徐娟，朱彩芳，曹旭

（1.鎮(zhèn)江華康大藥房連鎖有限公司，鎮(zhèn)江 212200；2.丹陽市中醫(yī)院，鎮(zhèn)江 212300；3.江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司，鎮(zhèn)江 212009）

龍船花始載于《新修本草》，又名賣子木《新修本草》、紅繡球《學(xué)圃雜疏》、五月花《生草藥性備要》、映山紅《本草求原》、大將軍《廣西中藥志》、仙丹花《云南中藥資源名錄》及百日紅《廣西藥用植物名錄》等，其為茜草科植物龍船花Ixora chinensis Lam的花，味甘、淡，性涼，具清熱涼血，散瘀止痛之功效，常用于高血壓、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、跌打損傷、瘡瘍癤腫的治療[1]。本品于農(nóng)歷五月盛開紅花，聚集如繡球，此時(shí)正是民間賽龍船之時(shí)，故稱龍船花。本品富含揮發(fā)油、黃酮類、三萜類、甾體類及有機(jī)酸類等成分[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，龍船花具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗炎、抗妊娠及抗突變等藥理作用[5-8]。本研究提取純化工藝制備龍船花提取物，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定提取物中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素4 種成分的含量，為龍船花的保健食品及新藥產(chǎn)品的開發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Waterse 高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮），微量移液器（北京大龍），超聲清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲），真空干燥機(jī)（上海儀昕），BAL 電子天平（賽多利斯）。京尼平苷酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111828-201805）、綠原酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-202119）、山奈酚對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110861-202013）、異鼠李素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110860-202012）。龍船花提取物（自制，批號(hào)：20220318、20220422、20220516），色譜純乙腈（霍尼韋爾），純化水（怡寶），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相組成0.15%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），按表1 進(jìn)行梯度洗脫；流速：1 mL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

2.2 提取物制備

稱取經(jīng)烘干的龍船花藥材適量，粉碎過50 目篩，加15 倍量水回流提取3 次，合并3 次提取液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.30，加藥用乙醇醇沉至含醇量達(dá)60%，靜置18 小時(shí)，離心取上清液，減壓濃縮至無醇味，采用D101 大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，依次用水、20%乙醇和40%乙醇洗脫以去除水溶性雜質(zhì)及部分醇溶性雜質(zhì)，用65%乙醇洗脫5 倍柱體積，收集洗脫液，濃縮干燥后即得。

2.3 樣品溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液配制

精密稱取京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素對(duì)照品適量于量瓶中，稀釋液（乙腈∶0.15%醋酸水溶液=80∶20）溶解并定容，配成含京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素分別為89.6 mg·L-1、236.9 mg·L-1、139.4 mg·L-1和177.8 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液制備

稱取龍船花提取物100 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，用3 mL 65%乙醇超聲溶解，稀釋液定容，搖勻后即得，過0.45 μm 濾膜后備用。

2.4 方法專屬性

按“2.1 色譜條件”下進(jìn)樣分析，得到混合對(duì)照品和龍船花提取物的HPLC 色譜圖，見圖1。在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的分離度良好，檢測(cè)無干擾。

圖1 混合對(duì)照品和龍船花提取物色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance and the extract of Ixora Chinensis Lam

2.5 線性關(guān)系考察

吸取“2.3.1 對(duì)照品溶液配制”中混合對(duì)照品適量，稀釋液定容得京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素濃度分別為2.24、4.48、8.96、22.4、44.8、89.6 mg · L-1、5.922 5、11.845、23.69、59.225、118.45、236.9 mg·L-1、3.485、6.97、13.94、34.85、69.7、139.4 mg·L-1和4.445、8.89、17.78、44.45、88.9、177.8 mg·L-1系列對(duì)照品溶液。按“2.1 色譜條件”進(jìn)樣并記錄峰面積，并以峰面積（A）對(duì)對(duì)照品溶液濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的回歸方程及線性范圍分別如表2所示。

表2 回歸方程及線性范圍Tab.2 Regression equation and linear range

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取含京尼平苷酸8.96 mg·L-1、綠原酸23.69 mg·L-1、山奈酚13.94 mg·L-1和異鼠李素17.78 mg·L-1的混合對(duì)照品10 μL，按“2.1 色譜條件”重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分的峰面積，結(jié)果京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素峰面積的RSD 分別為1.57%、1.28%、1.39%和1.61%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取龍船花提取物（20220318 批）6 份，每份約100 mg，精密稱定，按“2.3.2 供試品溶液的制備”配制供試品溶液，再按“2.1 色譜條件”下條件進(jìn)樣，記錄京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素分別的峰面積，計(jì)算各自的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素在龍船花提取物的含量分別 為1.968 mg·g-1、6.149 mg·g-1、3.625 mg·g-1和4.513 mg·g-1，各成分的RSD 值分別為1.74%、1.55%、1.36%和1.42%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一龍船花提取物供試品溶液，按“2.1色譜條件”分別在0，1，3，6，9，12，18，24，48 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素峰面積，結(jié)果京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素峰面積的RSD 分別為1.72%、1.80%、1.19 %和1.26%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的龍船花提取物（20220318 批）6 份，每份約50 mg，精密稱定，用3 mL 65%乙醇超聲溶解，再加入5 mL 京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素為22.4 mg·L-1、59.225 mg·L-1、34.85 mg·L-1和44.45 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液，于10 mL 容量瓶中，稀釋液稀釋定容。各樣品均經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，進(jìn)樣并記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD 值，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率結(jié)果Tab.3 Results of sample addition recovery

2.10 樣品測(cè)定

精密稱取3 個(gè)批次龍船花提取物，每批約100 mg，按“2.3.2 供試品溶液制備”制備供試品溶液，HPLC 進(jìn)樣分析，記錄峰面積，分別計(jì)算龍船花提取物中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的含量，如表4 所示。

表4 樣品中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的含量Tab.4 Content of geniposide，chlorogenic acid，kaempferol and isorhamnetin in the sample

3 討論

我們將京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素對(duì)照品分別經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果京尼平苷酸在266 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，綠原酸在273 nm 和326 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，山奈酚在254 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，異鼠李素在255 nm 和358 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比較，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm時(shí)，各色譜峰的峰型及分離度均良好。在選擇流動(dòng)相時(shí)，考察發(fā)現(xiàn)乙腈-水體系的基線相對(duì)平穩(wěn)、峰型較好，且能較好地分離京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素四種成分，同時(shí)加0.15%的甲酸調(diào)整峰型，使峰型更優(yōu)。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，龍船花提取物中綠原酸的含量最高（6.048 mg·g-1），其他3 種成分含量分別為京尼平苷酸（1.987 mg·g-1）、山奈酚（3.647 mg·g-1）和異鼠李素（4.442 mg·g-1）。長(zhǎng)期研究證明，綠原酸在抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等領(lǐng)域具有良好的藥理作用[9]，京尼平苷酸亦表現(xiàn)出優(yōu)良的抗炎作用[10]，同時(shí)山奈酚和異鼠李素均被學(xué)者證明有較好的抗炎止痛作用[11-12]。這些也從側(cè)面證明了龍船花自古就有記載的“清熱涼血，散瘀止痛”的功效的合理性。

本研究建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定龍船花提取物中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的含量，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于龍船花提取物的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。由于本實(shí)驗(yàn)中研究對(duì)象僅為大孔樹脂純化后的提取物，成分種類較藥材本身要精簡(jiǎn)，我們將進(jìn)一步擴(kuò)大基礎(chǔ)性研究，以期獲得更深入的發(fā) 現(xiàn)。