楊曉東 李全樂 潘清清 周 靜 謝陽(yáng)敏 鄒繼華 沈 敏 張 曼

（1.美康生物科技股份有限公司參考實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315104；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100038）

免疫抑制劑是預(yù)防實(shí)體器官移植術(shù)后移植的器官或組織發(fā)生排斥反應(yīng)的主要藥物。環(huán)孢素A、他克莫司、西羅莫司、依維莫司是臨床實(shí)體器官移植術(shù)后最常用的免疫抑制劑[1]。這4種藥物的藥代動(dòng)力學(xué)存在較大的個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間差異，治療窗口窄，因此需進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM），以實(shí)現(xiàn)安全、有效、合理用藥[2]。免疫抑制劑TDM常用的方法包括免疫法、液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[3]。但免疫法交叉干擾大，準(zhǔn)確度不高；液相色譜法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，穩(wěn)定性較差[4]；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已被廣泛用于免疫抑制劑的TDM。由于不同方法的檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異，為了提高TDM常規(guī)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度，也為了幫助體外診斷（in vitrodiagnosis，IVD）行業(yè)滿足國(guó)家監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求的溯源性，建立參考測(cè)量方法迫在眉睫[5-6]。目前，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會(huì)（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）公布的免疫抑制劑參考方法基于同位素稀釋質(zhì)譜法原理，由TAIBON等[7]建立，采用固相萃取法對(duì)全血樣本進(jìn)行前處理，可同時(shí)檢測(cè)全血中4種免疫抑制劑，但該方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，選用固相萃取法進(jìn)行樣本前處理，操作過程復(fù)雜，不可控因素較多。鑒于此，本研究擬采用蛋白沉淀法（protein precipitation，PPT）進(jìn)行全血樣本前處理，建立一種基于同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（isotope-dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）的簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的全血樣本4種免疫抑制劑測(cè)定候選參考方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU LC-30A液相色譜儀+AB SCIEX QTRAP 5500串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)SCIEX公司），accucore PFP 色譜柱（3.0 mm×50.0 mm，2.6 μm，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Heidolph Multi Reax漩渦混合器（德國(guó)Heidolph公司），ST 8R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。Eppendorf移液器（德國(guó)Eppendorf AG公司），Hamilton氣密性微量進(jìn)樣針（瑞士Hamilton公司），容量瓶（日本ASone公司）。Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國(guó)Millipore公司）。

有證參考物質(zhì)他克莫司（貨號(hào)T-049）、西羅莫司（貨號(hào)S-015）、依維莫司（貨號(hào)E-068）和環(huán)孢素A（貨號(hào)C-093）購(gòu)自美國(guó)Cerilliant公司；同位素內(nèi)標(biāo)西羅莫司-d3（貨號(hào)10286）、依維莫司-d4（貨號(hào)14001）購(gòu)自美國(guó)IsoSciences公司，環(huán)孢素A-d4（貨號(hào)D8710）購(gòu)自美國(guó)Medical Isotopes公司，他克莫司-13Cd4（貨號(hào)IR-14282）購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；七水合硫酸鋅購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；乙酸銨、甲醇、甲酸為質(zhì)譜級(jí)，均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司。實(shí)驗(yàn)用水采用Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。空白全血樣本來(lái)自健康志愿者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)制備

采用重量法制備他克莫司、西羅莫司和依維莫司濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，環(huán)孢素A濃度為40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，均用甲醇稀釋制備，-20 ℃密封避光保存。精密稱取不同質(zhì)量的他克莫司、西羅莫司、依維莫司混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和環(huán)孢素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，制備5個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為50、20、10、5、1 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為500、200、100、50、10 ng/mL），-20 ℃密封避光保存。他克莫司、西羅莫司和依維莫司的校準(zhǔn)范圍為1～50 ng/mL，環(huán)孢素A的校準(zhǔn)范圍為10～500 ng/mL。采用重量法分別制備他克莫司-13Cd4、西羅莫司-d3、依維莫司-d4、環(huán)孢素A-d4的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并以此為基礎(chǔ)，制備混合內(nèi)標(biāo)工作液（他克莫司-13Cd4、西羅莫司-d3、依維莫司-d4濃度為20 ng/mL，環(huán)孢素A-d4濃度為200 ng/mL），-20 ℃密封避光保存。

1.2.2 樣本前處理

用重量法準(zhǔn)確稱取100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液或全血樣本（全血樣本在處理前-80 ℃冰凍至少10 min，以保證充分溶血），置于2 mL離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液（重量法），然后加入300 μL甲醇與0.3 mol/L硫酸鋅的混合溶液（V∶V=1∶1），旋渦混勻10 min，20 000×g離心10 min，吸取上清液，用親水性針式過濾器（13.00 mm×0.22 μm，聚四氟乙烯）過濾，取150 μL濾液，加入帶有玻璃內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱為accucore PFP 色譜柱；流動(dòng)相A為含有2 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液，流動(dòng)相B為含有2 mmol/L乙酸銨的水溶液，流速為0.45 mL/min，柱溫為60 ℃，進(jìn)樣量為4 μL，梯度洗脫（0.0～1.0 min，40%B；1.0～3.5 min，0%B；3.50～3.51 min，0%～40%B；3.51～4.50 min，40%B）。

1.2.4 質(zhì)譜分析條件

離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），離子化方式為正離子模式，離子化電壓為5 500 V，霧化溫度為400 ℃，碰撞氣強(qiáng)度為Medium，氣簾氣、霧化氣和輔助加熱氣分別為25、40、40 psi。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描分析。具體參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)設(shè)置

1.3 ID-LC-MS/MS候選參考方法性能評(píng)估

1.3.1 選擇性和特異性

通過基質(zhì)匹配雙空白樣本信號(hào)確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)的背景噪音，并進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，以評(píng)估方法特異性和選擇性。選取來(lái)源于5名健康志愿者的雙空白（不含分析物和內(nèi)標(biāo)）全血樣本，分別進(jìn)行前處理后進(jìn)樣分析，獲得全血基質(zhì)下的總離子流圖；分別提取每個(gè)分析物及其內(nèi)標(biāo)的選擇性反應(yīng)檢測(cè)色譜圖，若在每個(gè)分析物預(yù)期的保留時(shí)間處無(wú)任何基質(zhì)干擾信號(hào)，且背景噪音較小，可認(rèn)為方法具有良好的特異性和選擇性。另外，通過監(jiān)測(cè)定性離子對(duì)與定量離子對(duì)的離子豐度比來(lái)判斷是否存在未知干擾物[8-9]。

1.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

采用基質(zhì)混合實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。選取來(lái)源于5名健康志愿者的空白全血樣本，按照加標(biāo)的方式分別制備5個(gè)相同濃度的含藥全血樣本，然后通過檢測(cè)5種混合基質(zhì)樣本[溶液基質(zhì)樣本（標(biāo)準(zhǔn)溶液）、全血基質(zhì)樣本和二者體積比分別為5∶5、8∶2、2∶8的混合物]中每個(gè)分析物與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比值來(lái)計(jì)算相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。如果3種混合物的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)<20%，則視為無(wú)相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)[10-12]。

1.3.3 定量限

通過向空白全血樣本中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的方式制備包括預(yù)期的定量限濃度在內(nèi)的4個(gè)濃度梯度的樣本，分別計(jì)算每個(gè)濃度梯度樣本中每個(gè)分析物的理論濃度（C1），然后將不同濃度的樣本各分10份進(jìn)行前處理，上機(jī)檢測(cè)，得到實(shí)際測(cè)定值（C2），將同時(shí)滿足偏移<15%、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）<20%的濃度值定義為定量限[10-12]。

1.3.4 攜帶污染

在評(píng)估攜帶污染時(shí)，先重復(fù)進(jìn)樣低值（L）樣本（定量限濃度樣本），然后交替進(jìn)樣高值（H）樣本（最高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液）和低值樣本，按如下順序進(jìn)樣：L1、L2、L3、H1、H2、L4、H3、H4、L5、L6、L7、L8、H5、H6、L9、H7、H8、L10、H9、H10、L11，比較第1次進(jìn)樣的低值樣本后面跟隨的低值樣本檢測(cè)結(jié)果均值A(chǔ)（即L2、L3、L6、L7、L8的檢測(cè)均值）與隨后進(jìn)樣的高值樣本后面跟隨的低值樣本檢測(cè)結(jié)果均值B（即L4、L5、L9、L10、L11的檢測(cè)均值）的差異。攜帶污染率=（B-A）/A×100%。若低于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)（20%），則認(rèn)為在測(cè)定該高值及以下濃度時(shí)不存在明顯的攜帶污染[9-11]。

1.3.5 正確度

采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)估候選參考方法的正確度。用重量法分別將3個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（他克莫司、西羅莫司、依維莫司低濃度均為100 ng/mL，中濃度均為500 ng/mL，高濃度均為1 000 ng/mL，環(huán)孢素A低、中、高濃度分別為1 000、5 000、10 000 ng/mL；用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液按重量法制備）和空白全血樣本按體積比1∶19制備3個(gè)濃度梯度的加標(biāo)樣本（濃度1：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為5 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為50 ng/mL；濃度2：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為25 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為250 ng/mL；濃度3：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為50 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為500 ng/mL），每個(gè)濃度樣本重復(fù)測(cè)定5次，用加標(biāo)回收率（測(cè)得量/加入量）考察候選參考方法的正確度，分別計(jì)算每個(gè)濃度加標(biāo)樣本的回收率[10-12]。

1.3.6 精密度

用加標(biāo)的方式制備3個(gè)濃度梯度的質(zhì)控樣本（他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度分別為2.5、20、40 ng/mL；環(huán)孢素A濃度分別為25、200、400 ng/mL），每個(gè)濃度樣本重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)檢測(cè)3個(gè)批次，分別計(jì)算每個(gè)濃度質(zhì)控樣本的批內(nèi)CV和批間CV[10-12]。

1.4 不確定度評(píng)估

依據(jù)Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement（GUM），從校準(zhǔn)品制備、樣本處理、儀器檢測(cè)、重復(fù)測(cè)量4個(gè)方面分析不確定度來(lái)源[主要為樣本測(cè)定的變異（不確定度A類評(píng)定）、有證參考物質(zhì)濃度、天平校準(zhǔn)因素（不確定度B類評(píng)定）]，計(jì)算合成不確定度，以擴(kuò)展因子（k）=2計(jì)算擴(kuò)展不確定度和相對(duì)擴(kuò)展不確定度[10-12]。

2 結(jié)果

2.1 4種免疫抑制劑的校準(zhǔn)曲線和線性范圍

他克莫司、西羅莫司和依維莫司在1～50 ng/mL范圍內(nèi)，環(huán)孢素A在10～500 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性（r>0.999）。見圖1。

圖1 4種免疫抑制劑的校準(zhǔn)曲線圖

2.2 候選參考方法的選擇性和特異性

雙空白樣本選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（selected reaction monitoring，SRM）色譜圖顯示，在每個(gè)分析物預(yù)期的保留時(shí)間處無(wú)任何基質(zhì)干擾信號(hào)，且背景噪音非常小，證明候選參考方法具有良好的特異性和選擇性。典型的雙空白樣本SRM色譜圖見圖2，典型的樣本總離子流色譜圖見圖3。

圖2 典型的雙空白樣本SRM色譜圖

圖3 典型的樣本總離子流色譜圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

采用基質(zhì)混合實(shí)驗(yàn)考察相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)，他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A的5份溶液基質(zhì)樣本峰面積比值的均值分別為5.556、2.132、1.318、2.102，5份全血基質(zhì)樣本的峰面積比值的均值分別為6.738、2.528、1.630、2.632，5份8∶2混合物樣本峰面積比值的均值分別為6.560、2.456、1.584、2.580，5份5∶5混合物樣本峰面積比值的均值分別為6.078、2.284、1.450、2.366，5份2∶8混合物樣本峰面積比值的均值分別為5.688、2.200、1.386、2.352。他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)范圍分別為0.08%～5.39%、0.02%～4.48%、0.99%～4.51%、0.71%～8.64%。4種免疫抑制劑不同比例混合物的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)均<10%，可視為無(wú)相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)，即使存在基質(zhì)效應(yīng)，也會(huì)因同位素內(nèi)標(biāo)的存在而被校正。此外，通過監(jiān)測(cè)定性離子對(duì)與定量離子對(duì)的離子豐度比，未發(fā)現(xiàn)存在未知干擾。

2.4 定量限

他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度為0.50、0.75和1.00 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為7.50和10.00 ng/mL時(shí)，CV和偏移均滿足要求。為了保證定量限的穩(wěn)定、可靠，本研究設(shè)定他克莫司、西羅莫司、依維莫司定量限為1 ng/mL，環(huán)孢素A定量限為10 ng/mL。見表2。

表2 定量限樣本檢測(cè)結(jié)果

2.5 攜帶污染率

他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A的攜帶污染率分別為-1.87%、0.00%、-0.94%、1.48%，提示候選參考方法不存在明顯的攜帶污染。

2.6 正確度

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A 3個(gè)濃度梯度的加標(biāo)樣本平均回收率為98.84%～100.99%，候選參考方法的正確度符合要求。見表3。

表3 他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 精密度

他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A 3個(gè)濃度梯度質(zhì)控樣本的批內(nèi)CV和批間CV均<5%。見表4。

表4 候選參考方法檢測(cè)他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A的精密度

2.8 不確定度評(píng)定

候選參考方法測(cè)定人全血樣本他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A濃度產(chǎn)生的不確定度較為合理。具體結(jié)果見表5。

表5 3個(gè)濃度梯度質(zhì)控樣本不確定度評(píng)估結(jié)果

3 討論

他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A均可與紅細(xì)胞結(jié)合，藥物在紅細(xì)胞和血漿之間的濃度比例超過30∶1，因此乙二胺四乙酸抗凝全血是最常用的樣本基質(zhì)[13]，然而，全血樣本基質(zhì)復(fù)雜，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量，就必須對(duì)整個(gè)檢測(cè)流程的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。LC-MS/MS檢測(cè)全血樣本他克莫司、西羅莫司、依維莫司、環(huán)孢素A的過程涉及3個(gè)關(guān)鍵步驟：樣本前處理、色譜條件和質(zhì)譜條件。在樣本前處理過樣本時(shí)，由于全血樣本黏度比較大，且均勻性較差，本研究將全血樣本先-80 ℃冰凍至少10 min，然后平衡至室溫，以保證充分溶血，從而將目標(biāo)分析物從紅細(xì)胞中分離出來(lái)，經(jīng)凍融后的樣本均勻性優(yōu)于未經(jīng)凍融處理的樣本。本研究對(duì)蛋白沉淀劑中硫酸鋅的濃度和硫酸鋅與甲醇的比例進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳的蛋白沉淀效率；最后將高速離心后的上清液進(jìn)行過濾，以減少基質(zhì)的影響，從而得到純凈的進(jìn)樣樣本，整個(gè)處理過程簡(jiǎn)單、省時(shí)。在色譜條件的選擇上，本研究對(duì)色譜柱、流動(dòng)相、柱溫、流速、梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，在保證分析靈敏度的同時(shí)，減小了各種內(nèi)源性干擾物質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物的影響。質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括目標(biāo)分析物母離子/子離子的選擇、電壓和碰撞能量的優(yōu)化、離子源參數(shù)優(yōu)化，使每個(gè)目標(biāo)分析物都具有穩(wěn)定且最佳的響應(yīng)，確保檢測(cè)性能的穩(wěn)定可靠。

本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-12]對(duì)建立的候選參考方法進(jìn)行分析性能驗(yàn)證。在建立方法時(shí)，所有的溶液配制和樣本移取均采用重量法。建立的候選參考方法檢測(cè)環(huán)孢素A的線性范圍為10～500 ng/mL，檢測(cè)他克莫司、西羅莫司和依維莫司的線性范圍為1～50 ng/mL；環(huán)孢素A的定量限為10 ng/mL，他克莫司、西羅莫司和依維莫司的定量限為1 ng/mL；定量限和線性范圍完全能夠滿足常規(guī)檢測(cè)的要求；相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)≤8.64%，證實(shí)了同位素內(nèi)標(biāo)能夠校正基質(zhì)效應(yīng)的影響。本研究精密度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，不同濃度下的4種免疫抑制劑的批內(nèi)CV和批間CV均<5%；環(huán)孢素A 3個(gè)濃度梯度的加標(biāo)樣本回收率平均為98.84%～100.56%，他克莫司、西羅莫司和依維莫司平均為99.04%～100.99%，精密度和正確度完全能夠滿足參考測(cè)量程序的要求。

綜上所述，本研究建立的檢測(cè)4種免疫抑制劑（他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A）的ID-LC-MS/MS候選參考方法具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、精密度好、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可用于他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A項(xiàng)目的量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化，在臨床檢測(cè)中具有實(shí)際價(jià)值。