嚴(yán)卓彥，夏瑛瑛，崔 潔，李 彬

［舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院（國家海洋食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心），浙江 舟山 316012］

海風(fēng)藤是我國傳統(tǒng)的祛風(fēng)濕藥，自《名醫(yī)別錄》起，歷代本草著作均有記載，具有悠久的應(yīng)用歷史[1]。從1985 年版至2020 年版《中國藥典》[2]一直規(guī)定海風(fēng)藤為胡椒科植物風(fēng)藤Piper kadsura的干燥莖藤。但全國各地海風(fēng)藤同名異物情況較多，容易混淆，文獻(xiàn)記載的就有9 科19 種[3]。其中，山蒟最是頻繁地被當(dāng)作海風(fēng)藤使用?！陡＝ㄋ幬镏尽泛汀陡＝ㄖ参镏尽氛J(rèn)為福建海風(fēng)藤原植物主要是胡椒屬植物山蒟Piper hancei及風(fēng)藤[4]。孟靜等[5]通過查閱古代本草、醫(yī)籍，結(jié)合近現(xiàn)代文獻(xiàn)資料，對海風(fēng)藤藥材名稱、基原、產(chǎn)地及采收加工進(jìn)行考證，也證實(shí)宋代之后海風(fēng)藤藥材使用品種多為山蒟和風(fēng)藤。基于《中國藥典》中海風(fēng)藤原植物的規(guī)定與實(shí)際海風(fēng)藤所用原植物存在偏差，研究風(fēng)藤與其近緣物種山蒟之間的鑒別具有重要的實(shí)際價(jià)值。

山蒟為風(fēng)藤同科同屬植物，它的干燥莖藤以浙海風(fēng)藤為名收載于2015年版 《浙江省中藥炮制規(guī)范》[6]。在《浙江省中藥炮制規(guī)范》中，山蒟與風(fēng)藤的性狀描述基本一致，且鑒別、檢查、浸出物同2020 年版《中國藥典》中“海風(fēng)藤”項(xiàng)下規(guī)定。孫紹美等[7]對風(fēng)藤及其同屬植物的藥效學(xué)評價(jià)和急性毒性研究，也證實(shí)山蒟具有風(fēng)藤相同的藥理活性及相似的活性強(qiáng)度。在分子水平上，劉艷菊等[8]對風(fēng)藤和山蒟的基因組進(jìn)行RAPD 鑒別研究，結(jié)論是兩者的DNA 指紋圖譜具有一定的相似性，可以確定兩者的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相似。風(fēng)藤和山蒟在性狀、化學(xué)成分和基因組上的相似程度均較高。

本研究基于DNA 條形碼和簡單重復(fù)序列SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對來自全國各地的31 批風(fēng)藤和山蒟藥材植物和不同醫(yī)藥公司生產(chǎn)的藥材飲片進(jìn)行分析，旨在建立一種快速鑒別風(fēng)藤與山蒟的方法，為中藥材海風(fēng)藤的種質(zhì)資源鑒定提供一定的分子依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

研究的樣本信息見表1，其中有采摘自舟山的風(fēng)藤和山蒟植物8 株，由浙江省食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院的郭增喜主任藥師進(jìn)行形態(tài)鑒別。來自四川、湖北、安徽的海風(fēng)藤藥材5 批，其余17 批次樣品來自浙江省不同藥材公司生產(chǎn)的海風(fēng)藤和浙海風(fēng)藤飲片，所有藥材和飲片均由本院鄭國平主任中藥師進(jìn)行形態(tài)鑒別。

表1 31 批海風(fēng)藤山蒟樣品的編號及來源信息Tab.1 Serial number and source of 31 batches of materials

1.2 儀器和試劑

BioRad My Cycler 型PCR 擴(kuò)增儀、BioRad Mini-sub型水平電泳儀、Gel DocXR 型凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）；Termo nanodrop one 型微紫外/可見分光光度計(jì)、Thermo Lgend Micro 17 型離心機(jī) （美國熱電公司）。

2×CTAB 緩沖液：2% CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），1%β-巰基乙醇（使用時(shí)現(xiàn)加入），1.4 moL NaCl，20 mmoL EDTA，100 mmoL Tris-HCl （pH = 8.0）。

Taq Plus DNA 聚合酶（B600090)、10X PCR Buffer（B600017）、dNTP（B500056），均購自生工生物工程上海股份有限公司。

2 方法

2.1 DNA 提取

將植物原株的風(fēng)干根莖在75%酒精中浸泡1 min消毒后用無菌水沖洗，剪碎。將切片藥材直接放入75%酒精中浸泡1 min 消毒后用無菌水沖洗。然后液氮研磨至細(xì)小顆粒，收集樣本顆粒，在-70℃冰箱中保存。采用改進(jìn)CTAB 法[9]提取基因組。

2.2 DNA 條形碼方法建立

從NCBI 數(shù)據(jù)庫上下載風(fēng)藤和山蒟的成熟酶matK基因、petA-psbJ、核糖體間隔序列等已知序列進(jìn)行多序列比對，尋找差異位點(diǎn)附近的保守區(qū)域自行設(shè)計(jì)引物。psbA-trnH的引物直接參照2020 年版《中國藥典》（四部）“9107 中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”。引物合成委托上海生物工程公司進(jìn)行。PCR 引物序列及擴(kuò)增條件見表2。

表2 PCR 引物序列和擴(kuò)增條件Tab.2 PCR primer sequences and amplification conditions

PCR 產(chǎn)物委托上海生物工程公司進(jìn)行測通，測序引物為PCR 反應(yīng)引物。去除測序結(jié)果兩端信號弱或重疊峰區(qū)域。在MEGA11 軟件上采用Clustal W 方法比對分析序列，采用K2P 法，bootstrap = 1 000 參數(shù)繪制Neighbor-Joining（NJ 進(jìn)化樹）。

2.3 SSR 方法建立

2.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫里的風(fēng)藤（KT223569.1）和山蒟（MZ046380.1）葉綠體全基因組上的簡單重復(fù)序列差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測，再根據(jù)有無擴(kuò)增產(chǎn)物長度差異篩選出四對引物，見表3。

表3 4 對SSR 引物相關(guān)信息Tab.3 The information of 4 pairs of SSR primers

2.3.2 PCR 擴(kuò)增條件及分析方法 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA 模板1.0 μL（20 ～ 50 ng/μL）、5'端帶FAM 的上游引物0.5 μL（10 μmol/L）、下游引物0.5 μL（10 μmol/L）均由上海生物工程有限公司合成、dNTP（mix）0.5μL（10 μmol/L）、10×Taq buffer（with MgCl2）2.5 μL、Taq 酶0.2μL（5 U/μL）、ddH2O 加至25μL。

PCR 擴(kuò)增程序：預(yù)變性95℃ 5 min；變性94℃30 s，55℃退火30 s，延伸72℃30 s，循環(huán)34 次；72℃延伸 10 min。

PCR 產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳及熒光檢測（上海生物工程有限公司）。

數(shù)據(jù)分析：使用Genemapper軟件分析SSR多態(tài)性。

3 結(jié)果

3.1 PCR 擴(kuò)增與測序

petA-psbJ片段的信息位點(diǎn)最多，占比5.28%，psbA-trnH片段的信息位點(diǎn)和序列間差異最小幾乎為0。所有片段的平均序列差異均小于3%，見表4。

表4 DNA 條形碼的特征比較Tab.4 Feature comparison of DNA barcodes

3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹

從系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，psbA-trnH片段中所有樣品都與風(fēng)藤和山蒟聚為一支，因序列高度一致而無法對風(fēng)藤和山蒟進(jìn)行區(qū)分，見圖1。matK和petA-psbJ片段都將樣品F6、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7 與風(fēng)藤聚為一支，見圖2、圖3。而將除F2 外的其它樣品與山蒟聚為一支，自展率均大于64%。在ITS進(jìn)化樹中，所有樣品（除F2）都能與風(fēng)藤和山蒟聚為一大簇，但無法具體歸類到風(fēng)藤或者山蒟一支，見圖4。

圖1 基于樣品和NCBI 的風(fēng)藤、山蒟、石楠藤、黑胡椒，假蓽拔的部分psbA-trnH 序列的NJ 進(jìn)化樹Fig.1 NJ trees based on part of psbA-trnH sequences of samples and Piper kadsura, Piper hancei, Piper wallichii, Piper nigrum, Piper retrofractum from NCBI

圖2 基于樣品和NCBI 的海風(fēng)藤、山蒟、石楠藤、胡椒的部分matK 序列的NJ 進(jìn)化樹Fig.2 NJ trees based on part of matK sequences of samples and Piper kadsura, Piper hancei, Piper wallichii and Piper nigrum from NCBI

圖3 基于樣品和NCBI 的風(fēng)藤、山蒟的部分petA-psbJ 間隔序列的NJ 進(jìn)化樹Fig.3 NJ trees based on petA-psbJ sequences of samples and Piper kadsura, Piper hancei from NCBI

圖4 基于樣品和NCBI 的風(fēng)藤、山蒟、石楠藤、胡椒的ITS 間隔序列的NJ 進(jìn)化樹Fig.4 NJ trees based on ITS sequences of samples and Piper kadsura, Piper hancei, Piper wallichii and Piper nigrum from NCBI

3.3 基于葉綠體基因組的SSR 分子標(biāo)記技術(shù)

根據(jù)四對引物擴(kuò)增片段的大小，31 批樣品可分為三大類：F6、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7 這8 個(gè)樣品擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，為第一類；F2 樣品的擴(kuò)增片段與其它樣品差異均較大，為第二類；其余樣品擴(kuò)增片段大小一致，為第三類。通過對風(fēng)藤葉綠體基因組（NC_027941）和山蒟葉綠體基因組（MZ046380）進(jìn)行四對引物的擴(kuò)增模擬分析，結(jié)果顯示第一類樣品與風(fēng)藤一致，第三類樣品與山蒟一致，見表5。

表5 31 批樣品的SSR 擴(kuò)增片段長度及NCBI 數(shù)據(jù)庫里風(fēng)藤與山蒟葉綠體基因組的SSR 擴(kuò)增片段長度Tab.5 SSR amplification results of 31 samples and chloroplast genome of Piper kadsura and Piper hancei from NCBI

4 討論

SSR 也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1 ～ 6 bp，每個(gè)微衛(wèi)星DNA 的核心序列結(jié)構(gòu)相同，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。DNA 條形碼技術(shù)是利用基因組中一段或幾段公認(rèn)的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA 片段，以自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的分子鑒定技術(shù)，可以對物種實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡便的鑒定，不受發(fā)育階段、供試部位、環(huán)境條件等的限制，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法在這方面的不足[10]。在被子植物中，ITS區(qū)既有核苷酸序列的高度上基于30 份樣品和NCBI 的風(fēng)藤、山蒟的部分petA-psbJ間隔序列的NJ 進(jìn)化樹度變異性，又有長度上的保守性，已成為最廣泛的應(yīng)用于被子植物系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究的核基因標(biāo)記之一[11]。葉綠體基因組上編碼區(qū)的核酸替代速率相對較低，為植物深層系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了合適的途經(jīng)[12]。matK基因是葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)中進(jìn)化最快的基因之一[13]。而葉綠體基因間區(qū)如psbA-trnH等不參與轉(zhuǎn)錄翻譯過程，因而在功能上的限制較少，變異較自由，比編碼基因能夠提供更多的系統(tǒng)發(fā)育信息[12]。

本研究選擇葉綠體基因組中進(jìn)化較快的編碼基因matK和非編碼基因間區(qū)psbA-trnH、petA-psbJ，以及核基因組上變異最多的核糖體間隔序列ITS作為DNA 條形碼。四條DNA 條形碼中petA-psbJ具有最大的信息位點(diǎn)占比5.28%和第二大的平均序列差異0.023，ITS 的信息位點(diǎn)占比僅在1%左右，且平均序列差異0.027 主要來源于F2 與其它序列的較大差異，psbA-trnH和matK的信息位點(diǎn)占比和平均序列差異都接近于零。由此推測風(fēng)藤和山蒟的基因組序列差異較小，考慮到它們同樣高度相似的外形特征和藥理活性，建議將兩者同時(shí)作為中藥材海風(fēng)藤的種質(zhì)資源。

通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，條形碼matK和petA-psbJ都將舟山地區(qū)的植物原株與風(fēng)藤聚為一支，其它樣品（除F2）與山蒟聚為一支，且分類結(jié)果與SSR 分子標(biāo)記結(jié)果一致。按照該結(jié)果，市場上的大部分藥材（包括海風(fēng)藤對照藥材）都應(yīng)該屬于山蒟，而不是《中國藥典》中規(guī)定的風(fēng)藤。ITS條形碼也能將舟山地區(qū)的植物原株和海風(fēng)藤對照藥材與其它樣品區(qū)分開來，但所有樣品均未與風(fēng)藤或山蒟單獨(dú)聚為一支，只是與風(fēng)藤和山蒟共同聚為一大簇。顯示ITS對風(fēng)藤和山蒟的鑒別能力不如matK和petA-psbJ。F2 與其它樣品的DNA 條形碼和SSR 擴(kuò)增序列均有較大差異，在matK和ITS進(jìn)化樹中與石楠藤Piper wallichii距離較近，顯示其可能為風(fēng)藤和山蒟的近緣物種石楠藤。

5 結(jié)論

本研究通過DNA 條形碼和SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對23 批海風(fēng)藤浙海風(fēng)藤藥材及8 批風(fēng)藤山蒟植物原株進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示除樣品F2 外,其余樣品都能與風(fēng)藤或山蒟聚為一支。風(fēng)藤和山蒟的psbA-trnH序列高度一致而無法對兩者進(jìn)行鑒別，核糖體間隔序列ITS雖然也有一定的序列差異，但是較難鑒別風(fēng)藤和山蒟，matK和petA-psbJ基因片段的差異可以用來鑒別風(fēng)藤和山蒟，且鑒別結(jié)果與SSR 分子標(biāo)記結(jié)果一致。該方法為海風(fēng)藤的種質(zhì)資源鑒定提供了一定的分子依據(jù)。