施軍瓊， 向蓉， 何書(shū)晗， 歐陽(yáng)添，趙璐， 紀(jì)璐璐， 楊宋琪， 吳忠興

西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市三峽庫(kù)區(qū)植物生態(tài)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715

三峽庫(kù)區(qū)175 m 正常蓄水運(yùn)行后, 從上游至下游, 水位升高約3～100 m, 導(dǎo)致了支流水文情勢(shì)發(fā)生明顯變化, 如水面變寬、 水流減緩、 泥沙含量降低等． 流速減緩, 使得支流回水區(qū)成為湖泊型水體[1-4]． 此外, 由于氮、 磷的輸入, 支流富營(yíng)養(yǎng)化趨勢(shì)凸顯[5-6], 因此, 部分支流庫(kù)灣藻類(lèi)水華現(xiàn)象已成為淡水生態(tài)學(xué)和水環(huán)境科學(xué)研究的焦點(diǎn)及水質(zhì)管理部門(mén)關(guān)注的重點(diǎn)[7-8]．

甲藻是一類(lèi)能夠形成孢囊(休眠細(xì)胞)的藻類(lèi), 其休眠性孢囊在適宜的環(huán)境條件下會(huì)迅速啟動(dòng)萌發(fā)機(jī)制, 并在短時(shí)間內(nèi)大量增殖, 甚至形成水華現(xiàn)象; 當(dāng)環(huán)境條件不適宜時(shí), 又會(huì)大量形成孢囊, 在底泥沉積, 躲避不利環(huán)境[9], 因此, 甲藻孢囊不僅為甲藻水華暴發(fā)提供“種源”, 而且在甲藻水華的發(fā)生和消亡中也具有重要作用[10]． 2004年, 三峽庫(kù)區(qū)首次報(bào)道了擬多甲藻水華[11]． 緊接著, 庫(kù)首第一支流香溪河也發(fā)生擬多甲藻水華[12]． 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì), 高嵐河、 汝溪河、 彭溪河、 童莊河、 大寧河、 梅溪河、 小江等多條支流回水區(qū)均發(fā)生了該藻類(lèi)水華, 且一些支流發(fā)生頻度較高[8, 13-15]． 擬多甲藻水華在支流回水區(qū)中發(fā)生范圍最廣、 持續(xù)時(shí)間最久[8]． 研究已表明, 水體理化[16-17]、 水文氣象[12, 18]、 浮游植物、 原生動(dòng)物和浮游細(xì)菌群落多樣性及豐度[19]、 水體熱分層與擬多甲藻的種群變化和水華形成具有較大影響[20], 但這些研究主要集中在水體擬多甲藻水華的影響因素, 卻很少關(guān)注底泥中擬多甲藻的變化, 因而并不能全面揭示庫(kù)區(qū)擬多甲藻水華的生消過(guò)程．

目前, 對(duì)底泥甲藻進(jìn)行定性定量分析中, 普遍使用的沉積物處理方法為篩網(wǎng)過(guò)濾法和孢粉學(xué)處理法[21]． 篩網(wǎng)過(guò)濾難免造成損失, 甲藻孢囊又容易與大量的有機(jī)碎屑混雜在一起, 從而導(dǎo)致分析結(jié)果不能準(zhǔn)確反映沉積物中孢囊的分布狀況, 因此, 為了準(zhǔn)確了解擬多甲藻在底泥中的分布情況, 本文建立了基于qPCR定量分析三峽庫(kù)區(qū)汝溪河支流回水區(qū)底泥中甲藻動(dòng)態(tài)變化的方法, 并對(duì)其影響因子進(jìn)行分析, 以期為庫(kù)區(qū)甲藻水華防治工作提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐．

1 材料與方法

1.1 樣點(diǎn)設(shè)置

汝溪河發(fā)源于萬(wàn)州區(qū)分水鎮(zhèn), 流經(jīng)培文鎮(zhèn), 在梁平區(qū)境內(nèi)和汝溪河另一支流交匯, 經(jīng)忠縣汝溪鎮(zhèn), 最后經(jīng)涂井鄉(xiāng)匯入長(zhǎng)江． 全流域面積720 km2, 主河道長(zhǎng)54.5 km, 在忠縣境內(nèi)流域面積272.9 km2, 主河道長(zhǎng)25.4 km． 多年平均徑流總量達(dá)1.49×109km3, 是三峽庫(kù)區(qū)重要的一級(jí)支流之一． 水庫(kù)蓄水后, 長(zhǎng)江水淹沒(méi)至涂井鄉(xiāng)以上, 形成了長(zhǎng)達(dá)15 km的汝溪河回水區(qū)． 汝溪河支流每年3-5月在涂井鄉(xiāng)至龍灘大橋回水區(qū)常發(fā)生嚴(yán)重的甲藻水華[22]． 為了監(jiān)測(cè)汝溪河底泥甲藻的動(dòng)態(tài)特征, 在汝溪河涂井鄉(xiāng)至龍灘大橋設(shè)置3個(gè)斷面(T1-T3), 如圖1．

圖1 研究斷面分布圖

1.2 底泥采集及DNA提取

2016年3月至2017年2月的每個(gè)月在每個(gè)斷面的左(S1)、 中(S2)和右(S3)3個(gè)樣點(diǎn)利用柱狀采泥器進(jìn)行底泥采集． 采集后測(cè)定溫度并裝入自封袋密閉避光保存, 當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?沉積物經(jīng)過(guò)風(fēng)干后, 取泥土樣2 g于10 mL離心管中, 采取CTAB法提取DNA[23]． 干燥后的DNA溶解于50 μL ddH2O中, 測(cè)定吸光度A260和A280, 若A260/A280在 1.8～2.0 之間則置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆? 否則需要進(jìn)一步純化或重新提取．

1.3 PCR擴(kuò)增及甲藻系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

用于PCR擴(kuò)增28S rDNA基因的引物為DinFif (5′GCATATAAGTAMGYGGWGG3′)和DinRir (5′CCGTGTTTCAAGACGGGTC3′)[24]． 50 μL 反應(yīng)體系: DNA模板為2 μL, 其余組分按Taq酶(TaKaRa, 日本)說(shuō)明書(shū)的量添加． PCR 反應(yīng)結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 目的片段回收純化后進(jìn)行測(cè)序(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司), 獲得816 bp序列． 采用Clustal方法進(jìn)行比對(duì)和序列間的遺傳變異度分析(Vector10軟件, Invitrogen, 美國(guó))． 利用獲得的816 bp序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì), 通過(guò)MEGA5構(gòu)建最大似然樹(shù)(Maximum likelihood, ML)． 通過(guò)自展法分析系統(tǒng)樹(shù)的穩(wěn)定性和一致性, 其中各節(jié)點(diǎn)代表支的統(tǒng)計(jì)置信度以50%為標(biāo)準(zhǔn)[25]．

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.4.1 定量PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)1.3獲得的序列, 采用Vector 10軟件進(jìn)行qPCR特異性的引物設(shè)計(jì), 引物序列為uPr1(5′GTCAAATTGAGCCGCAAGCTCC3′)和uPf1(5′ATCCGCCTTCGGCACCGTAT3′), 產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為128 bp, 引物由上海生工合成．

1.4.2 質(zhì)粒制備

利用挑取的原位水體擬多甲藻作為藻株, 以引物uPf1和uPr1擴(kuò)增的基因片段回收后通過(guò)TA克隆連接到pMD19-T載體(Takara, 日本), 轉(zhuǎn)化感受態(tài)Escherichiacoli細(xì)胞DH5α, 挑取陽(yáng)性克隆過(guò)夜培養(yǎng), 質(zhì)粒的提取采用質(zhì)粒小提試劑盒(天根, 北京)． 選取擴(kuò)增片段上沒(méi)有而載體也僅單一酶切位點(diǎn)的DNA內(nèi)切酶Hind III(Fermentas, 美國(guó))進(jìn)行酶切, 線(xiàn)性化的質(zhì)粒電泳回收后溶于ddH2O制備成標(biāo)準(zhǔn)品原液, 其質(zhì)粒濃度用NanoDrop 1000進(jìn)行測(cè)定(Thermo, 美國(guó)), 并根據(jù)公式換算成質(zhì)粒的拷貝數(shù):

Cn=Pc×10-9×6.02×1023/PL×660

式中,Cn為拷貝數(shù)(個(gè)/L),Pc為質(zhì)粒濃度(ng/mL),PL為質(zhì)粒長(zhǎng)度(bp)． 將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原液做7個(gè)10 倍的梯度稀釋, 為qPCR的標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品, -80 ℃保存．

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

7個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板, 進(jìn)行SYBR Green I qPCR反應(yīng)(ABI7500, 美國(guó))． 每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù), 并加陰性對(duì)照． 反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 s, 54 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸40 s, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸5 min． 為了建立基因拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與qPCR反應(yīng)循環(huán)閾值(熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),Ct)之間的線(xiàn)性回歸方程, 以qPCR反應(yīng)中相應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo), 模板DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)．

1.4.4 樣品檢測(cè)

環(huán)境樣品中DNA經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋, 作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng), 將Ct代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得此樣品的拷貝數(shù)及其原始環(huán)境中的濃度．

1.5 水體理化及底泥營(yíng)養(yǎng)鹽的測(cè)定

水體的水溫(WT)、 pH、 電導(dǎo)率(EC)、 溶解氧(DO)、 氧化還原電位(ORP)、 濁度(Tur)和水下光照(PAR)現(xiàn)場(chǎng)通過(guò)多參數(shù)水質(zhì)分析儀(DS5X, HACH, 美國(guó))進(jìn)行測(cè)定． 將采集的底泥烘干后磨碎, 利用CHNS-O元素分析儀(Hanau, 德國(guó))測(cè)定底泥中C和N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)． P, Ca和K質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用硝酸、 雙氧水和微波消解儀(Milestone ETHOIS, 意大利)消解后, 用電感耦合等離子光譜儀(ICP-OES, 德國(guó))測(cè)定．

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

汝溪河每季度甲藻拷貝數(shù)量與環(huán)境因子的關(guān)系采用SPSS 22.0軟件(IBM, 美國(guó))進(jìn)行多元逐步回歸分析． 甲藻拷貝數(shù)和環(huán)境因子通過(guò)Origin 8.0(Originlab, 美國(guó))進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析, 并進(jìn)行F檢驗(yàn)．

2 結(jié)果與分析

2.1 汝溪河甲藻系統(tǒng)發(fā)育

利用汝溪河甲藻和GenBank藻類(lèi)的28S rDNA序列構(gòu)建甲藻系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 以最大似然法(ML)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖2． 結(jié)果表明, 汝溪河優(yōu)勢(shì)甲藻與倪氏擬多甲藻(Peridiniopsisniei)關(guān)系最近, 節(jié)點(diǎn)支持率為94%, 且與東湖倪氏擬多甲藻(P.nieiHM596555)和三峽庫(kù)區(qū)香溪河倪氏擬多甲藻(P.nieiFJ 767867)相似度分別為100.0%和99.7%． 該藻細(xì)胞卵圓形, 背腹略扁平, 上殼錐形, 下殼略呈錐形且有兩根短刺或無(wú)刺, 縱溝寬, 上下板片大小幾乎相等且板片表面具不規(guī)則乳突狀, 具紅色眼點(diǎn), 藻細(xì)胞長(zhǎng)約30 μm, 寬約25 μm． 形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)果均表明, 汝溪河甲藻為倪氏擬多甲藻．

節(jié)點(diǎn)處數(shù)字顯示高于 50%的節(jié)點(diǎn)支持率．圖2 28S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)的qPCR引物的特異性, 利用樣品DNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增, 結(jié)果顯示溶解曲線(xiàn)峰值單一, 說(shuō)明該引物對(duì)野外樣品DNA特異性較好． 克隆質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)qPCR后結(jié)果表明, 各梯度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增正常, 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=32.58-2.57x,R2=0.999 6, 其中y為Ct,x為模板DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值, 線(xiàn)性良好(圖3), 因此, 引物uPr1和uPf1的qPCR可以用于定量汝溪河水華甲藻的拷貝數(shù)．

2.3 底泥中擬多甲藻的動(dòng)態(tài)變化

汝溪河底泥樣品甲藻的動(dòng)態(tài)變化如圖4． 3個(gè)斷面T1, T2和T3的左(S1)、 中(S2)、 右(S3)樣點(diǎn)的底泥甲藻拷貝數(shù)均在3-5月間達(dá)到最大值． T1和 T3兩個(gè)斷面左樣點(diǎn)的每克干燥底泥甲藻基因拷貝數(shù)均在4月達(dá)到最大值, 為70.18×103個(gè)/g和42.77×103個(gè)/g; T2斷面的S1樣點(diǎn)拷貝數(shù)在5月達(dá)到最大值, 為68.60×103個(gè)/g． T1,T2兩個(gè)斷面的S2和S3樣點(diǎn)均在4月達(dá)到最大值, 而T3斷面的S2,S3樣點(diǎn)則是在9月和5月達(dá)最大值． 隨著季節(jié)的變化, 底泥甲藻拷貝數(shù)也有所不同, 其中春季3個(gè)采樣斷面S1, S2和S3的甲藻拷貝數(shù)顯著高于夏、 秋、 冬季(p<0.05)． 四分位結(jié)果表明(圖5), 春季拷貝數(shù)分布較零散, 但從平均值來(lái)看, 春季拷貝數(shù)均高于其他3個(gè)季節(jié); 夏、 秋和冬3個(gè)季節(jié)拷貝數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 且S1, S2和S3甲藻拷貝數(shù)春季差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)．

S1, S2和S3分別表示斷面的左、 中、 右樣點(diǎn)．圖4 汝溪河底泥中甲藻的動(dòng)態(tài)變化(2016-2017年)

圖5 汝溪河底泥中甲藻的季節(jié)變化

2.4 底泥擬多甲藻變化與環(huán)境因子的關(guān)系

各樣點(diǎn)底泥的溫度均為夏季最高, 保持在30 ℃左右, 其次為秋季、 春季和冬季． 春季底泥的溫度維持在20 ℃, 而冬季底泥溫度最低, 僅為14.5 ℃． 春季底泥總氮(TN)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高, 其他3個(gè)季節(jié)TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大． 對(duì)于總碳(TC)質(zhì)量分?jǐn)?shù), 各樣點(diǎn)春季底泥最高, 其次為冬季． 冬季總磷(TP)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高, 保持在0.5 mg/g左右, 其次為秋季、 夏季和春季, 春季保持在0.1 mg/g左右． Ca和K元素4個(gè)季節(jié)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義． 從全年來(lái)看(圖6), 底泥中甲藻拷貝數(shù)與泥溫、 TP和C/P呈線(xiàn)性負(fù)相關(guān)(p<0.05), 與N/P呈顯著正相關(guān)(p<0.05), 但與底泥中的TN, TC, Ca和K質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著相關(guān)性(p>0.05)． 對(duì)不同季節(jié)底泥甲藻拷貝數(shù)與環(huán)境因子進(jìn)行多元逐步回歸分析(表1), 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 甲藻拷貝數(shù)與環(huán)境因子之間逐步回歸相關(guān)系數(shù)均在0.7以上, 其中, 春季甲藻拷貝數(shù)與泥溫顯著相關(guān)(p<0.05), 相關(guān)系數(shù)為0.824; 夏季甲藻拷貝數(shù)的主要影響因子是Ca和K, 相關(guān)系數(shù)達(dá)0.997; 秋季和冬季的甲藻拷貝數(shù)分別與TN和TC顯著相關(guān), 相關(guān)系數(shù)為0.735和0.885．

表1 汝溪河不同季節(jié)底泥甲藻拷貝數(shù)與環(huán)境因子逐步回歸分析

圖6 底泥甲藻拷貝數(shù)與泥溫, TP, N/P和C/P的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 實(shí)時(shí)定量PCR在汝溪河底泥甲藻的應(yīng)用

孢囊是甲藻生活史中一個(gè)特殊且重要的階段, 在甲藻種群延續(xù)及水華形成過(guò)程中起著重要的作用[26-27]． 傳統(tǒng)的甲藻分類(lèi)在生態(tài)學(xué)研究中面臨著許多問(wèn)題: 一方面, 有賴(lài)于專(zhuān)業(yè)技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)性, 并且不同分類(lèi)學(xué)家的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)也不完全一致; 另一方面, 因環(huán)境的變化而變化的表型特征給鑒定帶來(lái)一定的困難[21]． 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, Scholin等[28]采用 LSU-rDNA 部分片段序列研究了亞歷山大藻(Alexamdrium)的系統(tǒng)進(jìn)化, 發(fā)現(xiàn)A.tamarense,A.catenella和A.fundyense等相似物種能被很好區(qū)分開(kāi)來(lái)． Lee等[29]通過(guò)LSU-rDNA 系統(tǒng)樹(shù)分析, 認(rèn)為韓國(guó)水域的Amphidiniummassartii能明顯與澳大利亞、 美國(guó)和加拿大等地區(qū)的藻株區(qū)別開(kāi)來(lái)． Saldarriaga等[30]和Zhang等[31]利用LSU和SSU rDNA序列分析了淡水甲藻發(fā)育系統(tǒng), 證實(shí)了該序列的甲藻系統(tǒng)發(fā)育． 蘇玉萍等[32]通過(guò)單細(xì)胞LSU-rDNA鑒定出福建省九龍江底泥中孢囊優(yōu)勢(shì)種為佩氏擬多甲藻(Peridiniopsispenardii)． 本研究基于NCBI(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)甲藻及汝溪河甲藻的LSU-rDNA序列, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 結(jié)果表明汝溪河的甲藻和擬多甲藻屬的多個(gè)物種相似性很高, 其中與香溪河和東湖采集的倪氏擬多甲藻相似度分別達(dá)到99.7%和100.0%, 因此, 從分子水平上支持了汝溪河的甲藻為倪氏擬多甲藻．

3.2 環(huán)境因子對(duì)底泥甲藻動(dòng)態(tài)變化的影響

關(guān)于擬多甲藻水華的研究已經(jīng)被廣泛報(bào)道, 如三峽庫(kù)區(qū)香溪河[14, 33]、 三峽庫(kù)區(qū)童莊河[34]、 貴州省黔東南州三板溪水庫(kù)[35]、 武漢東湖[12]等． 這些研究發(fā)現(xiàn)擬多甲藻水華與TP, TN, NO3-N, N/P, 水體分層等多種因素相關(guān)． Pollingher等[36-37]認(rèn)為甲藻孢囊形成于水華末期, 其他研究表明孢囊形成則發(fā)生于整個(gè)水華期間[38]． 本研究經(jīng)過(guò)熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn), 汝溪河底泥中每個(gè)月均存在甲藻孢囊, 1月、 2月和6-12月底泥甲藻拷貝數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 在3-5月不同樣點(diǎn)底泥甲藻均達(dá)到最大值, 即春季甲藻拷貝數(shù)最高(圖4和圖5), 支持了Pollingher等[36-37]的結(jié)論, 即水華末期(5月末)可能是甲藻孢囊形成的重要時(shí)期, 而春季應(yīng)該是甲藻孢囊大量增殖的高峰期．

海底沉積物溫度、 生產(chǎn)力也是甲藻孢囊分布的主要影響因素[39-41]． 邊歸國(guó)等[17]研究發(fā)現(xiàn), 甲藻可在10～28 ℃大量繁殖． 本研究發(fā)現(xiàn)隨著底泥溫度的增加, 底泥甲藻呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)(圖6), 春季(3-5月)底泥溫度基本維持在20 ℃左右, 因此, 春季底泥甲藻水體溫度適宜甲藻的大量繁殖． 通過(guò)逐步回歸分析(表1)發(fā)現(xiàn), 春季底泥甲藻拷貝數(shù)與底泥溫度呈顯著相關(guān), 夏、 秋季底泥溫度相對(duì)較高, 而冬季底泥溫度相對(duì)較低, 對(duì)甲藻繁殖均有一定的抑制作用[42]． 鄭磊等[43]研究表明, 大鵬灣表層活性磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)高但氮磷比較低的沉積物有利于甲藻孢囊的分布． 研究已發(fā)現(xiàn)甲藻水華通常出現(xiàn)在有機(jī)物質(zhì)豐富的水體中[33-34, 44-45], 特別是氮、 磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)豐富的水體中[12]． Sako等[46]發(fā)現(xiàn)N, P質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)甲藻孢囊的形成具有非常重要作用． 本研究發(fā)現(xiàn), 底泥甲藻變化與TP和C/P比呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 與N/P呈顯著正相關(guān), 且回歸分析發(fā)現(xiàn), 春、 夏和秋季甲藻拷貝數(shù)分別與泥溫、 Ca和K, 以及TN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著相關(guān)(圖6, 表1), 支持了鄭磊等[43]的研究, 即營(yíng)養(yǎng)鹽變化可能也是汝溪河擬多甲藻動(dòng)態(tài)變化的重要原因之一． 有研究也表明不同的磷濃度和磷形態(tài)對(duì)擬多甲藻生長(zhǎng)具有顯著的影響[47], 因此, 推測(cè)三峽庫(kù)區(qū)磷濃度及磷形態(tài)的變化對(duì)三峽庫(kù)區(qū)擬多甲藻水華形成具有重要作用． 此外, 逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)汝溪河底泥冬季甲藻的數(shù)量與TC質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)(表1), 說(shuō)明甲藻水華的發(fā)生在一定程度上與有機(jī)碳緊密相關(guān)． Stéphanie等[48]發(fā)現(xiàn)甲藻孢囊的分布與所研究區(qū)域的水動(dòng)力條件、 水文和選擇性沉積條件相關(guān), 因此, 要全面揭示三峽庫(kù)區(qū)底泥擬多甲藻的動(dòng)態(tài)變化及水華的形成機(jī)制, 需要多種因素綜合研究．

3.3 汝溪河甲藻水華的防控

擬多甲藻受光照、 溫度、 營(yíng)養(yǎng)鹽成分和其他環(huán)境條件的共同影響, 在三峽庫(kù)區(qū)表現(xiàn)出較為復(fù)雜的生活史． 研究表明, 擬多甲藻可以在較廣溫度范圍(10～28 ℃)下大量繁殖, 生長(zhǎng)的最佳溫度為13～15 ℃[17]． 甲藻生長(zhǎng)在水流速度較慢的水體中, 臨界流速為0.2 m/s, 當(dāng)水體流速大于臨界值時(shí), 甲藻的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[17]． 甲藻的部分種類(lèi)可以形成孢囊沉入水底, 在環(huán)境條件不利時(shí)渡過(guò)休眠期, 當(dāng)條件再次適合時(shí), 孢囊則會(huì)迅速萌發(fā), 進(jìn)入水體進(jìn)而急劇增加, 形成水華[9, 10]． 三峽庫(kù)區(qū)成庫(kù)蓄水后, 水庫(kù)回水區(qū)的流速變緩, 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沉降并大量積累, 支流甲藻水華持續(xù)發(fā)生, 并呈逐年加重趨勢(shì)[8, 14-15], 因此, 增加水庫(kù)回水區(qū)的流速, 可降低甲藻水華的發(fā)生[49]． 此外, 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)春、 夏、 秋、 冬季甲藻拷貝數(shù)與泥溫、 Ca和K, TN, TC顯著相關(guān), 表明庫(kù)區(qū)支流水體營(yíng)養(yǎng)增加會(huì)促進(jìn)甲藻水華的發(fā)生, 因此, 為了有效控制庫(kù)區(qū)甲藻水華, 可因地制宜建設(shè)農(nóng)業(yè)生態(tài)工程． 這樣有利于減少流域兩岸鄉(xiāng)鎮(zhèn)生活污水、 垃圾和畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便等污染物未達(dá)標(biāo)處理的排入, 減少有機(jī)物和含氮物質(zhì)的污染, 維護(hù)并保持完整的水生生態(tài)系統(tǒng)的健康, 增加水體的自?xún)裟芰Γ?/p>

4 結(jié)論

1) 基于汝溪河底泥沉積物甲藻的形態(tài)學(xué)特征及LSU-rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析, 此甲藻為倪氏擬多甲藻．

2) 引物uPr1和uPf1可用于汝溪河水華甲藻的實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=32.58-2.57x,R2=0.999 6．

3) 3個(gè)采樣斷面左、 中、 右樣點(diǎn)的底泥甲藻拷貝數(shù)均在3-5月達(dá)到最大值, 且春季底泥中甲藻拷貝數(shù)顯著高于夏、 秋和冬季．

4) 底泥中甲藻拷貝數(shù)與泥溫、 TP和C/P呈線(xiàn)性負(fù)相關(guān), 與N/P呈顯著正相關(guān), 其中, 泥溫與春季甲藻拷貝數(shù)顯著相關(guān), Ca和K顯著影響夏季甲藻拷貝數(shù), 而TN和TC則分別是秋、 冬季甲藻拷貝數(shù)的主要影響因子．