袁連玉， 張麗， 童華榮， 代洪葦， 鄭姝婷

西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

主持人簡(jiǎn)介

曾亮, 西南大學(xué)涪陵研究院院長(zhǎng), 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院教授, 博士研究生導(dǎo)師． 主要從事茶及飲料植物資源功效評(píng)價(jià)與利用、 茶葉風(fēng)味物質(zhì)化學(xué)與感官評(píng)價(jià)等方面的研究． 主持國(guó)家級(jí)和省部級(jí)等各類項(xiàng)目30余項(xiàng), 以第一或通信作者發(fā)表相關(guān)學(xué)術(shù)論文70余篇, 獨(dú)立譯著、 副主編和參編教材8部, 以第一發(fā)明人獲得授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利4件; 獲國(guó)際學(xué)術(shù)“Best Researcher Award”獎(jiǎng)1項(xiàng)、 獲神農(nóng)中華農(nóng)業(yè)科技獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)、 重慶市科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)、 中國(guó)茶葉學(xué)會(huì)“帝芙特杯”青年科技獎(jiǎng)、 重慶市高校中青年骨干教師、 首屆全國(guó)評(píng)茶員職業(yè)技能競(jìng)賽總決賽優(yōu)秀裁判員、 西南大學(xué)科研工作先進(jìn)個(gè)人、 優(yōu)秀教師等各類榮譽(yù); 兼任中國(guó)農(nóng)村專業(yè)技術(shù)協(xié)會(huì)茶葉專委會(huì)秘書長(zhǎng)、 重慶市茶葉學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)、 重慶市營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)、 重慶市第三屆食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)審評(píng)委員會(huì)委員、 重慶市第一屆林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)委員、 重慶市第一屆青年科技領(lǐng)軍人才協(xié)會(huì)會(huì)員、 精制川茶四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)委員會(huì)委員、 茶葉標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)委員會(huì)委員、 《茶葉科學(xué)》和《中國(guó)茶葉》編委等．

葉片是植物的主要營(yíng)養(yǎng)器官, 是植物光合作用和蒸騰作用等生理代謝過(guò)程的重要場(chǎng)所． 葉片的發(fā)育過(guò)程是非常關(guān)鍵的植物形態(tài)建成過(guò)程, 受生理和外界環(huán)境等多種因素的綜合調(diào)控[1]． 葉片的發(fā)育過(guò)程主要包括葉片的發(fā)生、 葉片的形態(tài)特征決定和葉片的極性分化3個(gè)重要過(guò)程． 葉片的極性分化包括即背-腹軸(近-遠(yuǎn)軸極性)、 基-頂軸和中-側(cè)軸3個(gè)方向的分化[2-3], 其中近-遠(yuǎn)軸極性的建立能夠決定葉片背腹特征的形成, 形成葉片背側(cè)的海綿組織和腹側(cè)的柵欄組織的分化, 使得葉片由輻射對(duì)稱變成兩側(cè)對(duì)稱, 這是葉片發(fā)育的關(guān)鍵過(guò)程之一, 是保障葉片正常進(jìn)行光合作用、 蒸騰作用等重要生理過(guò)程的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[4-6]．

多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互協(xié)調(diào)表達(dá)形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 共同調(diào)控了葉片的近-遠(yuǎn)軸極性的建立過(guò)程, 其中HD-ZIP基因家族(包括REVOLUTA、PHAVOLUTA和PHABULOSA基因)、ARP基因家族(ASYMMETRICLEAVES1(AS1)、 玉米R(shí)OUGHSHEATH(RS2)及金魚草PHAN基因)和LOB(AS2)基因家族是主要參與葉片近軸極性建立的重要基因[7];KANADI基因家族(KAN1-4)和ARF基因家族(ARF3和ARF4)主要參與葉片的遠(yuǎn)軸極性建成[8]; 小RNA包括的siRNAs、 ta-siRNAs和miRNAs等也可通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)參與植物葉片的近-遠(yuǎn)軸極性的建成[9-10]．ASYMMETRICLEAVES1(AS1)和ASYMMETRICLEAVES2(AS2)互為等位基因, 編碼形成的AS1與AS2蛋白均可形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體參與葉片近-遠(yuǎn)軸極性的建成過(guò)程． AS1屬于ARP蛋白家族, 是一類MYB-R2R3型轉(zhuǎn)錄因子, 是參與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白[11]; AS2蛋白屬于植物特有的Lateral Organ Boundaries(LOB)蛋白家族, 在植物中廣泛存在, 能夠直接或間接參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程[12-14]．AS1和AS2基因的突變會(huì)導(dǎo)致葉片褶皺、 葉片不對(duì)稱和葉邊緣下卷等葉片缺陷的癥狀;AS1和AS2基因的超表達(dá)則會(huì)使葉片出現(xiàn)葉片邊緣上卷和葉片收縮等近似近軸化極性的特征[15]．AS1和AS2基因家族還參與調(diào)控植物的其它發(fā)育和抗逆境脅迫等代謝調(diào)控過(guò)程, 如莖的發(fā)育、 維管束和根的發(fā)育等過(guò)程[16-17]．

茶樹是我國(guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物, 葉片的發(fā)育及形態(tài)建成直接影響茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量, 所以研究茶樹葉片發(fā)育調(diào)控機(jī)制對(duì)提高茶樹經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要意義． 目前, 茶樹中AS1和AS2基因還未被關(guān)注, 本研究從茶樹基因組中鑒定克隆了CsAS1和CsAS2基因, 對(duì)其進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析, 可為進(jìn)一步研究CsAS1和CsAS2基因家族在茶樹葉片發(fā)育過(guò)程中的重要功能提供借鑒．

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹材料為2年生“福鼎大白茶” (Camelliasinensiscv. Fuding Dabaicha), 種植于重慶市北碚區(qū)天生路2號(hào)西南大學(xué)校內(nèi)教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地． 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)下載于“舒茶早”茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TPIA(http: //tpdb.shengxin.ren/)． 用于表達(dá)分析的茶樹不同組織材料, 包括成熟葉、 莖、 根及花等, 取于 “福鼎大白茶”, 液氮速凍后, 存儲(chǔ)于-80 ℃超低溫冰箱． 試驗(yàn)試劑和材料主要包括: 植物RNA提取試劑盒(產(chǎn)于天根生化科技(北京)有限公司)、 反轉(zhuǎn)錄酶及配套緩沖液(產(chǎn)于寶生物工程(大連)有限公司)、 Taq DNA 聚合酶、 pMD18-T、 DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、 DNA切膠回收試劑盒(產(chǎn)于上海源葉生物科技有限公司)和熒光定量PCR試劑超混液(產(chǎn)于重慶鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)． 引物合成和基因測(cè)序由生工生物工程(上海)有限公司完成．

1.2 茶樹CsAS1和CsAS2基因的克隆

按照植物RNA提取試劑盒說(shuō)明書的步驟, 分別提取“福鼎大白茶”茶樹的根、 莖材料的總RNA, 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行mRNA的反轉(zhuǎn)錄, 合成不同組織的cDNA, 作為基因克隆及表達(dá)分析的材料． 克隆茶樹AS1和AS2基因的PCR擴(kuò)增體系為: 94 ℃, 5 min; 94 ℃, 30 s; 50 ℃, 30 s; 72 ℃, 2 min; 35個(gè)循環(huán)后, 72 ℃, 5 min, DNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收測(cè)序和分析． 所有使用的引物詳情見表1．

表1 熒光定量PCR引物信息表

1.3 茶樹CsAS1和CsAS2蛋白的生物信息學(xué)分析

分別從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR和JGI-Phytozome 13 數(shù)據(jù)庫(kù)(https: //phytozome-next.jgi.doe.gov/blast-search)中下載CsAS基因在9種不同植物中的核苷酸和蛋白質(zhì)序列, 利用TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)工具進(jìn)行Blast搜索, 鑒定茶樹CsAS基因． 并進(jìn)行了編碼蛋白的分子量、 等電點(diǎn)的蛋白性質(zhì)分析; 分別采用SOPM和SWISS-MODEL軟件分析了CsAS1和CsAS2蛋白的結(jié)構(gòu); 用Clustal X1.8, MEGA 4.0和DNAMAN等生物學(xué)軟件分析了茶樹CsAS蛋白的氨基酸序列, 采用鄰接法(Neighbor-joining)方法構(gòu)建進(jìn)化樹, Bootstrap參數(shù)為1 000, 其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值; 分別通過(guò)MEME、 Plant-mPLoc和Plantcare軟件分析了茶樹CsAS蛋白的保守基序(基序數(shù)量設(shè)為5)、 亞細(xì)胞定位和CsAS基因上游2 kb啟動(dòng)子序列中含有的順式作用元件; 利用模式植物擬南芥ATAS蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò), 在數(shù)據(jù)庫(kù)STRING中建立了茶樹CsAS蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)．

1.4 茶樹AS受體蛋白基因的表達(dá)分析

本研究從TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了茶樹葉片中CsAS基因在鹽、 冷、 干旱和MeJA等不同非生物逆境脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的數(shù)據(jù), 并利用Tbtools繪制熱圖． 為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)量, 本研究還采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)CsAS基因在茶樹5個(gè)組織部位(花、 芽、 成熟葉、 莖、 根)、 不同發(fā)育時(shí)期的芽、 不同葉位的葉片及在外源GA3、 IAA處理?xiàng)l件下的表達(dá)量． 本研究采用水培的方式對(duì)2年生“福鼎大白茶”扦插苗進(jìn)行外源激素脅迫處理, 分析了CsAS基因的表達(dá)特異性, 每盆24株, 在盆中加入配制好的響應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)液, 加氣泵通入氧氣, 每7天更換一次營(yíng)養(yǎng)液, MS培養(yǎng)30天后進(jìn)行MS/(100 mg/L)GA3和MS/(50 mg/L)IAA脅迫處理, 分別在24 h和48 h后取樣, 液氮固樣, -80 ℃保存． 采用艾德萊植物RNA提取試劑盒進(jìn)行樣本的總RNA的提取, 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板, 用于CsAS基因表達(dá)特異性分析． 用Primer 3軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1), 內(nèi)標(biāo)基因?yàn)椴铇浼?dòng)蛋白基因Actin1． 10 μL Real-Time PCR 反應(yīng)體系為: SsoFast EvaGreen Supermix 5 μL, 濃度為10 μmol/L的上下游引物各 0.20 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 3.5 μL, 充分混勻, 于Bio-Rad CFX 96實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增分析, 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃, 10 s; 95 ℃, 5 s; 55 ℃, 5 s, 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)． 每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次試驗(yàn)重復(fù), 采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果, 分別使用SPSS和ORIGIN軟件進(jìn)行差異顯著性分析和作圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹AS蛋白基因的鑒定及克隆

本研究利用模式植物中AS蛋白的核苷酸和氨基酸序列信息, 在茶樹基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行本地Blast搜索鑒定, 共獲得茶樹中同源的AS1和AS2蛋白基因各1個(gè):CsAS1和CsAS2． 如圖1, 本研究分別以“福鼎大白茶”茶樹莖和根為材料獲得的cDNA為模板, 克隆獲得了CsAS1和CsAS2基因, 長(zhǎng)度分別為1 033 bp和688 bp． 如表2,CsAS1和CsAS2基因分別編碼344 aa和229 aa長(zhǎng)度的氨基酸殘基, 分子量分別為39.45和25.33; 蛋白的等電點(diǎn)分別為10.04和7.36; 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析顯示2個(gè)AS蛋白均定位于細(xì)胞核, 這與其它植物中的AS蛋白的定位模式一致． 如圖2, 染色體定位分析結(jié)果顯示2個(gè)CsAS基因分別定位于茶樹的4號(hào)和10號(hào)染色體上．

表2 茶樹CsAS1和CsAS2蛋白的理化性質(zhì)

圖1 CsAS1和CsAS2基因的PCR擴(kuò)增

圖2 CsAS1和CsAS2基因的染色體定位

2.2 茶樹CsAS1和CsAS2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示(圖3), 茶樹CsAS1和CsAS2蛋白與其它植物中的該類蛋白氨基酸序列具有高度的保守性, 茶樹CsAS1蛋白與葡萄VitAS蛋白的親緣關(guān)系最近, 而CsAS2與水稻OsAS蛋白的親緣關(guān)系最近． 保守基序分析顯示(圖4a), AS1和AS2蛋白在不同植物中均具有高度的保守性, 不同植物CsAS1和CsAS2蛋白序列中保守基序的種類和數(shù)量也高度一致, 但CsAS1和CsAS2蛋白之間差異比較明顯, 分屬于不同的亞家族． 基因結(jié)構(gòu)分析顯示(圖4b),CsAS1基因只有1個(gè)外顯子,CsAS2基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子． CsAS1蛋白屬于ARP蛋白家族, CsAS2蛋白屬于LOB蛋白家族． 多種植物的AS1和AS2蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果顯示(圖5), 不同植物中AS1蛋白序列一致性為64.91%, AS2蛋白的一致性為53.69%; CsAS1蛋白氨基酸序列中含有2個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ; CsAS2蛋白氨基酸序列中含有LOB家族蛋白所共有的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域CX2CX6CX3C(ZF基序)、 GAS(Gly-Ala-Ser)、 負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)二聚體的類亮氨酸拉鏈的螺旋基序LX6LX3LX6L、 ICG和LZL等特殊結(jié)構(gòu)域, 均與該蛋白家族的功能有直接關(guān)系． 茶樹的CsAS1和CsAS2蛋白均為典型的AS蛋白, 推測(cè)可能與已經(jīng)報(bào)道的其它植物AS蛋白具有相似生物學(xué)功能．

At為擬南芥, Os為水稻, Zm為玉米, VIT為葡萄, Potri為楊樹, Poman為小黑樹, Gobar為陸地棉, orange為柑橘, evm為咖啡, CsAS為茶樹．圖3 植物中AS蛋白的進(jìn)化樹分析

(a) AS蛋白保守基序分析, 不同顏色的方塊和數(shù)字代表不同的保守基序, 不同顏色的字母代表保守基序的氨基酸序列信息． (b) AS基因結(jié)構(gòu)分析． AtAS為擬南芥AS蛋白, CsAS為茶樹AS蛋白．圖4 植物中AS蛋白家族的保守基序分析及CsAS基因結(jié)構(gòu)分析

At為擬南芥, Os為水稻, VIT為葡萄, Cs為茶樹．圖5 茶樹CsAS與其它植物AS氨基酸序列比對(duì)

2.3 茶樹CsAS1和CsAS2蛋白的二、 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白空間結(jié)構(gòu)分析顯示(圖6a), 茶樹CsAS1蛋白中α-螺旋所占的比例最大, 為56.69%, 其次是自由卷曲, 為28.78%, 延長(zhǎng)鏈和β-轉(zhuǎn)角所占的比例小; CsAS2蛋白中α-螺旋和自由卷曲所占的比例均較大, 分別為36.68%和36.24%, 延長(zhǎng)鏈和β-轉(zhuǎn)角所占的比例較?。?分別以已知蛋白MYB21和LOB蛋白為模板, 用SWISS-MODEL軟件構(gòu)建的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示, CsAS1和CsAS2蛋白中均含有大量的α-螺旋和自由卷曲, 但三級(jí)空間結(jié)構(gòu)不同, 差異較大, 均與同源的擬南芥AS蛋白結(jié)構(gòu)相似． 由此可推測(cè)CsAS蛋白與模式植物中的AS蛋白具有相同的生物學(xué)功能．

2.4 茶樹CsAS1和CsAS2基因的時(shí)空表達(dá)特異性分析

為明確CsAS1和CsAS2蛋白在茶樹葉片和其它器官生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控功能, 本研究利用Real-time PCR的方法分析了CsAS1和CsAS2基因在茶樹根、 莖、 葉、 花和芽等不同組織部位的表達(dá)特異性．

如圖7a,CsAS1基因在茶樹不同組織中均有表達(dá), 但在芽中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組織; 而CsAS2基因在茶樹不同組織中均有表達(dá), 但在根中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組織． 如圖7b,CsAS1和CsAS2基因在芽的不同發(fā)育時(shí)期中隨著成熟度的增加均有先增加再減少的趨勢(shì)． 如圖7c,CsAS1基因在葉片不同發(fā)育時(shí)期中隨著成熟度的增加而減少, 在幼嫩芽葉中的表達(dá)高于第一、 二和三葉;CsAS2基因在葉片不同時(shí)期發(fā)育先降低, 再恢復(fù)到在芽中的表達(dá)水平, 在幼嫩芽葉和第三葉中的表達(dá)高于第一、 二和三葉． 由此推測(cè)茶樹CsAS1和CsAS2基因在茶樹不同組織和葉片不同發(fā)育階段發(fā)揮著不同的功能．

圖6 茶樹CsAS1和CsAS2蛋白結(jié)構(gòu)分析

(a) CsAS1和CsAS2基因在茶樹不同組織的表達(dá)分析． (b) CsAS1和CsAS2基因在茶樹芽不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析． (c) CsAS1和CsAS2基因在茶樹不同葉位的表達(dá)分析． 小寫字母不同表示p<0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖7 CsAS1和CsAS2基因的表達(dá)分析

2.5 茶樹CsAS1和CsAS2基因啟動(dòng)子片段順式作用元件分析

為分析茶樹CsAS1和CsAS2基因的潛在功能, 通過(guò)Plant Care軟件分析了CsAS1和CsAS2基因的啟動(dòng)子序列． 結(jié)果如圖8所示,CsAS1和CsAS2基因啟動(dòng)子序列中均含有多個(gè)順?lè)醋釉? 主要包括脅迫響應(yīng)元件(MYB、 MYC)、 光響應(yīng)元件、 植物激素響應(yīng)元件和發(fā)育調(diào)控元件． 其中脅迫響應(yīng)元件占比比較大, 植物激素響應(yīng)元件也有較多存在． 由以推測(cè)CsAS1和CsAS2基因可參與茶樹對(duì)非生物逆境和植物激素的響應(yīng)過(guò)程． 為了驗(yàn)證這兩個(gè)基因能夠參與植物激素的調(diào)控過(guò)程, 本研究分析了CsAS1和CsAS2基因在外源激素脅迫條件下的表達(dá)特性, 如圖8d所示, 在50 mg/L IAA處理24 h和48 h后,CsAS1基因受到誘導(dǎo), 有較大程度的表達(dá)量增加,CsAS2基因在24 h時(shí)減少, 48 h時(shí)增加; 在100 mg/L GA3處理24 h和48 h后,CsAS1和CsAS2基因均受到誘導(dǎo), 但CsAS1增加的表達(dá)量相對(duì)比較少,CsAS2基因的表達(dá)被明顯誘導(dǎo), 增加量接近50倍．

(a-c) 啟動(dòng)子元件分析． (d) CsAS1和CsAS2基因在不同外源GA3、 IAA激素處理脅迫下的表達(dá)分析． 小寫字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖8 茶樹CsAS1和CsAS2基因啟動(dòng)子片段順式作用元件分析

2.6 茶樹CsAS1和CsAS2基因響應(yīng)非生物逆境脅迫的表達(dá)特異性分析

本研究利用TPIA已經(jīng)公布的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了CsAS1和CsAS2基因在NaCl、 干旱、 MeJA和冷等不同非生物逆境脅迫條件下的表達(dá)分析． 如圖9所示,CsAS1基因可以被NaCl、 干旱、 MeJA和冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 其中被冷馴化后表達(dá)上調(diào), 而在其余3種脅迫后表達(dá)下調(diào);CsAS2基因僅在干旱處理72 h和NaCl處理24 h后被誘導(dǎo), 且表達(dá)上調(diào)． 由以上結(jié)果可以推測(cè), 茶樹CsAS1和CsAS2基因可能參與茶樹應(yīng)對(duì)環(huán)境中鹽、 干旱和冷等非生物逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程．

利用PEG模擬干旱脅迫; 圖例中正數(shù)表示上調(diào)表達(dá), 負(fù)數(shù)表示下調(diào)表達(dá); 圖下方為不同脅迫處理及其對(duì)照．圖9 茶樹CsAS1和CsAS2基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)分析

2.7 茶樹CsAS1和CsAS2的蛋白關(guān)聯(lián)蛋白分析

利用擬南芥同源的AtAS蛋白進(jìn)行了CsAS蛋白的關(guān)聯(lián)蛋白預(yù)測(cè)分析, 如圖10所示, 茶樹CsAS1和CsAS2的蛋白與多種葉片形態(tài)建成相關(guān)的蛋白間均存在關(guān)聯(lián)性, 其中包含KNAT1(knotted1-like homeobox protein), KNAT2(knotted2-like homeobox protein), KAN(Homeodomain-like superfamily protein), LOB(Lateral organ boundaries domain family protein), TCP14(TEOSINTE BRANCHED、 cycloidea and PCF 14), TCP15(TEOSINTE BRANCHED、 cycloidea and PCF 15), AFO(Plant-specific transcription factor YABBY family protein)和HDA6(Histone deacetylase 6)等蛋白． 由此可推測(cè), CsAS1和CsAS2蛋白是可以參與茶樹葉片形態(tài)建成過(guò)程的．

圖10 茶樹CsAS1和CsAS2相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

茶樹是葉用經(jīng)濟(jì)作物, 其葉片的形態(tài)建成也存在形態(tài)的多樣性, 例如, 葉片的大小、 厚度和顏色等． 其中茶樹葉片的內(nèi)卷和外卷等與葉片極性建立相關(guān)的現(xiàn)象同樣也經(jīng)常被觀察到． 但目前茶樹分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)依舊在葉片的次生代謝和顏色調(diào)控上, 對(duì)于葉片發(fā)育的關(guān)注度還不夠． 眾多轉(zhuǎn)錄因子參與了葉片發(fā)育和形態(tài)建成過(guò)程[18, 19]． AS蛋白已經(jīng)在多種植物中被報(bào)道參與葉片的近-遠(yuǎn)軸極性建立過(guò)程,AS基因的變異或缺失會(huì)導(dǎo)致葉片的卷曲、 外翻或者內(nèi)卷等葉片去極性特征[8, 20-21]． 本研究從“福鼎大白茶”茶樹中克隆獲得了2個(gè)與葉片發(fā)育有著緊密相關(guān)性的基因:CsAS1和CsAS2, 其分子量、 等電點(diǎn)和編碼區(qū)長(zhǎng)度與已經(jīng)報(bào)道的AS蛋白具有高度的同源性, 且均定位于細(xì)胞核(表2)． 茶樹CsAS1和CsAS2的氨基酸序列與水稻和葡萄等植物的該類蛋白高度相似, 分別含有植物ARP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ)和LOB家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(半胱氨酸結(jié)構(gòu)域CX2CX6CX3C即ZF基序, GAS, ICG和LZL區(qū)域, 負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)二聚體的類亮氨酸拉鏈的螺旋基序LX6LX3LX6L)等特殊功能結(jié)構(gòu)域． 其中, ZF基序是AS2蛋白結(jié)合DNA活性所必需的, ICG和LZL區(qū)域是AS2核定位的必要區(qū)域[22-24], 說(shuō)明茶樹CsAS1和CsAS2蛋白具備發(fā)揮該類蛋白功能的基礎(chǔ)序列元件．CsAS1和CsAS2基因在葉片不同發(fā)育時(shí)期中隨著成熟度的增加而減少, 在幼嫩芽葉中的表達(dá)量高于第一、 二和三葉;CsAS1和CsAS2基因在芽的不同發(fā)育時(shí)期中隨著成熟度的增加均有先增加后減少的趨勢(shì)． 以上結(jié)果可說(shuō)明CsAS1和CsAS2蛋白具備其它植物中報(bào)道的AS1和AS2蛋白的相似功能, 可參與葉片發(fā)育中的近-遠(yuǎn)軸極性建立的調(diào)控．

AS轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族還被報(bào)道廣泛參與調(diào)控植物除葉片外的其它組織器官的發(fā)育和非生物逆境脅迫響應(yīng)等調(diào)控過(guò)程, 例如擬南芥的AS1蛋白可以負(fù)調(diào)控ABA代謝途徑[25, 26], 馬鈴薯AS2蛋白有利于提高其應(yīng)對(duì)高鹽、 干旱、 高溫、 低溫等非生物脅迫的能力[16]． 啟動(dòng)子順式作用元件和表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), 茶樹CsAS1和CsAS2基因的啟動(dòng)子序列中均含有多個(gè)逆境脅迫響應(yīng)元件, 茶樹CsAS1基因的表達(dá)會(huì)被NaCl、 MeJA和干旱脅迫抑制, 可能存在負(fù)調(diào)控關(guān)系; 在冷脅迫條件下,CsAS1基因的表達(dá)被上調(diào), 是正調(diào)控的關(guān)系;CsAS2基因的表達(dá)可被干旱脅迫和NaCl處理誘導(dǎo)． 茶樹CsAS2基因在根中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其它組織, 與玉米LOB家族蛋白R(shí)TCS和RTCL基因類似, 可能能夠參與側(cè)根及卷須根的形成調(diào)控過(guò)程[27]．

AS蛋白發(fā)揮生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控功能是通過(guò)與其它蛋白形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)而完成的． 茶樹CsAS1和CsAS2的蛋白可與多種葉片形態(tài)建成相關(guān)的蛋白間存在關(guān)聯(lián)性, 通過(guò)與KNAT1、 KNAT2和KAN蛋白的相互作用參與葉片的起始過(guò)程[28], 和LOB蛋白家族中的其它成員相互作用, 參與葉片的極性建立過(guò)程, 參與TCP14、 TCP15、 AFO和HDA6等共同調(diào)控葉片及其它器官的發(fā)育過(guò)程[29-31]． 后續(xù)本研究團(tuán)隊(duì)將以CsAS1和CsAS2蛋白為中心, 通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的研究, 解析茶樹葉片等重要組織器官的發(fā)育過(guò)程, 探究CsAS1和CsAS2蛋白在茶樹生命周期不同發(fā)育階段的詳細(xì)功能．

4 結(jié)論

本論文從“福鼎大白茶”茶樹莖和根中鑒定和克隆獲得茶樹CsAS1和CsAS2基因． 生物信息學(xué)分析顯示, 茶樹CsAS1和CsAS2蛋白具有高度的保守性;CsAS1和CsAS2基因的表達(dá)在茶樹不同組織和不同發(fā)育階段存在時(shí)空特異性, 且受到外源植物激素IAA和GA3及其它非生物逆境的影響． 根據(jù)本研究結(jié)果推斷CsAS1和CsAS2基因可廣泛參與茶樹葉片的形態(tài)建成和非生物逆境的脅迫響應(yīng)過(guò)程, 為深入分析茶樹CsAS1和CsAS2蛋白的功能提供了一定參考．