李維峰， 何鵬搏， 陳紅梅， 夭瑩云， 李晶萍，于龍鳳， 曲鵬， 葛宇， 譚萬(wàn)忠

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650210；3. 滇西科技師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 臨滄 677000

蓮霧Syzygiumsamarangense又名洋蒲桃, 為桃金娘科Myrtaceae常綠喬木植物, 原產(chǎn)地為馬來(lái)西亞及印度, 在東南亞各國(guó)廣泛栽培, 于17世紀(jì)后期被引入中國(guó)臺(tái)灣省, 20世紀(jì)30年代引入中國(guó)內(nèi)地, 現(xiàn)在海南、 廣東、 廣西、 福建和云南等地作為水果和綠化植物廣泛種植, 面積大且產(chǎn)量高, 每公頃可收獲果實(shí)達(dá)13 t以上[1-2], 屬經(jīng)濟(jì)效益高、 生態(tài)效益好且發(fā)展前景廣闊的熱帶常綠果樹(shù)[3-10]． 然而, 蓮霧果樹(shù)的病害較多, 影響果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì), 已報(bào)道的主要有炭疽病、 果腐病、 斑點(diǎn)病、 煤污病和藻斑病等10多種重要病害[11-15]． 炭疽病是蓮霧植株上普遍發(fā)生和為害嚴(yán)重的病害, 在我國(guó)蓮霧栽培省區(qū)都有發(fā)生, 主要為害葉片和儲(chǔ)藏期果實(shí)． 李楊秀等[16]采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法將廣西蓮霧炭疽病的病原菌鑒定為果生刺盤孢菌Colletotrichumfructicola; Obaidi等[17]鑒定了馬來(lái)西亞蓮霧炭疽病的病原菌為盤長(zhǎng)孢刺盤孢C.gloeosporioides; Udayanga等[18]鑒定了引起泰國(guó)蓮霧炭疽病的病原菌為蓮霧刺盤孢C.syzygicola． 可見(jiàn), 不同地區(qū)蓮霧炭疽病病原菌均為刺盤孢屬Colletotrichum真菌, 但具有物種多樣性．

2021年, 課題組在調(diào)查云南省普洱市和西雙版納州熱帶果樹(shù)病蟲(chóng)害時(shí), 發(fā)現(xiàn)蓮霧炭疽病在各區(qū)、 縣果園均嚴(yán)重發(fā)生, 但該地炭疽病病原菌種類迄今尚無(wú)報(bào)道． 本研究從該地區(qū)不同果園采集炭疽病病葉進(jìn)行病原菌分離純化、 柯赫氏證病試驗(yàn)、 形態(tài)學(xué)和ITS(Internal Jranscribed Spacer)序列分子鑒定, 以明確該地炭疽病菌歸屬, 為病害的有效控制提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 蓮霧葉樣品

于2021年6月從普洱市、 7月從西雙版納州不同區(qū)、 縣采集具有典型炭疽病癥狀的葉片標(biāo)本, 帶回實(shí)驗(yàn)室用于病原菌分離和純化． 另外, 在普洱市思茅區(qū)倚象鎮(zhèn)果園采集健康蓮霧葉片, 用于菌株致病性測(cè)試．

1.1.2 培養(yǎng)基

采用北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA), 使用時(shí)按1 000 mL培養(yǎng)液中含37 g PDA粉制作平板和斜面培養(yǎng)基, 用于菌種的分離純化和保存．

1.1.3 引物

采用通用引物ITS1/ITS2擴(kuò)增病菌的基因組rDNA-ITS片段, 引物序列為(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’/(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[19], 由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成．

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

對(duì)兩個(gè)地區(qū)采集的病樣, 分別采用病斑組織培養(yǎng)分離法分離和純化病原真菌菌株處理[20]． 消毒過(guò)的染病組織置于直徑15 cm的培養(yǎng)皿平板上, 放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h, 從菌落邊緣挑取尖端菌絲到新的PDA平板培養(yǎng)基中央, 在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)96 h, 得到純化培養(yǎng)菌株, 再將其轉(zhuǎn)移到PDA試管斜面上培養(yǎng)48 h后, 于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 病害癥狀記述

結(jié)合野外調(diào)查和后續(xù)室內(nèi)接種試驗(yàn)觀察, 記述不同時(shí)期的病害癥狀變化．

1.2.3 致病性試驗(yàn)

按照柯赫氏證病法則進(jìn)行試驗(yàn)[21-22]． 在每個(gè)15 cm培養(yǎng)皿底部墊一層濕濾紙, 濾紙上放入1片健康蓮霧葉片, 用針尖輕輕刺傷葉片兩側(cè)適當(dāng)位點(diǎn)后分別接種3個(gè)約4×4 mm的菌餅, 然后蓋上培養(yǎng)皿, 在室溫(16～26 ℃)和避光下保濕(RH>90%)48 h后, 移去菌絲餅, 再繼續(xù)培養(yǎng)20 d, 每天定時(shí)觀察記錄發(fā)病情況． 每個(gè)菌株接種處理5片葉(重復(fù))． 取接種10 d后的病斑做再分離和菌株純化, 每個(gè)菌株分離5個(gè)病斑． 將得到的新分離純化菌株與原接種菌株做形態(tài)比較, 確定其為同一性．

1.2.4 病原菌形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

經(jīng)柯赫氏證病試驗(yàn)確認(rèn)為病原菌的菌株, 在PDA平板培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)至14 d, 在此期間定時(shí)觀察拍攝記錄菌落的形態(tài); 待病菌產(chǎn)孢后制作臨時(shí)玻片, 在顯微鏡下觀察拍攝分生孢子形態(tài), 并在放大400×狀態(tài)下測(cè)量50個(gè)孢子的長(zhǎng)和寬． 根據(jù)病菌主要形態(tài)學(xué)特征參考有關(guān)文獻(xiàn)[23-30]進(jìn)行初步鑒定．

1.2.5 病原菌的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定

收取PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的病菌菌絲體, 用CTAB法[31]分別提取DNA, 用ITS1/ITS4引物對(duì)作為PCR擴(kuò)增引物． PCR反應(yīng)體系(25 μL)配方為: 2×EasyTaq PCR SuperMix 12 μL、 引物各1 μL、 模板DNA 1 μL、 ddH2O 10 μL． PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為: 94 ℃預(yù)變性5 min; (94 ℃變性1 min, 55 ℃退火1 min)循環(huán)32次; 最后72 ℃延伸4 min． PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司回收和測(cè)序． 將獲得的病原菌rDNA-ITS序列上傳到美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào), 在線(https: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行Blast-n比對(duì), 并用MEGA6.0軟件[32]做系統(tǒng)演化樹(shù)進(jìn)一步分析, 從GenBank中已注冊(cè)的刺盤孢屬選擇下載12種真菌菌株的ITS序列和1種非刺盤孢屬真菌菌株ITS序列作為外源菌株繪制系統(tǒng)演化樹(shù), 結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果、 演化樹(shù)聚集分枝位置及其置信限確定新分離菌株的分類學(xué)種名．

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

該病害在蓮霧果園發(fā)病普遍, 植株中、 下部老葉片受害較重． 發(fā)病初期葉片上形成黃色斑紋, 或形成一些淺黃白色、 圓形或橢圓形的小病斑． 典型病斑呈橢圓形或不規(guī)則形, 中央?yún)^(qū)域灰白色, 周圍有褐色帶、 黃色帶暈圈, 中部壞死組織干枯后脫落形成穿孔(圖1a,b,c)． 在適合的條件下, 葉片上的病斑擴(kuò)大、 聯(lián)合形成不規(guī)則較大病斑或大面積枯死(圖1b,d,e)． 發(fā)病嚴(yán)重時(shí), 病樹(shù)可見(jiàn)枯枝和落葉, 生長(zhǎng)發(fā)育明顯受阻, 結(jié)果少、 果小或不結(jié)果． 病菌在果實(shí)成熟期侵染, 果實(shí)表面形成不同大小的圓形、 淺褐色至黑褐色病斑, 均勻地輪紋狀下陷, 越是病斑中央下陷越深． 病斑周緣為淡灰黃色帶, 若遇陰雨天氣或空氣濕度較高時(shí), 病部果肉腐爛, 可引起大量落果, 病果在運(yùn)輸途中或儲(chǔ)藏期間很容易發(fā)生腐爛變質(zhì)．

2.2 菌株的致病性

通過(guò)分離純化, 從普洱市和西雙版納州采集的病樣中各得到3個(gè)純化真菌菌株(分別編碼為L(zhǎng)WTJ 1,2,3和LB4,5,6), 其中分離自普洱市的LWTJ2和來(lái)自西雙版納州的LB4基本相同, 它們與刺盤孢屬真菌的菌落形態(tài)近似． 用LWTJ2和LB4離體接種健康蓮霧葉片后癥狀相似, 48 h后菌餅下葉片組織呈水浸狀壞死, 6 d后形成近圓形病斑, 其中央呈灰白色, 周圍黑褐色, 褐色壞死部分外圍有黃色暈圈, 與田間自然發(fā)病葉片上典型病斑相似． 在5片葉(重復(fù))上6個(gè)接種點(diǎn)全部發(fā)病, 發(fā)病率為100%． 接種10 d后, 切取病斑組織10塊進(jìn)行再分離純化, 均成功分離到與原接種菌株菌落形態(tài)相同的純培養(yǎng)物(圖2d)． 在相同條件下, 其他4個(gè)菌株菌落與刺盤孢屬真菌菌落有差異, 接種后未引起蓮霧葉片發(fā)病, 為污染的雜菌． 因此, 根據(jù)柯赫氏證病法則確定LWTJ2和LB4菌株為蓮霧炭疽病病原菌．

a. &b. 葉片上的典型病斑; c.& d. 擴(kuò)展的葉斑或枯斑; e. 室內(nèi)接種6 d后的葉片病斑．圖1 蓮霧炭疽病自然和接種發(fā)病葉片癥狀

2.3 病菌的形態(tài)特征與鑒定

LWTJ2和LB4兩個(gè)致病菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征基本相同． 在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d后, 菌落呈圓形, 粉白或鵝黃色, 邊緣光滑齊整, 表面呈絨毛狀, 氣生菌絲發(fā)達(dá)(圖2a); 后期(12 d)菌落顏色稍加深, 中央?yún)^(qū)域變成灰黑色, 并產(chǎn)生大量蛋黃色分生孢子團(tuán)(圖2b)． 在顯微鏡下觀察, 菌絲透明, 分隔, 呈近直角分枝． 分生孢子無(wú)色, 呈長(zhǎng)橢圓形或柱狀, 兩端盾圓, 絕大多數(shù)細(xì)胞中間部位有一個(gè)油球, 孢子大小為9.8～18.0(平均13.9±2.1) μm × 4.5～6.0(平均5.5 ±1.0) μm(圖2c)． 在實(shí)驗(yàn)室較長(zhǎng)期地培養(yǎng)和多次采集蓮霧果園自然發(fā)病葉片觀察, 均未發(fā)現(xiàn)病菌有性時(shí)期的子囊殼及子囊孢子． 病菌的這些形態(tài)特征, 與Li等[33]描述的暹羅刺盤孢Colletotrichumsiamense非常接近．

圖2 引起蓮霧炭疽病菌菌落和分生孢子形態(tài)特征

2.4 病菌的分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得LWTJ2和LB4兩個(gè)菌株的基因組rDNA-ITS片段長(zhǎng)度均為545 bp, 在NCBI GenBank的登錄號(hào)分別為OL413460和OL963924． Blast-n分析表明這兩個(gè)菌株ITS序列的最大相似率為100%, 它們與C.siamenseWZ-365菌株ITS(Acc. No. MN856443)的最大相似率和覆蓋率分別為99.08%和99%, 與C.kahawae(卡哈瓦刺盤孢)的覆蓋率和最大相似率分別為98%和99.63%(圖3a); 用MEGA6.0軟件[32]繪制LWTJ2和LB4兩個(gè)菌株ITS與刺盤孢屬12種真菌菌株ITS的系統(tǒng)演化樹(shù)圖(圖3b)． 圖3b顯示, 兩個(gè)菌株與C.siamenseWZ-365菌株的ITS(Acc. No. MN856443)聚集在同一末端分枝上; LWTJ2和LB4為同一種真菌(置信度為100%), 二者與暹羅刺盤孢為同一物種(置信度為96%)． 因此, 綜合形態(tài)特征、 ITS序列Blast-n和演化樹(shù)分析確定, 引起蓮霧炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢(C.siamense)．

a. LB4和LWTJ2兩個(gè)菌株的ITS序列Blast-n對(duì)比分析結(jié)果, 從NCBI GenBank在線分析結(jié)果表截圖; b. 基于rDNA-ITS序列的LB4和LWTJ2與近緣真菌菌株的系統(tǒng)演化樹(shù), 用MEGA6.0軟件繪制, 圖3b中顯示LWTJ2和LB4(粗體字顯示的蓮霧炭疽病菌菌株)與暹羅刺盤孢菌株(WZ-365)處于演化樹(shù)的同一末端分枝上． 相關(guān)ITS序列從NCBI GenBank下載而得, 括號(hào)內(nèi)為各菌株ITS序列在NCBI GenBank的登錄號(hào)．圖3 蓮霧炭疽病菌的分子鑒定

3 討論與結(jié)論

蓮霧是一種被廣泛栽培的重要果樹(shù), 目前文獻(xiàn)記載的蓮霧病害有近60種, 其中炭疽病是發(fā)生最普遍和危害最嚴(yán)重的一種病害． 蓮霧炭疽病是由刺盤孢屬Colletotrichum真菌侵染所致, 現(xiàn)已報(bào)道的有盤長(zhǎng)孢刺盤孢C.gloeosporioides、 果生刺盤孢C.fructicola和蓮霧刺盤C.syzygicola[16-18]． 本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法確定, 發(fā)生在我國(guó)云南南部地區(qū)的蓮霧炭疽病由暹羅刺盤孢C.siamense引起, 這與其他國(guó)家和地區(qū)報(bào)道的刺盤孢種類不同, 屬于蓮霧炭疽病的一種新病原真菌．

暹羅刺盤孢異名有C.melancaulon,C.dianesei,C.communis,C.endomangiferae,C.hymencallidis及C.jasmini-sambac, 這些異名來(lái)源于不同地區(qū)的寄主植物[34-38], 均為該真菌的無(wú)性型(Anamotph), 在早期的分類系統(tǒng)中屬于真菌界, 半知菌門, 腔孢綱, 黑盤菌目, 黑盤孢科, 刺盤孢屬． 其有性型(Teleomorph)文獻(xiàn)尚無(wú)報(bào)道, 本研究在室內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)培養(yǎng)及自然發(fā)病果樹(shù)上多次觀察尋找均未發(fā)現(xiàn)子囊殼和子囊孢子, 說(shuō)明該真菌可能很難產(chǎn)生有性型． 但依據(jù)Sutton[39]文獻(xiàn)記載, 刺盤孢屬中很多種類的有性型均屬于小叢赤殼屬Glomerella, 由此推論暹羅刺盤孢的有性型應(yīng)該是暹羅小叢殼Glomerellasiamense, 在較新的分類系統(tǒng)中屬于真核域、 真菌界, 雙核菌亞界, 子囊菌門, 子囊菌綱, 小叢赤殼目, 小叢赤殼科, 小叢赤殼屬． 此推論將對(duì)今后研究或探索暹羅刺盤孢生活史中的有性型階段和病害循環(huán)等具有重要參考作用．

暹羅刺盤孢是一種寄主范圍很廣的植物病原真菌, 現(xiàn)有文獻(xiàn)記載約有60多種炭疽病是由暹羅刺盤孢侵染所致, 國(guó)外報(bào)道的有菠蘿蜜、 枇杷、 無(wú)花果、 薄荷、 胡椒、 迷迭香、 草莓、 辣椒、 柑桔、 火龍果、 蘆薈、 柿子和美國(guó)山核桃等作物的炭疽病[40-45]; 我國(guó)發(fā)生的有柑橘、 蘋果、 核桃、 番木瓜、 荔枝、 胡椒、 假蘋婆、 白蘭花、 鱷梨和越南槐等[46-52]． 本研究鑒定的蓮霧炭疽病也由暹羅刺盤孢所致, 表明蓮霧是暹羅刺盤孢的一個(gè)新寄主, 在其他蓮霧種植國(guó)家和地區(qū)未曾見(jiàn)報(bào)道．

據(jù)課題組2021年的調(diào)查結(jié)果, 蓮霧炭疽病在云南省普洱市和西雙版納州各地果園發(fā)生普遍, 危害較重, 明顯降低了蓮霧果實(shí)產(chǎn)量、 品質(zhì)及果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益． 本研究較詳細(xì)地觀察描述了蓮霧炭疽病的癥狀及其病原的形態(tài)特征, 鑒定確認(rèn)了病原菌為暹羅刺盤孢, 不僅對(duì)該病害田間診斷識(shí)別、 監(jiān)測(cè)和防控有重要的實(shí)用參考價(jià)值, 而且豐富了蓮霧炭疽病病原菌的多樣性． 然而, 不同植物炭疽病寄主、 病原菌及其發(fā)生環(huán)境條件各有不同, 它們的流行規(guī)律必然存在較大差異, 因此對(duì)它們的防控技術(shù)措施也會(huì)有所不同． 為了減輕或避免蓮霧危害和經(jīng)濟(jì)損失, 促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展, 對(duì)于蓮霧炭疽病流行規(guī)律、 病原菌生物學(xué)特性及其綜合防控技術(shù)等方面仍有待進(jìn)一步研究．

本研究較詳細(xì)地觀察記載了滇南地區(qū)蓮霧炭疽病癥狀及其病原菌形態(tài)特征, 根據(jù)形態(tài)學(xué)與rDNA-ITS序列的Blast-n對(duì)比和演化樹(shù)分析鑒定獲得的LWTJ2和LB4兩個(gè)菌株均屬于暹羅刺盤孢C.siamense, 這是蓮霧炭疽病的一種新病原真菌． 研究結(jié)果進(jìn)一步證明了蓮霧炭疽病病原菌的多樣性, 也為該病害的診斷監(jiān)測(cè)和有效控制提供了科學(xué)依據(jù)．