楊春 郭燦 喬大河 郭燕 梁思慧 李燕 陳正武

摘要：為更好地保護(hù)和開發(fā)利用三都野生茶樹資源，以16份三都野生茶樹為研究對象，采用高效液相色譜和紫外分光光度法檢測茶樹的重要生化組分，并于春季和秋季對表型性狀開展觀測，結(jié)合變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)分析三都野生茶樹資源變異程度和多樣性水平。結(jié)果表明，20個描述性表型性狀變異系數(shù)在0～35.68%之間，平均值為9.94%，遺傳多樣性指數(shù)在0～1.095之間，平均值為0.257；9個數(shù)量性表型性狀變異系數(shù)在0～32.60%之間，平均值為12.68%，遺傳多樣性指數(shù)在0～1.927之間，平均值為1.077。17個生化性狀變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)變幅分別為0～400.0%和0～1.927，平均值分別為65.28% 和1.320。三都野生茶樹資源表型鑒定性狀表現(xiàn)為子房3室、無毛、頂芽有毛。生化特征表現(xiàn)為高茶多酚、高C、高可可堿和低游離氨基酸、無茶氨酸、低兒茶素總量、低EGCG、低或無咖啡堿。三都野生茶樹資源表型性狀和生化組分較統(tǒng)一，資源內(nèi)部變異小，C和可可堿為優(yōu)勢特征組分。結(jié)合表型和生化特征，推測三都野生茶樹資源可能為榕江茶的變種。

關(guān)鍵詞：三都；野生茶樹；遺傳多樣性指數(shù)；可可堿；表型性狀；生化組分

中圖分類號：S571.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0111-08

基金項目 貴州省科技計劃（編號：黔科合支撐［2019］2254號、黔科合平臺人才［2020］2103號）；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色動植物資源收集、保存與創(chuàng)制利用項目（編號：黔農(nóng)科院種質(zhì)資源［2022］03號）。

作者簡介：楊 春（1988—），女，湖南益陽人，碩士，助理研究員，主要從事茶樹資源育種與品種抗性研究。E-mail：610681998@qq.com。

通信作者：陳正武，研究員，主要從事茶樹資源育種工作。E-mail：zwchentea@163.com。

我國是茶樹［Camellia sinensis （L.） O.Kuntze］的原產(chǎn)地，云南、貴州等省分布著數(shù)量繁多、類型多樣的野生茶樹資源［1-4］，這些野生茶樹資源對于茶樹的遺傳演化、品種改良及分子育種等研究有著重要意義［5-7］。因此，加大力度保護(hù)和深入研究珍稀野生茶樹資源，是現(xiàn)今茶樹種質(zhì)資源研究的重點［8］。

三都水族自治縣，位于貴州省黔南布依族苗族自治州，地處月亮山、雷公山腹地，是貴州野生茶樹集中分布地之一［9］。前期已針對三都野生茶樹親緣關(guān)系、遺傳多樣性等展開了一定研究［10-11］，但尚未見三都野生茶樹表型特征及生化性狀等方面的相關(guān)報道。本研究選取16份代表性三都野生茶樹為研究對象，通過測定主要生化成分和觀測樹、花、葉等表型性狀，結(jié)合統(tǒng)計分析方法，明晰三都野生茶樹資源表型及生化的變異程度和多樣性水平，歸納出三都野生茶樹資源整體的表型特征和生化特征，以期為進(jìn)一步保護(hù)和開發(fā)利用三都野生茶樹資源打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜（HPLC）儀：Agilent 1260 Infinity Ⅱ（美國安捷倫）；

紫外分光光度計：TU-1800（北京普析）；

色譜柱：大連依利特Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

咖啡堿、沒食子酸、兒茶素類［兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG） ］和茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購自合肥博美生物科技有限公司，N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、冰醋酸等有機(jī)試劑為市售HPLC級。

1.2 試驗材料

試驗茶樹取自貴州省黔南州三都水族自治縣原始森林中，地理范圍為25°55′48″～25°59′40″N，108°9′32″～108°20′46″E，海拔范圍為1 300～1 500 m。選取基徑大于10 cm的野生茶樹進(jìn)行取樣和掛牌（圖1）。福鼎大白茶（對照）取自貴州省茶葉研究所湄潭種質(zhì)資源圃。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 于2020年5月，采各標(biāo)記單株1芽2葉鮮葉，用微波殺青的方法［12］，制備生化檢測樣。對照取樣時間為2020年4月，取樣標(biāo)準(zhǔn)1芽2葉。

1.3.2 檢測方法

表型性狀：分別于2020年、2021年春季和秋季調(diào)查記錄樹、葉、花、芽的性狀，表型調(diào)查及描述代碼參考《茶樹種質(zhì)資源數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范》，采用基恩士超景深顯微鏡（VHX-5000）觀測頂芽、子房和腋芽茸毛，每份材料調(diào)查10個葉、芽、花，數(shù)量性表型性狀取平均值，描述性表型性狀以出現(xiàn)概率最大的描述代碼為準(zhǔn)。

生化成分：游離氨基酸含量采用GB/T 8314—2013 《茶 游離氨基酸總量的測定》中的方法進(jìn)行測定；茶多酚含量采用GB/T 8313—2018 《茶葉中茶多酚和兒茶素類的檢測方法》進(jìn)行測定；茶氨酸含量參考岳婕等的方法［13］進(jìn)行測定；兒茶素組分參考周順珍等的方法［14］進(jìn)行測定。每個樣品重復(fù)檢測3次，數(shù)據(jù)取3次平均值。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

評價遺傳多樣性指數(shù)采用香農(nóng)-維納指數(shù)（Shannon-Wiener index）。性狀分布頻率及多樣性分析采用Excel 2010軟件。聚類分析和Pearson相關(guān)性分析采用SPSS 21.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀遺傳多樣性分析

本研究共統(tǒng)計分析了16份三都野生茶樹樹型、葉片大小、葉形等20個描述性表型性狀和葉長、葉寬等9個數(shù)量性表型性狀（表1、表2）。20個描述性表型性狀在描述代碼上有不同的分布表現(xiàn)，其中葉片大小和雌雄蕊相對高度在描述代碼上均有分布但不均勻，具體葉片大小以中葉居多，雌雄蕊相對高度以等高居多。樹型、葉形、葉身、葉齒密度、葉齒銳度、葉尖及葉色不均勻分布于描述代碼上的2～3項，具體來看，樹型表現(xiàn)為小喬木和喬木，以小喬木為主；葉形主要為橢圓形、長橢圓形和披針形，三者數(shù)量相差不大；葉身表現(xiàn)為內(nèi)折和平，以內(nèi)折居多；葉齒以密度密、銳度中居多；葉尖表現(xiàn)為急尖和漸尖，漸尖居多；葉色有綠色和深綠色，深綠色占絕大多數(shù)。葉面、葉質(zhì)、葉基、萼片茸毛、萼片顏色、花瓣顏色、花瓣質(zhì)地、花柱裂位、子房茸毛、腋芽茸毛及頂芽茸毛全部集中分布于1個描述代碼，具體表現(xiàn)為葉面微隆起、葉質(zhì)中、葉基楔形、萼片茸毛無、萼片顏色綠色、花瓣顏色白色、花瓣質(zhì)地薄、花柱裂位高、子房無茸毛、腋芽和頂芽有茸毛。

9個數(shù)量性表型性狀中萼片數(shù)和柱頭開裂數(shù)并無變化，穩(wěn)定表現(xiàn)出萼片5瓣和柱頭3裂的性狀；葉脈對數(shù)和花瓣數(shù)同樣變幅較小，葉脈對數(shù)表現(xiàn)出8對或9對，花瓣7瓣居多；葉長、葉寬、葉面積、花冠直徑及花柱長度的變幅相對較大，遺傳多樣性指數(shù)同樣高于其他4個性狀。

20個描述性表型性狀變異系數(shù)在0～35.68%之間，平均值為9.94%；遺傳多樣性指數(shù)在0～1.095之間，平均值為0.257。9個數(shù)量性表型性狀變異系數(shù)在0～32.60%之間，平均值為12.68%；遺傳多樣性指數(shù)在0～1.927之間，平均值為1.077。29個表型性狀的平均變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)分別為10.79%和0.512，表明三都野生資源表型性狀的變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)處于較低水平，且有11個描述性表型性狀和2個數(shù)量性表型性狀集中分布，變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)都為0，這說明三都野生茶樹在表型上有多個性狀表現(xiàn)一致，資源內(nèi)部變異較小，存在一定的封閉性。

2.2 生化性狀遺傳多樣性分析

參照茶樹中常規(guī)生化成分和特征性次生代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)對16份三都野生茶樹的17個生化性狀進(jìn)行分析，以福鼎大白茶為對照比對三都資源與代表性栽培種在生化性狀上的典型差異。

由表3可知，17個生化性狀變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)變幅分別為0～400.0%和0～1.927，平均值分別為65.28% 和1.320。三都資源在生化成分上與對照福鼎大白茶差異較大。福鼎大白茶中游離氨基酸和茶氨酸含量分別是3.94%和2.02%，而三都資源中游離氨基酸含量較低，最高僅1.63%，低于對照福鼎大白茶的一半，且16份三都野生茶樹中均未檢測到茶氨酸。福鼎大白茶中茶多酚含量為16.78%，兒茶素總量為12.49%，兒茶素占比為74.43%，符合兒茶素占茶多酚含量70.0%～80.0%的規(guī)律［15］，而三都資源表現(xiàn)出典型的高茶多酚、 低兒茶素的特征，茶多酚含量、兒茶素含量和兒茶素占比平均值分別為22.99%、6.29%和27.46%。對比三都野生茶樹和福鼎大白茶的兒茶素單體可知，福鼎大白茶中主要兒茶素單體為表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），含量為7.02%，占兒茶素總量的56.2%。三都資源中占主導(dǎo)的兒茶素單體為兒茶素（C），含量在3.59%～5.56%之間，其次是表兒茶素沒食子酸酯（ECG），含量在0.71%～1.69%之間，表沒食子兒茶素（EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、EGCG和表兒茶素（EC）含量均較低。對比生物堿組成可知，福鼎大白茶中主要生物堿是咖啡堿，含量為3.79%；三都資源中的主要生物堿為可可堿，含量范圍在3.31%～5.76%之間，幾乎不含咖啡堿。

2.3 聚類分析和相關(guān)性分析

2.3.1 聚類分析

以資源間存在變異的22個數(shù)量指標(biāo)（葉長、葉寬、葉面積、葉脈對數(shù)、花瓣數(shù)、花冠直徑、花柱長度、氨基酸含量、茶多酚含量、沒食子酸含量、EGC含量、C含量、EC含量、EGCG含量、ECG含量、非酯型兒茶素含量、酯型兒茶素含量、兒茶素總量、兒茶素占比、咖啡堿含量、可可堿含量和茶堿含量）為依據(jù)，對16份三都野生茶樹進(jìn)行聚類分析。

由圖2、表4可知，16份三都野生茶樹在歐式距離為10時，可分為3類。第Ⅰ類包括SD-26、SD-29 等7份野生茶樹，主要特點為葉長、葉寬和葉面積均較小，茶多酚和酯型兒茶素含量較高，氨基酸含量較低；第Ⅱ類包括SD-2、SD-20-1等8份野生茶樹，主要特點為氨基酸含量較高，C含量、非酯型兒茶素含量和兒茶素總量較低，兒茶素占比較低，可可堿含量較高；SD-20-2單獨構(gòu)成第Ⅲ類，主要特點為葉長、葉寬和葉面積較大，茶多酚、酯型兒茶素和可可堿含量較低，C、非酯型兒茶素含量和兒茶素總量較高，兒茶素占比較高。

2.3.2 相關(guān)性分析

同樣以資源間存在變異的22個數(shù)量指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果（表5）顯示，三都野生茶樹表型性狀與生化性狀間相關(guān)性不大，僅咖啡堿與花瓣數(shù)存在顯著負(fù)相關(guān)。表型性狀中葉片性狀相關(guān)性較強(qiáng)，葉長、葉寬和葉面積三者間存在極顯著正相關(guān)，花性狀僅中花冠直徑與花柱長度間存在極顯著正相關(guān)，葉片性狀與花性狀間不存在顯著相關(guān)性。生化性狀間的相關(guān)性要強(qiáng)于表型性狀，有19對生化性狀間存在顯著或極顯著相關(guān)性，沒食子酸含量與C、EC、 非酯型兒茶素含量及兒茶素總量和兒茶素占比間存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。C含量和EC含量不僅相互間存在極顯著正相關(guān)，同時與非酯型兒茶素含量、兒茶素總量和兒茶素占比間存在顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系。EGCG含量和ECG含量與酯型兒茶素含量存在極顯著正相關(guān)。3個生物堿成分中，可可堿含量與茶堿含量間存在極顯著正相關(guān)。

3 討論

3.1 三都野生茶樹資源多樣性分析

三都野生茶樹表型性狀和生化成分的遺傳多樣性指數(shù)平均值分別為0.512和1.320，低于陜西［16］、江西［17］、重慶［18］及貴州多地的地方茶樹種質(zhì)［19-20］，也低于納雍［21］、鎮(zhèn)寧［22］、雷波［23］等地的野生茶樹。說明三都野生茶樹生長環(huán)境較封閉，表型及生化遺傳背景單一，資源內(nèi)部變異類型不豐富。

3.2 三都野生茶樹資源初鑒

子房有無茸毛、子房室數(shù)和頂芽（腋芽）是否具毛是茶種植物分類鑒定的主要依據(jù)［24］。茶種植物（C. sinensis）的鑒定表型特征為子房3室、有毛、頂芽有毛［25］，而三都野生茶樹則是子房3室、無毛、頂芽（腋芽）有毛的表型特征。參考陳濤林關(guān)于榕江茶、突肋茶和元寶山茶的研究［26］發(fā)現(xiàn)，三都野生茶樹在形態(tài)上與榕江茶相似度較高，除同樣是子房3室、無毛，頂芽有毛外，在葉長、葉寬、葉面積、葉尖、葉形、花柱長度等性狀上同樣表現(xiàn)相近，但在樹型、萼片茸毛等性狀上存在明顯差異，榕江茶為灌木，萼片外側(cè)有疏毛，三都野生茶樹不存在灌木類群，且萼片外側(cè)光滑無毛。生化上，三都野生茶樹與榕江茶均表現(xiàn)出以可可堿為主要生物堿、C為主要兒茶素單體及茶氨酸含量甚微的生化特征。因此，結(jié)合表型性狀和生化特性，推測三都野生茶樹與元寶山野生茶樹一樣，可能為榕江茶變種。

3.3 三都野生茶樹資源生化特性與利用

咖啡堿、EGCG和茶氨酸是茶樹中的優(yōu)勢組分［15］。大量研究發(fā)現(xiàn)，野生茶樹有著區(qū)別于常規(guī)栽培種茶樹的生化特性。滕杰等研究發(fā)現(xiàn)，禿房茶（C. gymnogyna）中生物堿組成明顯有別于其他茶種，以可可堿為主要生物堿［27］。Jin等研究發(fā)現(xiàn)，福建野生紅芽茶中主要兒茶素單體為GCG，主要生物堿組分是可可堿［28］。陳瀟敏等研究發(fā)現(xiàn)，福建野生茶樹中存在以苦茶堿為主要生物堿的特異種質(zhì)［29］。三都野生茶樹資源中C和可可堿為優(yōu)勢組分，可可堿對癌癥、心血管疾病、呼吸疾病等方面有積極干預(yù)與治療作用［30］，后續(xù)可作為特異茶樹種質(zhì)資源加以開發(fā)利用。

4 結(jié)論

三都野生茶樹資源表型和生化的遺傳多樣性指數(shù)均處于較低水平，在表型和生化層面分化程度不高。主要鑒定表型性狀表現(xiàn)為子房3室、無毛、頂芽（腋芽）有毛。生化性狀整體表現(xiàn)出高茶多酚、低兒茶素、低氨基酸和無茶氨酸的特點，C和可可堿是三都野生茶樹的特征性優(yōu)勢組分。結(jié)合表型性狀和生化特性，推測三都野生茶樹可能為榕江茶變種。本研究僅對三都野生茶樹資源表型及茶樹常規(guī)生化開展研究，后續(xù)可結(jié)合非靶向代謝組分析三都野生茶樹與栽培種的差異代謝物，同時結(jié)合全基因組測序等分子手段，分析三都野生茶樹在茶樹起源及進(jìn)化中的地位。

參考文獻(xiàn)：

［1］張文駒，戎 俊，韋朝領(lǐng)，等. 栽培茶樹的馴化起源與傳播［J］. 生物多樣性，2018，26（4）：357-372.

［2］劉亞兵，趙華富，喬大河，等. 野生大樹茶種質(zhì)資源的品質(zhì)指標(biāo)多樣性分析評鑒［J］. 食品工業(yè)，2020，41（9）：168-172.

［3］牛素貞，安紅衛(wèi)，宋勤飛，等. 貴州野生茶樹立地土壤養(yǎng)分狀況分析及綜合評價［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，32（6）：1039-1048.

［4］王 菲，程小毛，肖云龍，等. 千家寨野生古茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分計量特征對海拔梯度的適應(yīng)［J］. 生態(tài)學(xué)雜志，2021，40（7）：1958-1968.

［5］Meegahakumbura M K，Wambulwa M C，Li M M，et al. Domestication origin and breeding history of the tea plant （Camellia sinensis） in China and India based on nuclear microsatellites and cpDNA sequence data［J］. Frontiers in Plant Science，2018，8：2270.

［6］Jiang C K，Zhao W F，Zeng Z，et al. A treasure reservoir of genetic resource of tea plant （Camellia sinensis） in Dayao Mountain［J］. Genetic Resources and Crop Evolution，2018，65（1）：217-227.

［7］Du J K，He X L，Zhou Y M，et al. Gene coexpression network reveals insights into the origin and evolution of a theanine-associated regulatory module in non-Camellia and Camellia species［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2021，69（1）：615-626.

［8］金基強(qiáng)，張晨禹，馬建強(qiáng)，等. 茶樹種質(zhì)資源研究“十三五”進(jìn)展及“十四五”發(fā)展方向［J］. 中國茶葉，2021，43（9）：42-49，76.

［9］陳湖芳. 基于基因組重測序揭示貴州古茶樹起源與進(jìn)化的研究［D］. 貴陽：貴州大學(xué)，2021：63-64.

［10］劉青，趙德剛，趙懿琛. 古茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性ISSR分析［J］. 種子，2021，40（5）：7-14.

［11］郭 燦，皮發(fā)娟，吳昌敏，等. 基于GBS測序的全基因組SNP揭示貴州地方茶組植物資源的親緣關(guān)系［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2021，52（3）：660-670.

［12］靖翠翠，楊秀芳，譚 蓉，等. 微波制樣對茶葉內(nèi)質(zhì)成分的影響［J］. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，6（4）：1265-1270.

［13］岳 婕，李 丹，楊 春，等. 不同茶樹品種氨基酸組分及含量分析［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（23）：141-143.

［14］周順珍，龔 雪，周國蘭，等. HPLC法測定茶葉中兒茶素及咖啡堿［J］. 化學(xué)分析計量，2013，22（5）：27-29.

［15］宛曉春，夏 濤. 茶樹次生代謝［M］. 北京：科學(xué)出版社，2015：1-3.

［16］丁帥濤，程曉梅，張 亞，等. 基于表型性狀和生化成分的陜西茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性研究［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，28（4）：607-619.

［17］王治會，彭 華，江新鳳，等. 江西茶樹種質(zhì)資源芽葉表型多樣性分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（1）：134-138，142.

［18］翟秀明，李 解，唐 敏，等. 重慶30份茶樹種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀與生化成分多樣性［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2021，33（7）：1244-1255.

［19］張小琴，周富裕，楊 春，等. 貴定鳥王種茶樹資源農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀多樣性分析［J］. 分子植物育種，2015，13（2）：415-423.

［20］楊 春，吳昌敏，石偉昌，等. 黎平地方茶樹資源生化成分多樣性分析及優(yōu)異單株鑒選［J］. 種子，2020，39（10）：63-66，72.

［21］葛立雯，郭 維，潘正康，等. 貴州姑菁野生茶樹形態(tài)多樣性及相關(guān)性研究［J］. 植物遺傳資源學(xué)報，2015，16（3）：497-502.

［22］曹 雨，喬大河，趙華富，等. 25份貴州鎮(zhèn)寧野生茶樹種質(zhì)資源的表型及生化組分多樣性分析［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2018，34（14）：81-88.

［23］周 斌，王留彬，韓浩蕾，等. 雷波野生茶樹資源春季新梢主要生化成分分析［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，29（3）：390-397.

［24］陳 亮，虞富蓮，童啟慶. 關(guān)于茶組植物分類與演化的討論［J］. 茶葉科學(xué)，2000，20（2）：89-94.

［25］閔天祿. 世界山茶屬的研究［M］. 昆明：云南科技出版社，2000：130.

［26］陳濤林. 廣西元寶山一種特異茶飲植物的系統(tǒng)學(xué)鑒定與綜合評價研究［D］. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019：16-72.

［27］滕 杰，曾 貞，黃亞輝. 禿房茶嘌呤生物堿組成特點及生化品質(zhì)成分的研究［J］. 廣西植物，2018，38（5）：568-576.

［28］Jin J Q，Chai Y F，Liu Y F，et al. Hongyacha，a naturally caffeine-free tea plant from Fujian，China［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2018，66（43）：11311-11319.

［29］陳瀟敏，趙 峰，王淑燕，等. 福建野生茶樹資源嘌呤生物堿構(gòu)成評價及特異資源篩選［J］. 茶葉科學(xué)，2022，42（1）：18-28.

［30］吳文亮，童 彤，胡 瑤，等. 可可茶及其優(yōu)勢化學(xué)成分的健康功效研究進(jìn)展［J］. 茶葉科學(xué)，2021，41（5）：593-607.