王亞捷 祖白玲 甘辰欣 武嬌祥 殳 潔杭 晨 陳明暉 林芙君 胡志剛 黃 飚 盛慧明

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200050；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腎臟風(fēng)濕免疫科，上海 200092；3.江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院附屬無(wú)錫兒童醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214023；4.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018）

原發(fā)性膜性腎病（primary membranous nephropathy，PMN）是一種器官特異性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為無(wú)癥狀蛋白尿和水腫，病理特征為腎小球上皮下免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫性增厚。有一項(xiàng)大型多中心回顧性研究調(diào)查了2004—2014年我國(guó)71 151例行腎穿刺的患者，結(jié)果顯示，在11年間，中國(guó)人群中膜性腎病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)每年增加13%[1-2]。PMN的臨床預(yù)后差異較大，在未經(jīng)治療的患者中，約有1/3病情可自行緩解，有1/3在10年內(nèi)會(huì)進(jìn)展為終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）。有學(xué)者利用激光顯微解剖和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)PMN患者的腎臟活體組織樣本進(jìn)行研究，確定了主要的PMN相關(guān)抗原為M型磷脂酶A2受體（M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R1）、血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域7A（thrombospondin type-1 domain 7A，THSD7A）、中性肽鏈內(nèi)切酶（neutral endopeptidase，NEP）、內(nèi)皮素（exostosin，EXT）1和EXT2[3-4]。新的蛋白和潛在抗原的發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了臨床對(duì)PMN的認(rèn)知和診斷、治療的發(fā)展。相對(duì)于腎臟活體組織樣本，外周血樣本具有更易獲取且無(wú)創(chuàng)的優(yōu)勢(shì)，但目前對(duì)PMN外周血中活性小分子蛋白的研究很少[5]。因此，探討外周血血漿中新的小分子蛋白及其功能對(duì)PMN的診斷和治療意義較大。PLA2R1是PMN患者最主要的內(nèi)源性抗原，有70%～80%的PMN患者體內(nèi)可檢測(cè)到PLA2R1抗體，而在其他腎小球腎炎或繼發(fā)性腎小球疾病患者體內(nèi)則檢測(cè)不到PLA2R1抗體，提示PLA2R1對(duì)PMN有高度特異性[6]。有學(xué)者建議，在有PLA2R1抗體存在的情況下，除非懷疑患有其他疾病，否則不需要進(jìn)行腎臟活體組織檢查[7]。因此，本研究采用納升級(jí)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（nano-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，nano-HPLC-MS/MS）檢測(cè)PLA2R1抗體陽(yáng)性的PMN患者血漿中相對(duì)分子質(zhì)量低于3 000的小分子蛋白，分析PMN患者與健康對(duì)照者之間差異表達(dá)的小分子多肽，篩選可能參與PMN發(fā)生的小分子蛋白，尋找具有生物學(xué)意義的多肽標(biāo)志物，為篩選潛在藥物治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年5月—2021年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院首次接受腎臟活體組織檢查并被確診為PMN的患者28例（PMN組），其中男20例、女8例，年齡37～75歲。所有患者腎小球PLA2R1抗體陽(yáng)性，排除其他自身免疫性疾病、感染、惡性腫瘤和藥物所致的并發(fā)癥等患者。選取同期上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院健康體檢者28名（正常對(duì)照組），其中男20名、女8名，年齡31～79歲，排除腎功能異常等可能患有腎臟疾病者。2個(gè)組之間年齡和性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021-017-01），所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理

采集所有研究對(duì)象靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，離心分離血漿。

1.2.2 血漿PLA2R1相關(guān)抗體和補(bǔ)體檢測(cè)

采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測(cè)血漿抗PLA2R1-IgG抗體和抗PLA2R1-IgG4抗體滴度，試劑盒購(gòu)自浙江博實(shí)生物科技有限公司。血漿抗 PLA2R1-IgG抗體滴度≥14.00 RU/mL、抗PLA2R1-IgG4抗體滴度≥200.00 ng/mL為陽(yáng)性。采用ADVIA-2400全自動(dòng)生化分析儀和配套試劑（德國(guó)西門(mén)子公司）檢測(cè)血漿C3、C4水平。

1.2.3 多肽提取

取500 μL血漿，與甲醇按1∶2渦旋混勻，4 ℃沉淀1 h，每10 min旋轉(zhuǎn)混勻1次。4 ℃12 000×g離心20 min，收集上清液，采用SAVANT SPD1010冷凍離心濃縮儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）冷凍抽干，用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，經(jīng)3KD超濾管過(guò)濾后收集濾液。用去污劑去除試劑盒（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）去除聚乙二醇污染，經(jīng)C18固相萃取柱脫鹽后冷凍干燥。

1.2.4 nano-HPLC-MS/MS鑒定

將凍干的多肽樣本溶于0.1%甲酸水溶液中，采用nano-HPLC-MS/MS檢測(cè)。檢測(cè)系統(tǒng)為EASY-nano LC 1200液相色譜系統(tǒng)+Q Exactive質(zhì)譜儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。上樣量為10 μL，分析柱為德國(guó)Dr Maisch公司Acclaim PepMap C18柱（75 μm×25 cm），以60 min的梯度分離樣本（0～4 min以4%B相平衡；4～46 min，B相以非線性梯度升高到60%；46～50 min，B相升高到100%，維持10 min），柱流量為0.6 μL/min，柱溫為55 °C。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用PEAKS Studio 10.6軟件（加拿大Bioinformatics Solutions公司）對(duì)原始文件數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用PEAKS Studio 10.6軟件中基于數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索鑒定算法對(duì)GDP21080373數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，檢索參數(shù)：碎片離子質(zhì)量容許誤差為0.02，母離子質(zhì)量容許誤差為0.007‰，可變修飾為Oxidation（M） 15.99、Acetylation（Protein N-term）42.01、Deamidation（NQ）0.98。按1%錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）過(guò)濾質(zhì)譜圖/肽段，獲得鑒定后的質(zhì)譜圖和肽段列表，然后在蛋白水平上以1%FDR和1 unique peptide再次進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，最后基于特異譜峰面積強(qiáng)度進(jìn)行半定量。差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One way ANOVA），取|fold change|>1.2、P<0.05的差異蛋白。

1.3 生物信息學(xué)分析

在線獲取多肽等電點(diǎn)（isoelectric point，PI）和相對(duì)分子質(zhì)量信息（https：//web.expasy.org/protparam/）。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）尋找差異多肽的來(lái)源。使用Blast2GO 5軟件進(jìn)行功能注釋?zhuān)捎肎OATOOLS軟件對(duì)差異多肽進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集，采用David BioInformation Resources 6.8軟件（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。

1.4 差異表達(dá)多肽的驗(yàn)證

利用差異表達(dá)多肽標(biāo)準(zhǔn)工作液在AB Sciex QTRAP 6500 LC-MS/MS系統(tǒng)中篩選并建立定量檢測(cè)的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)信息，調(diào)整DP和CE參數(shù)。采用不同質(zhì)量濃度的差異表達(dá)多肽標(biāo)準(zhǔn)工作液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（r2>0.99）。采用蛋白沉淀法提取多肽，將預(yù)冷的甲醇與血漿混勻，4 ℃14 000×g離心10 min，取上清，提取多肽。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測(cè)處理后的樣本，色譜柱為Acclaim PepMap C18柱（德國(guó)Dr Maisch公司）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PMN組和正常對(duì)照組外周血中目標(biāo)差異肽段的信號(hào)進(jìn)行定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估PMN患者血漿C4b與抗PLA2R1-IgG抗體的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMN組和正常對(duì)照組血漿相關(guān)抗體和補(bǔ)體水平比較

PMN組血漿抗PLA2R1-IgG抗體和抗PLA2R1-IgG4抗體陽(yáng)性率為100%，正常對(duì)照組均為陰性。PMN組與正常對(duì)照組血漿C3、C4水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 PMN組和正常對(duì)照組血漿C3、C4和抗體水平比較

2.2 PMN組和正常對(duì)照組血漿差異表達(dá)多肽分析

采用nano-HPLC-MS/MS檢出903條多肽，有31條多肽在PMN組和正常對(duì)照組中呈差異表達(dá)（P<0.05，|fold change|>1.2），其中表達(dá)下調(diào)15條、表達(dá)上調(diào)16條。所有差異表達(dá)多肽及其前體蛋白見(jiàn)表2、表3。

表2 PMN組較正常對(duì)照組表達(dá)下調(diào)的差異表達(dá)多肽

表3 PMN組較正常對(duì)照組表達(dá)上調(diào)的差異表達(dá)多肽

2.3 引導(dǎo)差異表達(dá)多肽的理化特性

大多數(shù)多肽的相對(duì)分子質(zhì)量為500～1 500，PI為3.00～6.00或8.00～13.00。在31條差異表達(dá)多肽中，有8條來(lái)源于C4b。見(jiàn)圖1。

圖1 31條差異表達(dá)多肽的理化特性

2.4 差異表達(dá)多肽前體蛋白的生物信息學(xué)分析

GO富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)多肽富集于囊泡、細(xì)胞外泌體、血液微粒、分泌顆粒腔、血小板α顆粒腔等區(qū)域；參與對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞分泌、胞外分泌、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、血小板脫顆粒、調(diào)節(jié)性胞吐作用、急性時(shí)相反應(yīng)、蛋白質(zhì)加工的調(diào)控、纖維蛋白溶解等生物過(guò)程；具有相同蛋白結(jié)合、內(nèi)肽酶抑制劑活性、內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性等分子功能，在C5a過(guò)敏性毒素趨化受體結(jié)合、補(bǔ)體成分C1q結(jié)合等方面發(fā)揮作用，見(jiàn)圖2（a）～（c）。KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)多肽前體蛋白主要在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)分邪l(fā)揮作用，見(jiàn)圖2（d）；其中，在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路富集的前體蛋白所占比例最大。

圖2 差異表達(dá)多肽前體蛋白的GO富集和KEGG通路分析

2.5 PMN患者血漿中C4b差異表達(dá)的驗(yàn)證

基于C4b各分解多肽在血漿中的穩(wěn)定性和相對(duì)豐度，本研究選擇表2中QLNNRQIR進(jìn)行C4b定量驗(yàn)證。結(jié)果提示，PMN組血漿C4b水平為（13.35±0.47）ng/mL，顯著低于正常對(duì)照組[（22.36±5.72）ng/mL]（P<0.001）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，PMN患者血漿C4b與抗PLA2R1-IgG抗體水平無(wú)相關(guān)性（r=0.03，P=0.877）。見(jiàn)圖3。

圖3 PMN組與正常對(duì)照組血漿C4b水平的比較及其與抗PLA2R-IgG抗體的相關(guān)性

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)PMN患者和正常對(duì)照者血漿多肽的篩選、差異分析和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路的C4b可能在PMN的發(fā)病過(guò)程中有重要意義。PMN是一種以免疫復(fù)合物沉積為病理特征的腎小球疾病，有70%以上的PMN患者體內(nèi)可檢出PLA2R1抗體，主要亞類(lèi)為IgG4[8]。PMN患者體內(nèi)的PLA2R1抗體與足細(xì)胞表達(dá)的PLA2R1形成免疫復(fù)合物，介導(dǎo)了足細(xì)胞的免疫病理?yè)p傷。由于抗PLA2R1-IgG4抗體的Fc結(jié)構(gòu)域上缺少半乳糖殘基，使甘露糖結(jié)合凝集素（mannose-binding lectin，MBL）能直接結(jié)合IgG4，并激活C4，進(jìn)而激活MBL途徑，最終形成攻膜復(fù)合物，損傷腎小球基底膜，導(dǎo)致蛋白尿形成[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，C4b和MBL沉積（提示補(bǔ)體級(jí)聯(lián)凝集素通路的激活）與IgA腎病的不良預(yù)后相關(guān)，但這一結(jié)果在膜性腎病中尚未得到證實(shí)。此外，C4b異常激活可能還會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性紅斑狼瘡、阿爾茨海默病和精神分裂癥的發(fā)生和病情的加重。

與免疫復(fù)合物介導(dǎo)的補(bǔ)體消耗性疾?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡）不同，PMN患者血漿中總的補(bǔ)體蛋白（如C3和C4）水平通常不會(huì)降低。本研究發(fā)現(xiàn)，PMN患者血漿中C4b水平顯著降低，可能與PMN患者補(bǔ)體沉積相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，PMN患者半乳糖缺陷型IgG4水平升高，抗PLA2R1-IgG4抗體以糖基化依賴(lài)的方式直接結(jié)合MBL，誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架蛋白水解，進(jìn)而激活補(bǔ)體受體C3aR1或C5aR1和C5b-9補(bǔ)體復(fù)合體末端的組裝，導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)激活[11]。C4b由C4裂解而來(lái)，與C2裂解產(chǎn)物C2a形成C3轉(zhuǎn)化酶（即C4b2a形式），在補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑和凝集素途徑中發(fā)揮重要作用。PMN患者C4b多肽顯著下調(diào)，提示C4b參與了PMN的補(bǔ)體激活，可作為補(bǔ)體藥物治療靶點(diǎn)的候選分子。有研究結(jié)果顯示，抑制補(bǔ)體激活旁路途徑（alternative pathway，AP）中C3轉(zhuǎn)化酶（即C3bBb形式）的形成在PMN中具有治療潛力，在海曼腎炎模型中，AP活性被抑制，幾乎沒(méi)有能被檢測(cè)到的C3沉積，阻止了疾病的進(jìn)展[12-13]。將C4b作為新的靶向藥物分子，通過(guò)抑制C4b參與C3轉(zhuǎn)化酶的形成，阻止經(jīng)典途徑和凝集素途徑的激活，可成為補(bǔ)體抑制藥物研發(fā)的新方向，為開(kāi)發(fā)更特異和個(gè)性化的治療方案創(chuàng)造潛在的可能性。

本研究通過(guò)非靶向質(zhì)譜方法獲得差異多肽表達(dá)譜，并通過(guò)生物信息學(xué)分析和定向質(zhì)譜方法進(jìn)行驗(yàn)證，獲得了C4b來(lái)源的多肽，或可作為潛在的診斷標(biāo)志物。但該多肽分子與抗PLA2R1抗體滴度無(wú)相關(guān)性，原因可能為：IgG4亞類(lèi)抗體所形成的免疫復(fù)合物無(wú)法激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，而以激活凝集素途徑為主；同時(shí)，PMN的自身抗體亞類(lèi)也經(jīng)歷了從IgG1到IgG3，再轉(zhuǎn)換為以IgG4為主的動(dòng)態(tài)過(guò)程；另外，病理學(xué)檢查結(jié)果也提示受損組織局部有IgG不同亞類(lèi)共存的情況，血清抗體滴度和轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系也存在爭(zhēng)論[14]。由于受損組織抗體種類(lèi)的復(fù)雜性和個(gè)體遺傳背景的差異，C4b、抗PLA2R1-IgG4抗體和局部微環(huán)境之間的關(guān)系受到多種因素的影響。這也提示補(bǔ)體來(lái)源的多肽或能從另一個(gè)角度反映PMN患者的疾病進(jìn)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PLA2R1相關(guān)PMN患者血漿有31條差異表達(dá)多肽，其中C4b水平顯著降低。C4b主要參與補(bǔ)體激活、免疫反應(yīng)和腎臟損傷。本研究結(jié)果為今后PMN血漿中小分子肽的分子診斷研究奠定了一定的基礎(chǔ)，C4b等差異表達(dá)多肽或可作為PMN新的疾病預(yù)測(cè)分子和治療靶點(diǎn)。