周雪飛，和燕玲，雒文軍，李春燕，段光玉，盧靜靜，丁安平，吳春艷，張輝，邵伍軍*

（1.浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺(tái)州 318000；2.臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

表阿霉素又名表柔比星，是臨床上重要的蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療[1-2]。臨床主要用于治療肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、惡性淋巴瘤等，其作用機(jī)制是直接作用于DNA 核堿對(duì)，干擾mRNA 的形成，抑制DNA 的合成和RNA的合成[3]。

14-溴-4'-表柔紅霉素為鹽酸表阿霉素合成工藝中脫羧酮反應(yīng)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)與鹽酸表阿霉素相似，含有基因毒性警示結(jié)構(gòu)，根據(jù)ICH M7[4]，其TTC 為1.5 μg/day，而鹽酸表阿霉素的最大日劑量為270 mg，因此14-溴-4'-表柔紅霉素的限度為5.6 mg/ kg。由于表阿霉素為發(fā)酵類藥物，其所含雜質(zhì)較多[5]，而14-溴-4'-表柔紅霉素的限度要求較低，普通高效液相色譜法專屬性及限度很難達(dá)到要求，而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，能夠滿足痕量毒性雜質(zhì)測(cè)定的要求[6]。本文采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（UPLC MS/MS），首次建立鹽酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔紅霉素的質(zhì)量控制方法，報(bào)告限度為0.50 mg/kg，可以快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用來(lái)定量測(cè)定鹽酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔紅霉素含量[7]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY I UPLC Class-TQ-S micro 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）。乙腈、甲醇均為市售色譜純；甲酸為市售質(zhì)譜純；Milli-Q Advantage A10 超純水儀（美國(guó)Merck 公司）；鹽酸表阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 對(duì)照品及樣品配制

樣品溶液：稱取鹽酸表阿霉素樣品25 mg 于25 mL 容量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，混勻。

14-溴-4'-表柔紅霉素線性儲(chǔ)備液：稱取14-溴-4'-表柔紅霉素對(duì)照品17.96 mg（含量76.2%）置于100 mL 容量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，混勻；移取上述溶液1.0 mL 于100 mL 容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻；移取上述溶液2.0 mL 于100 mL 容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻。

14-溴-4'-表柔紅霉素線性溶液配制：移取14-溴-4'-表柔紅霉素線性儲(chǔ)備液0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL 于5 個(gè)25 mL 容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻。

定量限：分別移取14-溴-4'-表柔紅霉素線性儲(chǔ)備液0.5 mL 6 份于6 個(gè)25 mL 容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻。

檢測(cè)限：取第一份定量限溶液，移取3.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Waters ACQUITY UPLC?BEH C182.1×100 mm，1.7 μm 色譜柱；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈，梯度洗脫程序：0～ 4.0 min，20%～ 80% B；4.0～ 5.0 min，80% B；5.0～ 5.1 min，80%～ 20% B；5.1～ 7.0 min，20% B。

質(zhì)譜條件：采用ESI+電噴霧離子源；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/hr；毛細(xì)管電壓3 kV；錐孔電壓 35 V；采集模式MRM。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 14-溴-4'-表柔紅霉素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Tab.1 Multiple reaction monitorning（MRM）parameters for detection of 4'-epi-14-bromo daunorubicin

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)中考察了甲酸銨-甲醇、甲酸-甲醇、氨水-甲醇、甲酸銨-乙腈、甲酸-乙腈、氨水-乙腈等流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，使用乙腈作有機(jī)相時(shí)，14-溴-4'-表柔紅霉素色譜峰峰型對(duì)稱性較好，峰更尖銳，且洗脫能力高于甲醇；使用甲酸溶液作無(wú)機(jī)相時(shí)，14-溴-4'-表柔紅霉素靈敏度高于氨水體系；使用甲酸銨緩沖鹽作無(wú)機(jī)相時(shí)，14-溴-4'-表柔紅霉素靈敏度與甲酸作無(wú)機(jī)相時(shí)相似?？紤]到甲酸銨緩沖鹽作無(wú)機(jī)相，對(duì)儀器的污染高于甲酸流動(dòng)相體系，本實(shí)驗(yàn)最終選擇0.1%甲酸水溶液和乙腈做流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫測(cè)定。

2.2 色譜柱選擇

14-溴-4'-表柔紅霉素結(jié)構(gòu)與鹽酸表阿霉素結(jié)構(gòu)相似，鹽酸表阿霉素USP 和EP 藥典推薦使用C1 色譜柱，本實(shí)驗(yàn)選擇粒徑更小、柱長(zhǎng)更短，分離度、柱效更高的超高效液相色譜柱Waters ACQUITY UPLC?BEH C182.1×100 mm，1.7 μm，梯度洗脫，總運(yùn)行時(shí)間為7 min，14-溴-4'-表柔紅霉素保留時(shí)間約2.8 min。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制500 ng/mL 的14-溴-4'-表柔紅霉素溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵直接注入質(zhì)譜儀，在全掃描模式（Scan）下選擇母離子606.10，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速等，使m/z606.10 的響應(yīng)值最高；在MRM 模式下選定母離子m/z606.10，優(yōu)化合適的碰撞能量（Collision energy，CE）選取606.10/320.10、606.10/459.10 兩個(gè)強(qiáng)度最大的子離子色譜峰，響應(yīng)最高的子離子606.10/320.10 作為定量離子，響應(yīng)次強(qiáng)的子離子606.10/459.10 作為定性離子。基于UPLC-MS/MS 分析的14-溴-4'-表柔紅霉素的MRM 圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 14-溴-4'-表柔紅霉素定量離子質(zhì)譜圖Fig.1 Quantitative ion chromatograms of 4'-epi-14-bromo daunorubicin

2.4 方法專屬性

采用本實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)空白溶劑、樣品溶液、定量限溶液及檢測(cè)限溶液進(jìn)行檢測(cè)，由圖2 可知，樣品溶液及空白溶液對(duì)14-溴-4'-表柔紅霉素檢測(cè)無(wú)干擾，專屬性良好。

圖2 專屬性疊加圖Fig.2 Overlay mass chromatograms of specifity

2.5 方法的線性、定量限及檢測(cè)限

采用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)各線性溶液、定量限溶液、檢測(cè)限溶液進(jìn)行檢測(cè)，以14-溴-4'-表柔紅霉素濃度（ng/mL）和其對(duì)應(yīng)的平均峰面積做線性回歸曲線，得到濃度與峰面積的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，本方法條件下14-溴-4'-表柔紅霉素的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9999；定量限溶液信噪比（S/N）均≥10，定量限濃度為1.002 2 ng/mL；檢測(cè)限溶液信噪比（S/N）均≥3，定量限濃度為0.300 7 ng/mL。

表2 14-溴-4'-表柔紅霉素線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab.2 Linear ranges，regression equations，correlation coeffients（r），limit of detection（LOD）and limit of quantitation（LOQ） of 4'-epi-14-bromo daunorubicin

2.6 精密度和準(zhǔn)確度

在0.56 μg/g、5.60 μg/g、7.84 μg/g 的添加濃度下，鹽酸表阿霉素樣品中精密度溶液做6 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確度溶液做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，14-溴-4'-表柔紅霉素的回收率均在99.0%～ 101.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2%，該方法精密度和準(zhǔn)確度良好。

表3 鹽酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔紅霉素精密度和準(zhǔn)確度Tab.3 Sample precision and accuracy of 4'-epi-14-bromo daunorubicin in epirubicin hydrochloride

2.7 樣品檢測(cè)

采用本研究建立的分析方法，對(duì)鹽酸表阿霉素3批原料藥樣品1060-D190701、1060-D190702、1060-D190703 進(jìn)行檢測(cè)，三批樣品中均未檢測(cè)到14-溴-4'-表柔紅霉素，即小于檢測(cè)限限度0.16 μg/g。

3 結(jié)論

本研究首次建立了超高效液相色譜-四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)鹽酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔紅霉素質(zhì)量進(jìn)行研究的方法，該方法采用Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行分離，以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫，質(zhì)譜采用正離子MRM 模式采集數(shù)據(jù)，流速為0.3 mL/min。經(jīng)驗(yàn)證14-溴-4'-表柔紅霉素的線性范圍為0.547 4～ 10.948 4 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，方法檢出限濃度為0.164 2 ng/ mL，定量限濃度為0.547 4 ng/mL，樣品加標(biāo)回收率在99.0%～ 101.3%。以上結(jié)果表明，該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏，可以準(zhǔn)確地測(cè)定鹽酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔紅霉素的含量，同時(shí)為控制鹽酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔紅霉素雜質(zhì)提供技術(shù)支撐。