR＜1 則代表該基因?yàn)楸Ｗo(hù)因素。

2 結(jié)果

2.1 不同病理類型甲狀腺癌DEG 的篩選

通過對(duì)GSE27155、GSE29265 和GSE53157 共3個(gè)數(shù)據(jù)集中PTC 與MTC、PTC 與ATC、PTC 與FTC比較分析，分別確定了2394、1104 和2805 個(gè)獨(dú)立的DEG，共同交集篩選獲得191 個(gè)共同表達(dá)的DEG，其中上調(diào)基因143 個(gè)，下調(diào)基因48 個(gè)。（圖1）

圖1 不同病理類型甲狀腺癌的DEG篩選圖

2.2 GO 功能注釋分析

選取2.1 中所篩選出的共同表達(dá)的DEG，利用DAVID 在線分析工具共得出96 項(xiàng)重要富集的基因功能，其中生物進(jìn)程主要富集于細(xì)胞形態(tài)調(diào)控、細(xì)胞黏附的負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞連接組件的正向調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分主要富集于細(xì)胞前緣、絲狀膜、外側(cè)質(zhì)膜等；分子功能主要富集于其他取代磷酸基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、Poly（A）結(jié)合、細(xì)胞間黏附介質(zhì)活性等。（圖2）

圖2 191個(gè)共同表達(dá)的DEG的GO功能注釋分析

2.3 KEGG 通路富集分析

選取2.1 中所篩選出的共同表達(dá)的DEG，利用DAVID 在線分析工具共得出重要富集的5 條KEGG 通路，主要包括堿基切除修復(fù)、膦酸鹽和次膦酸鹽代謝、致病性大腸桿菌感染、腫瘤中的蛋白聚糖、細(xì)胞黏附分子通路。涉及的主要基因包括多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶4[poly（ADP-ribose）polymerase 4，PARP4]、8-氧鳥嘌呤DNA 糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1）、DNA 聚合酶δ2 輔助亞基（DNA polymerase delta 2,accessory subunit，POLD2）、膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶1（choline phosphotransferase 1，CHPT1）、膽堿/乙醇胺磷酸轉(zhuǎn)移酶1 （choline/ethanolamine phosphotransferase 1，CEPT1）、連接蛋白（claudin，CLDN）3、肌球蛋白Ⅹ（myosin Ⅹ，MYO10）、FAS、肌球蛋白重鏈10（myosin heavy chain 10，MYH10）、CLDN1、促分裂原活化的蛋白激酶12（mitogen-activated protein kinase 12，MAPK12）、erb-b2 受體酪氨酸激酶3（erb-b2 receptor tyrosine kinase 3，ERBB3）、多配體蛋白聚糖4（syndecan 4，SDC4）、整合素β3（integrin subunit beta 3，ITGB3）、MET、鈣黏蛋白3（cadherin 3，CDH3）和蛋白酪氨酸磷酸酶受體M（protein tyrosine phosphatase receptor type M，PTPRM）。（圖3）

圖3 191個(gè)共同表達(dá)的DEG的KEGG通路富集分析

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化分析

基于前述的DEG 富集通路的蛋白構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)蛋白-蛋白相互作用進(jìn)行可視化分析，結(jié)果顯示，甲狀腺癌共同表達(dá)的DEG 形成的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中含有24個(gè)下調(diào)基因及97個(gè)上調(diào)基因，并共同富集于重要的蛋白-蛋白相互作用通路上。

CytoHubba 插件的MCC 分析顯示有24 個(gè)節(jié)點(diǎn)、26 條邊，主要富集在蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性、鳥苷酸交換因子活性的負(fù)調(diào)節(jié)、磷脂酸磷酸酶活性的調(diào)節(jié)、富含脯氨酸區(qū)域結(jié)合、核纖層蛋白結(jié)合、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞單位結(jié)合、SUMO 接合酶活性、細(xì)胞骨架-核膜錨定活性，關(guān)鍵基因包括凝溶膠蛋白（gelsolin，GSN）、RAS p21 蛋白激活因子（RAS p21 protein activator 1，RASA1）、真核生物翻譯起始因子2α亞單位（eukaryotic translation initiation factor 2 subunit alpha，EIF2S1）、UBX 結(jié)構(gòu)域蛋白7（UBX domain protein 7，UBXN7）、ITGB3、Yes 相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1（Yes1 associated transcriptional regulator 1，YAP1）、脂蛋白1（lipin 1，LPIN1）、核膜含血影蛋白重復(fù)蛋白2（spectrin repeat containing nuclear envelope protein 2，SYNE2）、泛素結(jié)合酶E2C 結(jié)合蛋白E2I（ubiquitin conjugating enzyme E2I，UBE2I）、肌營養(yǎng)不良蛋白（dystrophin，DMD）。（圖4A）

Mcode 模塊1 分析包括6 個(gè)節(jié)點(diǎn)、6 條邊，主要富集在單酚單加氧酶活性的調(diào)節(jié)和非別肽酶活性的正調(diào)節(jié)信號(hào)通路，關(guān)鍵基因包括腫瘤關(guān)聯(lián)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2（tumor associated calcium signal transducer 2，TACSTD2）、CLDN3、CLDN1、CDH3。（圖4B）

Mcode 模塊2 分析包括27 個(gè)節(jié)點(diǎn)、53 條邊，主要富集于二酰甘油膽堿轉(zhuǎn)移酶活性、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移酶活性、富含G 鏈的端粒DNA 結(jié)合、錯(cuò)配修復(fù)、細(xì)胞骨架-核膜錨定活性、磷脂酰磷酸酶活性調(diào)節(jié)通路，關(guān)鍵基因包括磷脂酸胞苷酸轉(zhuǎn)移酶1（CDP-diacylglycerol synthase 1，CDS1）、CEPT1、LPIN1、CHPT1、SYNE2、端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2（telomeric repeat binding factor 2，TERF2）、端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2 結(jié)合蛋白（TERF2 interacting protein，TERF2IP）、POLD2。（圖4C）

Mcode 模塊3 分析包括9 個(gè)節(jié)點(diǎn)、10 條邊，主要富集于磷脂酰肌醇-5-磷酸結(jié)合、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性通路，關(guān)鍵基因包括磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶催化亞單位2α（phosphatidylinositol-4-phosphate 3- kinase catalytic subunit type 2 alpha，PIK3C2A）、分揀微管連接蛋白5（sorting nexin 5，SNX5）、腫瘤蛋白D52 樣蛋白1（tumor protein D52 like 1，TPD52L1）。（圖4D）

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的模塊分析和基因功能注釋圖

2.5 主要轉(zhuǎn)錄因子和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

使用iRegulon 插件對(duì)結(jié)果2.4 中的25 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，結(jié)果顯示，有14 個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子高度富集于蛋白網(wǎng)絡(luò)中，包括EBF 轉(zhuǎn)錄因子1（EBF transcription factor 1，EBF1）、髓樣鋅指蛋白1（myeloid zinc finger 1，MZF1）、E2F 轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）6、核因子κB 亞基（nuclear factor kappa B subunit，NFKB）1、NFKB2、RELA、churchill結(jié)構(gòu)域蛋白1（churchill domain containing 1，CHURC1）、銜接因子相關(guān)蛋白復(fù)合體3β1（adaptor related protein complex 3 subunit beta 1，AP3B1）、含鋅指和BTB 結(jié)構(gòu)域7A（zinc finger and BTB domain containing 7A，ZBTB7A）、Ikaros 家族鋅指蛋白2（IKAROS family zinc finger 2，IKZF2）、上游轉(zhuǎn)錄因子2 與c-fos 相互作用（upstream transcription factor 2,c-fos interacting，USF2）、STAT1、ovo 樣鋅指蛋白2（ovo like zinc finger 2，OVOL2），NES=5.119。對(duì)應(yīng)重要的靶基因包括細(xì)胞分裂周期14A（cell division cycle 14A，CDC14A）、Rho GTP 酶活化蛋白44（Rho GTPase activating protein 44，ARHGAP44）、倒置形成素蛋白2（inverted formin 2，INF2）、磷酸酶和肌動(dòng)蛋白調(diào)控因子2（phosphatase and actin regulator 2，PHACTR2）、碳水化合物磺基轉(zhuǎn) 移 酶 15（carbohydrate sulfotransferase 15，CHST15）、CD47、UBE2I。

2.6 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

評(píng)估2.5 中共同轉(zhuǎn)錄因子與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，以掌握甲狀腺癌的重要調(diào)節(jié)因子，使用Kaplan-Meier plotter 法計(jì)算上述基因高表達(dá)組與低表達(dá)組甲狀腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存率（relapse-free survival，RFS），結(jié)果顯示，E2F1（HR=6.51，P=0.003）、NKFB1（HR=4.13，P=0.000）和NFKB2（HR=2.35，P=0.029）均是甲狀腺癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，IKZF2（HR=0.27，P=0.023）和MZF1（HR=0.31，P=0.002）均是甲狀腺癌患者預(yù)后的保護(hù)因素。（圖5）

圖5 不同轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況甲狀腺癌患者的RFS曲線

3 討論

不管是預(yù)后良好的PTC，還是預(yù)后極差的ATC和MTC，以及易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的FTC，診療的相關(guān)問題已引起臨床醫(yī)師和研究者的高度關(guān)注。既往學(xué)者一直利用不同的技術(shù)關(guān)注不同病理類型甲狀腺癌的基因組或轉(zhuǎn)錄組改變[4]。但由于ATC 和MTC 的罕見性和異質(zhì)性常導(dǎo)致不同研究結(jié)果出現(xiàn)誤差。本文從3 個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集中生成了一個(gè)大數(shù)據(jù)集以探索PTC、FTC、ATC 及MTC 間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的差異和共同存在的重要轉(zhuǎn)錄因子。

對(duì)FTC、ATC 及MTC 特定DEG 的識(shí)別可全面了解腫瘤的侵襲性。本研究通過比較發(fā)現(xiàn)，與PTC組織相比，F(xiàn)TC、ATC、MTC 組織中均存在獨(dú)特表達(dá)的基因?；蚣患治霭l(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期、細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞增殖、免疫信號(hào)失調(diào)與不同病理類型甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。重要模塊分析和基因功能注釋分析也表明關(guān)鍵模塊也與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖有關(guān)。

有研究指出，細(xì)胞周期基因在甲狀腺癌中被高度激活[5-6]，本研究提供了重要模塊轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測，確定EBF1、MZF1、E2F1、STAT6、NFKB1、NFKB2、RELA、CHURC1、AP3B1、ZBTB7A、IKZF2、USF2、STAT1、OVOL2基因均是細(xì)胞周期和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)模塊的潛在主調(diào)控因子。研究顯示，E2F1對(duì)控制G1/S 期基因表達(dá)至關(guān)重要[7-8]。本研究分析結(jié)果顯示，E2F1是甲狀腺癌中重要的特異因子，與Yang 等[9]的研究結(jié)果相似。此外，本研究證實(shí)了E2F1的潛在轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)可能是腫瘤細(xì)胞周期失調(diào)的機(jī)制。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子NFKB可協(xié)同E2F靶基因的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[10]，NFKB的異常表達(dá)與多種腫瘤有關(guān)，其中就包括甲狀腺癌[11-12]。IKZF2是造血特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞發(fā)育，可控制細(xì)胞的自我更新和分化等功能[13]，也具有腫瘤抑制因子的特性[14]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，IKZF2是甲狀腺癌的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，但I(xiàn)KZF2如何在不同的細(xì)胞類型中發(fā)揮不同的作用尚不清楚。多數(shù)腫瘤患者死亡是由于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他器官，而侵襲是轉(zhuǎn)移形成的先決條件，有研究指出，MZF1是致癌因子，是驅(qū)動(dòng)病變惡性轉(zhuǎn)化的重要節(jié)點(diǎn)[15]。本研究結(jié)果顯示，MZF1是甲狀腺癌患者預(yù)后的保護(hù)因素，表明其能調(diào)控腫瘤中特定靶基因的激活，但對(duì)于MZF1與甲狀腺癌全基因組相關(guān)性的研究仍待進(jìn)一步深入研究。本研究篩選出的GSN、RASA1和EIF2S1等25 個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)具有潛在的促進(jìn)甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的作用。由此可見，E2F1、NKFB1、NFKB2、IKZF2、MZF1主調(diào)控因子及其潛在靶點(diǎn)所形成復(fù)雜的細(xì)胞周期基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能是治療效果差或易復(fù)發(fā)甲狀腺癌快速進(jìn)展的原因。

綜上所述，本研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究揭示了不同病理類型甲狀腺癌共同的惡性特征及相關(guān)性，E2F1、NKFB1、NFKB2、IKZF2、MZF1被認(rèn)為是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中共同表達(dá)的DEG 的主要調(diào)控因子，這為甲狀腺癌的惡性機(jī)制提供新的見解。但本研究仍存在不足之處，未來仍需考慮一些因素如本文中的3個(gè)數(shù)據(jù)集中的樣本不對(duì)稱性及惡性程度高的甲狀腺癌樣品量少所帶來的潛在影響。盡管存在局限性，但這些發(fā)現(xiàn)仍可支持與甲狀腺癌相關(guān)的主要調(diào)控因子和網(wǎng)絡(luò)在未來研究中的特殊價(jià)值。